Page 46 - 南京医科大学自然版
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第44卷第11期
               ·1512 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年11月


              pcDH⁃CD36⁃flag 质粒、miR⁃199a⁃5p⁃mimic 或 NC⁃                       表1 RT⁃qPCR引物序列
              mimic，其终浓度为50 nmol/L。转染8 h后更换含有                            Table 1 RT⁃qPCR primer sequences
              300 μmol/L 油酸（oleic acid，OA）的无血清培养基处                     Gene           Primers sequence（5′→3′）
              理24 h。使用普利莱组织细胞TAG 检测试剂盒，对                         36B4⁃F（Mouse）    CACTGGTCTAGGACCCGAGAAG
                                                                 36B4⁃R（Mouse）    GGTGCCTCTGGAGATTTTCG
              Hepa1⁃6 细胞内 TAG 含量进行检测，并使用蛋白浓
                                                                 CD36⁃F（Mouse）    TTAGATGTGGAACCCATAACTGGA
              度对结果进行校正。
                                                                 CD36⁃R（Mouse）    TTGACCAATATGTTGACCTGCAG
              1.2.4 双荧光素酶报告基因                                    ACC⁃F（Mouse）     TGGACAGACTGATCGCAGAGAAAG
                  对 CD36 mRNA 的 3′ UTR 区域进行 PCR 扩增，              ACC⁃R（Mouse）     TGGAGAGCCCCACACACA
              使用同源重组的方法将扩增得到的目的片段插入                              FAS⁃F（Mouse）     GCTGCGGAAACTTCAGGAAAT
              PGL3质粒的Luciferase序列的下游；将该质粒以及表                     FAS⁃R（Mouse）     AGAGACGTGTCACTCCTGGACTT
              达海肾荧光素酶的 pRL⁃TK 质粒共转入 Hepa1⁃6 细                    SREBP1c⁃F（Mouse） GGAGCCATGGATTGCACATT
                                                                 SREBP1c⁃R（Mouse） GGCCCGGGAAGTCACTGT
              胞，并使用miR⁃199a⁃5p⁃mimic或NC⁃mimic转染24 h
                                                                 CPTA⁃α⁃F（Mouse）  CACCAACGGGCTCATCTTCTA
              后收集细胞；使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检
                                                                 CPTA⁃α⁃R（Mouse）  CAAAATGACCTAGCCTTCTATCGAA
              测萤火虫荧光并用海肾荧光作为内参进行校正。
                                                                 ATGL⁃F（Mouse）    GAGAGAACGTCATCATATCCCACTT
              1.2.5 RNA提取及相对定量水平检测
                                                                 ATGL⁃R（Mouse）    CCACAGTACACCGGGATAAATGT
                  12 孔板细胞每孔加入 0.5 mL Trizol 裂解液，充                HSL⁃F（Mouse）     GGAGCACTACAAACGCAACGA
              分裂解后转移至离心管中。按照氯仿∶Trizol=1∶5的                       HSL⁃R（Mouse）     TCGGCCACCGGTAAAGAG
              体积加入氯仿，剧烈震荡 15 s 后，室温静止 10 min。
              4 ℃ 12 000 r/min 离心 30 min。转移上层水相至新               1.3  统计学方法
              的离心管中，加入相等体积的异丙醇沉淀 RNA，上                               所有数据在 Graphpad Prism 7.0 软件进行统计
              下颠倒混匀，室温静止 5 min。4 ℃ 12 000 r/min，离               学分析和作图，结果以均数±标准误（x ± sx）表示。
              心 10 min。弃上清。加入 1 mL 75%乙醇溶液。                     两组间比较采用两独立样本t检验，P < 0.05为差异
              4 ℃ 10 000 r/min，离心 5 min。弃上清，相同转速继               有统计学意义。
              续离心 2 min，吸去剩余 75%乙醇溶液，室温晾干。
                                                                2  结 果
              根据沉淀量，加入适量 DEPC 水溶解 RNA。RNA 溶
              液可放入-80 ℃冰箱保存。枪头及离心管均为无菌                          2.1 不同营养状态下肝脏中miR⁃199a⁃5p的表达水平
              无酶。内参和目的基因引物序列见表1。                                     为寻找与肝脏脂质代谢相关的 miRNA，利用
              1.2.6 蛋白质提取和免疫印迹（Western blot）实验                  ob/ob 小鼠的肝脏 miRNA 数据库 GEO13840 进行分
                  细胞处理后，先用 PBS 清洗 2 遍，加入适量的                     析，发现 miR⁃199a⁃5p 在 ob/ob 小鼠肝脏中表达水平
              RIPA 裂解液，刮板快速刮下细胞，将裂解液收集于                         显著升高，提示 miR⁃199a⁃5p 可能在肝脏脂质代谢
              干净的 1.5 mL 离心管中，冰上裂解 10~30 min，随后                 中发挥重要作用（图1A）。
              4 ℃ 12 000 r/min 离 心 20 min，将 上 清 移 至 新 的              为探讨miR⁃199a⁃5p在肝脏中的表达水平是否
              1.5 mL离心管中，吸取适量蛋白液进行BCA蛋白浓                        与肝脏脂肪积累的状态有关，首先建立高脂饮食诱
              度的检测。加入相应体积的5×上样缓冲液，混匀后                           导 NAFLD 的小鼠模型，肝脏油红 O 染色结果提示，
              95 ℃金属浴10 min，使蛋白完全变性。                            高脂饮食诱导的脂肪肝模型构建成功（图 1B）。随
                  蛋白经凝胶电泳后，250 mA、120 min 转移至                   后，RT⁃qPCR检测了19周龄小鼠肝脏中miR⁃199a⁃5p
              PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h 后加入相应                       的表达水平。结果显示，与正常饮食组小鼠相比，

              一 抗 ：Tubulin（1∶1 000）、FAS（1∶1 000）、CD36           高脂饮食喂养的小鼠肝脏中miR⁃199a⁃5p表达水平
             （1∶1 000）、ATGL（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日                 显著增加（图 1C）。此外，饥饿状态下，正常饮食组
              TBST清洗3次后加入二抗（1∶10 000）常温孵育1 h；                   小鼠肝脏中的miR⁃199a⁃5p的表达水平也显著增加

              TBST清洗3次后加入ECL显影液曝光，通过Image J                    （图 1D），提示在肝脏脂质积累过程中 miR⁃199a⁃5p
              软件计算组蛋白灰度值，利用内参蛋白灰度值进行                            表达水平升高，可能参与调控肝脏脂质代谢。
              校正（即对照组蛋白表达值为 1），得出各组蛋白的                          2.2 miR⁃199a⁃5p调节肝细胞中脂质水平
              相对表达量。                                                 为探究 miR⁃199a⁃5p 在肝脏脂质代谢中的作
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