骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性疾病^[1-2]。 OP引起的骨折人数的增加及其相关发病率给公共卫生服务行业带来了沉重负担^[2-3]。因此，寻找有效的OP预防和治疗策略，在目前仍是一个关键问题。

在多种因素的调节下，骨形成和骨吸收的过程保持动态平衡，以维持骨内环境的稳态。一方面，众多信号通路参与到骨平衡中，如Wnt/β⁃FGF、 PI3K⁃Akt及BMPs/Smads等信号通路。另一方面，非编码RNA的表观遗传调节也在骨平衡中发挥重要作用。长链非编码RNA（long non⁃coding RNA， lncRNA）参与各种人类疾病的生物学过程^[4-5]。 lncRNA在表观遗传学、转录以及转录后水平广泛参与，可以顺式或反式作用的方式调节组蛋白修饰、染色质重塑、蛋白质功能活性及RNA代谢^[6-7]。所以，发掘出关键的信号通路和有意义的lncRNA，可以为诊断和治疗OP提供新视角。

本课题组通过利用GEO数据库，对GSE35956基因芯片进行分析，使用富集分析和lncRNA重注释的方法，发掘出其中关键的信号通路和lncRNA RAD51⁃ AS1。而且，通过细胞学实验验证RAD51⁃AS1促进增殖及成骨的能力，对RAD51⁃AS1改善OP进行了初步研究，为未来OP的诊治提供新思路^[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

骨髓间充质干细胞从正常人及确诊OP的志愿者的骨髓血提取。所有的骨髓血取下后立即置于完全培养基中，并及时提取其中骨髓间充质干细胞，培养至第2代后提取样本的总RNA。本课题研究通过了南京医科大学附属南京医院伦理委员会的同意，并得到了所有取样患者的知情同意。

培养细胞的α⁃MEM培养基、TRIzol试剂及转染试剂Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美国）；Ul⁃ traGRO（上海Helios BioScience公司）；逆转录及实时定量PCR试剂盒（南京诺唯赞公司）；lncRNA RAD51⁃ AS1的Smart Silencer（广州锐博公司）；MTT（Biofroxx公司，德国）；ALP染色试剂盒（上海碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 lncRNA重注释及生物信息学分析

GSE35956数据集使用了Affymetrix HG ⁃ U133Plus 2.0微阵列，包括54 675个探针组。根据既往文献，对基因芯片进行lncRNA重注释，以确定映射到lncRNA的探针集。首先，从Affymetrix网站下载了HG⁃U133Plus 2.0微阵列探针注释，以过滤具有Refseq ID的探针集，标记为“NR_”或“XR_”。第二，将GSE35956矩阵与上述文件中的探针ID结合起来。第三，利用Genecode数据库将步骤2文件与有基因名的注释文件相结合。最后，总共选择了特定的1 228个有注释的lncRNA转录物和相应的Affymetrix探针ID^[9]。微阵列分析GSE35956原始数据从GEO数据库下载（GSE35956）。数据微阵列的背景校正和归一化由R语言的AffyR包处理。此外，在归一化表达的基础上，用R软件生成特异的1 228个lncRNA表达矩阵。mRNA和lncRNA差异基因表达分析由DEseq2R包进行。使用ggplot R软件包在dif⁃lncRNA上绘制火山图。使用ClusterPro⁃ filer对mRNA差异分析的基因进行富集分析。

1.2.2 细胞提取和培养

从骨髓中吸取骨髓血后立即加入无菌的α⁃ MEM进行运输。无菌条件下使用密度梯度离心法分离出人骨髓间质干细胞。人骨髓间充质干细胞需要培养在含有5%UltraGRO的α⁃MEM培养基中，贴壁生长；同时根据需求是否添加双抗（100mg/L链霉素和100U/mL）。细胞常规培养在含有5%CO₂的37℃恒温培养箱中，每3~4d更换新的培养基，当培养皿中细胞融合度达到80%~90%时，按1∶2或1∶3的比例进行细胞传代。后续使用正常人的骨髓间充质干细胞继续功能试验。

1.2.3 实时定量PCR

提取骨髓间充质干细胞的总RNA，根据美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）提供的基因序列，设计并合成lnc⁃ RNA RAD51⁃AS1和内参ACT ⁃β的引物。RAD51⁃ AS1上游引物：5′⁃TGATCCTGCGCGAGTTTACA⁃3′，下游引物：5′⁃ATGCATGCCGGGAGATGTAG⁃3′；ACT⁃β 上游引物：5′⁃TCTCCCAAGTCCACACAGG⁃3′，下游引物：5′⁃GGCACGAAGGCTCATCA⁃3′。实时荧光定量PCR反应体系20 μL，其中包括：ddH₂O 7.2 μL、上游引物（10 μmol/L）0.4 μL、下游引物（10 μmol/L） 0.4 μL、SYBR Green 10.0 μL及模板cDNA 2.0 μL，每个样本设置2~3个复孔。反应条件：第1阶段对cDNA进行预变性，在PCR中95℃，30s；第2阶段进行循环反应进行扩增，在95℃下10s，60℃下30s，循环40次；最后阶段对最终产物进行熔解曲线测量， 95℃下15s，60℃下60s和95℃下15s。基因表达分析是通过2^-ΔΔCT方法计算的。

