小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定
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国家自然科学基金青年基金(81100532);江苏省“六大人才高峰”资助(2010WSN-56,2011-WS-033);江苏省“科教兴卫”工程医学重点人才培养资助(RC2011055);江苏省卫生厅面上项目(H2009907);江苏省“333高层次人才培养工程”项目(2011,2013)


Construction and identification of lentiviral vector of mice recombinant BTLA gene
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    目的:构建小鼠B-T淋巴细胞衰减子(BTLA) 基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响。方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为cDNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建pWPTS-mBTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T 细胞。RT-PCR及Western blot法检测BTLA mRNA和BTLA蛋白表达,50%组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度。通过感染pWPTS-mBTLA及pWPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响。结果:成功构建小鼠pWPTS-mBTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3 × 108 pfu/ml)。通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果,发现 4 d及8 d T细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P < 0.05),且这种抑制作用在0~8 d内具有时间依赖性。结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体。

    Abstract:

    Objective:To construct lentiviral vector of recombinant BTLA gene and investigate the effects on proliferation of mice splenic T lymphocytes after overexpression of BTLA gene mediated by lentiviral vector. Methods:The BTLA gene was cloned into the lentiviral expression vector (pWPTS-GFR),which was verified by reverse transcription and PCR. The lentiviral vector of recombinant BTLA gene was co-transfected into 293T cells. The morphological changes of 293T cells infected by lentiviral granules were observed by fluorescence microscope and lentivirus titer was tested by the method of TCID50. Results:pWPTS-mBTLA lentivrial vector at a titer of 1.3×108 pfu /mL was successfully constructed. Overexpression of BTLA gene in mice splenic T lymphocytes significantly suppressed the activation and proliferation of mice splenic T lymphocytes on day 4 and 8(P < 0.05). Conclusion:Outcomes of the inhibiting effect in activation and proliferation of mice splenic T lymphocytes induced by overexpression of BTLA gene indicated the successful construction of lentiviral vector of the recombinant BTLA gene.

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    引证文献
引用本文

王子杰,邓忠磊,杨雪健,韩志坚,陶 俊,鲁 佩,殷长军,谭若芸,顾 民.小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定[J].南京医科大学学报(自然科学版),2015,(2):173-177

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  • 收稿日期:2014-03-23
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  • 在线发布日期: 2015-02-13
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