Page 55 - 南京医科大学自然版

第44卷第11期 金 霄，陈晓林，姚 静，等. 结核分枝杆菌Rv2647蛋白对肺组织损伤效应的初步研究［J］.
2024年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1517-1524 ·1521 ·

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质粒。pMV361⁃Rv2647质粒电转化H37RvΔRv2647 C57BL/6 小鼠（1×10 CFU/只），感染后 7 d 内连续监
感受态菌株，涂板，37 ℃培养28 d后，挑取单克隆接 测模型鼠存活情况，结果示Ms组模型鼠的7 d存活率
种于 Middlebrook 7H9，37 ℃培养 28 d 后，收集菌体 为100.00%，高于Ms：：Rv2647组（83.33%）（图7B）。
提取基因组，PCR 验证，可见大小约 675 bp 的条带
（图5）。 A 100
80
（%） 60
（bp） M 1 2 3 4
8 000 Survival Control
5 000 40 H37Rv
3 000 20 H37RvΔRv2647
2 000 H37RvΔRv2647：：Rv2647
0
0 7 14 21 28
1 000
Time（d）
750 675 bp
500 B 100
250 80
（%）
100
M，DNA marker；1，2，3，and 4：DNA fragment of Rv2647 gene. 60
图5 PCR验证H37RvΔRv2647：：Rv2647 Survival 40
Figure 5 Verification of H37RvΔRv2647：：Rv2647 by Control
20 Ms
PCR Ms：：Rv2647
0
0 2 4 6 8
2.4 构建Ms：：Rv2647
Time（d）
PCR 扩增 Rv2647 基因，与 pMV261 质粒重组并 A：Survival of C57BL/6 mice 30 days after tracheal infection
转化 DH5α感受态细胞，挑取 pMV261⁃Rv2647 质粒 with H37Rv，H37RvΔRv2647，and H37RvΔRv2647：：Rv2647（2×
6
电转化 Ms 感受态细胞，涂板培养，挑取单克隆接种 10 CFU/mouse）（n=6）. B：Survival of C57BL/6 mice 7 days after tra⁃
7
cheal infection with Ms and Ms：：Rv2647（1×10 CFU/mouse）（n=6）.
至 7H9 液体培养基，37 ℃培养 3~4 d，收集菌体，提
图7 模型鼠生存曲线
取基因组，PCR 验证，电转成功的菌体基因组可见 Figure 7 Survival curve of model mice
大小约675 bp的条带（图6）。
2.6 Rv2647蛋白抑制模型鼠对M. tb的清除
（bp） M 1 2 3 4
分别取感染H37Rv、H37RvΔRv2647、H37RvΔRv
8 000
5 000 2647：：Rv2647 以及 Ms、Ms：：Rv2647 的模型鼠肺组
3 000
2 000 织，匀浆后梯度稀释并涂布于 Middlebrook 7H10，
37 ℃ 静 置 培 养 ，进 行 菌 落 计 数 。 结 果 显 示
1 000
750 675 bp
500 H37RvΔRv2647 组模型鼠肺组织细菌负荷（lgCFU）
250 300 bp
100 为（3.40±0.18），显著低于 H37Rv 组（3.86±0.15，P <
0.001）和 H37RvΔRv2647：：Rv2647 组（3.80±0.16，
M，DNA marker；1 and 2，DNA of the pMV261⁃Rv2647 plasmid；3
P < 0.01，图8A）；Ms组模型鼠肺组织细菌负荷（lgC⁃
and 4，DNA of the pMV261 plasmid.
图6 PCR验证Ms：：Rv2647 FU）为（2.53±0.16），显著低于Ms：：Rv2647组（2.81±
Figure 6 Verification of Ms：：Rv2647 by PCR 0.13，P < 0.01，图8B）。
2.7 Rv2647蛋白加重模型鼠肺组织病理损伤
2.5 Rv2647蛋白对模型鼠生存率的影响 分 别 取 感 染 H37Rv、H37RvΔRv2647、H37Rv
分别用H37Rv、H37RvΔRv2647及H37RvΔRv2647 ΔRv2647：：Rv2647 以及 Ms、Ms：：Rv2647 的模型鼠
：：Rv2647经气管攻击C57BL/6小鼠（2×10 CFU/只）， 的肺组织进行HE染色，H37RvΔRv2647组模型鼠肺
6
感染后 30 d 内连续监测模型鼠存活情况，结果示 组织结构相对完整，肺泡腔结构较清晰，少量炎性
H37RvΔRv2647组模型鼠的30 d存活率为100.00%， 细胞浸润，炎症面积为（4.37±3.06）%；H37Rv 组和
高于H37Rv组（83.33%）和H37RvΔRv2647：：Rv2647组 H37RvΔRv2647：：Rv2647组模型鼠肺组织结构破坏
（83.33%）（图7A）；用Ms和Ms：：Rv2647经气管攻击 明显，肺泡腔塌陷，肺泡间隔增厚或破坏，大量炎性细