1.2.4 细胞转染

lncRNA RAD51⁃AS1的Smart Silencer以用于干扰RAD51⁃AS的表达，其中使用无酶超纯水对RNA干粉进行稀释。Lipofectamine3000和100nmol/L的Smart Silencer在1个试管中孵化，转染15min。转染6~8h后，更换新的细胞完全生长培养基，待培养至24~72h后进行后续实验。

1.2.5 MTT实验

①将转染24~36h的细胞消化下并计数，每孔3 000个细胞；②待细胞贴壁完全后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT工作液20 μL，37℃孵育4h；③ 加入DMSO溶解所形成的紫色结晶，使用酶标仪测得每孔在490nm处的吸光度值，分析不同处理的条件培养基对细胞活力和生长的影响；④连续测量5d吸光度，进行结果分析。

1.2.6 克隆形成实验

取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养液中备用。将细胞悬液稀释，每组细胞分别以1 500个/孔接种在含2mL 37℃预温培养液的6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5%CO₂ 及饱和湿度的细胞培养箱中培养2周。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞15min。然后去固定液，加适量结晶紫染液染20~30min，然后用PBS洗去染色液，空气干燥。将大皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数＞10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

1.2.7 诱导成骨分化

为了进行成骨细胞分化，hBMSC在成骨细胞分化培养基（α⁃MEM，含5%UltraGRO、1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β⁃甘油磷酸酯、50 μmol/L抗坏血酸、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素）中培养0~7d。每3d更换1次培养基。

1.2.8 ALP染色实验

在成骨诱导第5天进行ALP染色。用4%多聚甲醛固定细胞30min，用PBS洗2~3次，然后与适量的BCIP/NBT染色液混合，对hBMSC进行染色。将hBMSC在室温下染色20~30min，观察其染色程度达到预期后，除去工作液，用ddH₂O清洗2次以停止反应。

1.3 统计学方法

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，每个涉及细胞的实验都至少重复3次。所有数据以平均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示。组间差异用双尾Student’s t 检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选差异基因（differentially expressed gene， DEG）和富集分析

本研究中，从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE35956）下载表达矩阵。利用其原发性OP的基因芯片，整理得到5例正常人及5例原发性OP患者，且年龄较为相近。随后对芯片数据进行处理，使用DEseq2且根据|log₂ Fold Change|＞1，P ＜0.05的条件下，筛选出1 440个DEG，其中1 161个上调DEG，279个下调DEG（图1A）。

根据京都基因与基因组百科全书（Kyoto Ency⁃ clopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库和基因本体论（gene ontology，GO）分析的结果，本研究以 P _调整＜0.05为筛选条件，并按照富集于此通路的DEG计数值从大到小排列。KEGG结果显示，这些DEG主要富集于神经活性配体与受体的相互作用、 PI3K⁃Akt信号转导途径及cAMP信号转导途径等 （图1B）。而在GO分析的生物学过程（biological progress，BP）中，这些DEG主要参与单核细胞分化、淋巴细胞分化、Ⅰ型干扰素信号转导通路、细胞对 Ⅰ型干扰素的响应、对Ⅰ型干扰素的响应和对病毒基因组复制的负向调节；从分子功能上看，这些DEG主要涉及受体配体活性、信号受体激活剂的活性、通道活性、被动跨膜转运器活性、离子通道活性、门控通道活性及细胞因子活性等（图1C）。

2.2 lncRNA重注释后筛选DEG

从GEO数据库中找到GSE35956基因芯片表达矩阵，为了研究OP中差异表达的lncRNA。根据以前的论文，在GPL570平台芯片上进行了lncRNA的重新注释^[9]，注释后发现了1 228个lncRNA。随即使用DEseq2对lncRNA进行差异基因分析，根据|log₂ Fold Change|＞1，P _调整 ＜0.05的条件下，筛选出105个DEG，其中68个上调DEG，35个下调DEG（图2）。

2.3 在正常人及OP患者的hBMSC中验证RAD51⁃ AS1的表达，并沉默RAD51⁃AS1的表达

在lncRNA的DEG中，lncRNA RAD51⁃AS1未有过相关报道其与OP的关系。收集10例正常人及10例OP患者的骨髓血，并从中提取hBMSC验证RAD51⁃AS1的表达量。经过实时定量PCR验证，发现RAD51⁃AS1在hBMSC中表达量较高，且相较于正常人的hBMSC，lncRNA RAD51⁃AS1在OP患者的hBMSC显著下调（图3A）。

为了探究RAD51⁃AS1在hBMSC中的作用，使用Smart Silencer，其中包括3条小干扰和3条反义寡核苷酸，防止对RAD51⁃AS1的脱靶效应。通过转染，在hBMSC中下调RAD51⁃AS1的水平，以转染打乱序列的小干扰作为对照。同时实时定量PCR检测干扰效率。结果显示，转染干扰RAD51⁃AS1表达的hBMSC，RAD51⁃AS1的表达水平显著下调（图3B），证实其对RAD51⁃AS1干扰效果显著。

2.4 沉默RAD51⁃AS1对hBMSC增殖的影响

为了检测RAD51⁃AS1对hBMSC增殖的影响，沉默RAD51⁃AS1表达后进行了MTT及克隆形成实验研究hBMSC的增殖活力。MTT结果显示，沉默RAD51⁃AS1后，相较于转染对照组，细胞的增殖活力明显降低（图4A）。通过计算细胞克隆形成，发现沉默RAD51⁃AS1后，hBMSC的克隆形成能力减弱 （图4B）。

2.5 沉默RAD51⁃AS1对hBMSC成骨分化的影响

为了探究RAD51⁃AS1在hBMSC中对成骨分化的影响，在体外使用成骨诱导液，诱导hBMSC成骨分化。在第5天的时候对其进行ALP染色。根据图所示，可以看出沉默RAD51⁃AS1后，ALP的活性显著降低（图5）。

3 讨论

本研究通过从GEO数据库中的基因芯片GSE35956进行lncRNA重注释和生物信息学分析，得到了mRNA和lncRNA的差异表达基因，并利用富集分析对mRNA DEG进行了GO分析和KEGG分析，挖掘其具体的生物过程、分子功能和信号通路，发现PI3K⁃Akt及cAMP信号通路在骨质疏松中的发挥中重要作用。通过对差异表达的lncRNA进行筛选，发现lncRNA RAD51⁃AS1在骨质疏松患者中显著下调，并使用体外实验，发现RAD51⁃AS1对hBM⁃ SC的增殖及成骨分化的能力。

通过富集分析结合可以看出，PI3K⁃Akt信号通路及cAMP信号通路在OP的发展中起到重要作用。既往研究显示，PI3K/Akt/mTOR在控制细胞生长、增殖、生存、代谢、血管生成、转录和翻译方面发挥着关键作用。mTOR抑制剂被证明可以积极调节破骨细胞的生成，增加肿瘤小鼠的骨量^[10]。同时，PI3K/Akt信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化，增强hBMSC在骨再生中的治疗作用^[11-12]。不仅如此， PI3K/Akt/mTOR信号通路还与经典Wnt/β⁃catenin信号通路和RANK/RANKL信号通路等多种分子信号通路相互作用，从而参与维持骨稳态。cAMP信号通路主要通过调节盐诱导激酶（salt⁃inducible kinase， SIK）发挥调节骨代谢的作用。研究提出，通过cAMP调节抑制SIK是PTH1R在骨骼发育和重塑中作用的核心，导致在成骨细胞和骨细胞中，骨量显着增加^[13]。以上研究证明，PI3K⁃Akt及cAMP信号通路在促进成骨和抑制破骨的过程中发挥积极作用，能够有效改善OP的进程。所以，未来可以针对PI3K⁃Akt及cAMP信号通路进行深入研究，继续探讨其在OP的诊断及治疗价值，对于未来进一步研发新的抗OP药物尤为重要。

HBMSC作为成骨细胞的来源，其增殖和成骨活性活性的降低或抑制是诱导OP症患者骨丢失的主要因素^[14-15]。lncRNA可以通过调节hBMSC的各方面功能，从而影响OP的进程^[16]。同时，lncRNA RAD51⁃AS1目前已经被证实参与多种肿瘤疾病的发展，如上皮性卵巢癌和结直肠癌等^[17-18]。不仅如此，RAD51⁃AS1可以通过影响RAD51的活性，影响同源重组（HR）和DNA双链断裂（DSB）修复，导致基因组不稳定和肿瘤发展^[19]。然而，RAD51⁃AS1是否能够通过调节hBMSC的增殖和分化改善OP，对此尚不明确。本研究发现，lncRNA RAD51⁃AS1在OP患者中显著下调。同时，通过MTT和克隆形成实验发现，在沉默RAD51⁃AS1后hBMSC的增殖能力显著下降。在对hBMSC进行体外诱导成骨分化培养，发现沉默RAD51⁃AS1后hBMSC的ALP活性显著下降。但是未来仍需要构建干扰或过表达RAD51 ⁃ AS1的慢病毒载体，通过长期稳定影响RAD51⁃AS1的表达后，完善茜素红实验及体内异位成骨实验，更好地阐明RAD51⁃AS1对成骨分化的影响。

综上，本研究首次证实RAD51⁃AS1在OP患者的hBMSC中显著下调，并发现了RAD51 ⁃AS1在hBMSC中促进增殖及成骨分化的能力。未来仍需要对RAD51⁃AS1影响成骨和成脂分化的平衡进行深入研究，探讨并发现RAD51⁃AS1在改善OP中的具体作用机制。同时，仍需要继续收集并扩大临床样本量，进一步验证RAD51⁃AS1作为OP的在诊断中所发挥的重要作用，为治疗OP提供更好的理论基础和实验支持。

参考文献