邻苯二甲酸二（2⁃乙基己基）酯[di（2⁃ethylhex⁃ yl）phthalate，DEHP]是一种邻苯二甲酸酯类，因其弹性高、可塑性强，常被用作增塑剂添加于各种聚氯乙烯产品中，如医疗器械、药品和食品容器、儿童玩具和工业塑料等，以提高产品的柔韧性和耐久性^[1]。 DEHP以非共价化学键与聚氯乙烯结合，在温度、使用时间和 pH 值等外部条件变化时，它可以不断地从产品中解离，污染水、食物、土壤、植物和沉积物等^[2]。DEHP可经多种途径进入人体，如口鼻吸入、直接经口食入、皮肤吸收和在医疗活动中直接进入循环系统等^[3]。DEHP具有疏水亲脂性，易从聚氯乙烯产品渗入至含脂肪类食物、含有脂质的溶液等，接触血液后更容易转移至血液^[4]。因此，在接受塑料材料的侵入性医治（包括体外循环、体外膜肺氧合、透析和输血治疗）后，可以观察到患者体内DEHP水平升高。如接受输血治疗的成年人血液内DEHP浓度上升，为72.5~295.2 μg/mL（相当于185~755 μmol/L）^[5]。 DEHP 及其代谢产物进入人体后会对内分泌系统、生殖系统、呼吸系统、神经系统等多个系统器官产生毒性作用^[1]。多项流行病学调查研究表明DEHP 可以扩散到心脏，对心脏节律和心肌细胞产生影响，尚未有研究关注DEHP对心脏的滋养血管即心肌血管的影响^[1，5-6]。

心肌血管是滋养心肌的血管，负责心肌中氧合血液和去氧血液的有效输送和排出^[7]。所有心肌血管内衬一层单层、极性排列的内皮细胞，该层内皮细胞参与多种生理功能，如调节新血管形成、维持血管舒张性、维持血液流动性、调节血管壁通透性、抑制血管中促炎因子和凝血因子的激活等^[8-9]。内皮细胞功能异常导致多种并发症，如凝血增强、细胞黏附、炎症激活、脂蛋白跨内皮运输及血管异常收缩和舒张等^[10]。细胞凋亡是受到生物体严格调控的程序性死亡，能够维持各种组织和器官的稳定^[11]。血管内皮细胞长期暴露在各种循环应激源的作用下，必须在凋亡和存活之间保持平衡，以保持内皮的完整性^[12]。在病理条件下，内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化的始动步骤，将导致随后的动脉粥样硬化发生发展^[13]。已有研究表明DEHP暴露可以增加老年人群冠状动脉粥样硬化的风险^[14]。

磷脂酰肌醇 3 ⁃ 激酶/蛋白激酶 B（phosphati⁃ dylinositol⁃3⁃kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路存在于所有哺乳动物细胞中，并受细胞外信号的调控，对维持细胞正常功能起着至关重要的作用^[15-16]。PI3K的激活可以磷酸化AKT，磷酸化的 AKT（p⁃AKT）可以进一步激活下游靶点调节细胞存活，包括Bcl⁃2家族蛋白（如Bcl⁃2、BAX）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族蛋白（如Caspase⁃3）^[17]。鉴于内皮细胞在血管中的重要地位，用不同剂量DEHP 处理人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC），通过凋亡、血管形成等实验观察其对HCAEC功能的影响，并初步探索PI3K/ AKT信号通路在DEHP致HCAEC损伤中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

HCAEC（武汉 Fine Text 公司）。Dulbecco 改良 Eagle 培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium， DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素和链霉素（Gibco公司，美国）。DEHP（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）。CCK⁃8试剂和Annexin V⁃FITC/PI凋亡检测试剂盒（南京诺维赞公司）。抗 p⁃PI3、PI3K、 p⁃AKT、AKT抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），抗 BAX、Bcl ⁃2、cleaved Caspase ⁃3、Caspase ⁃3、 GAPDH 抗体（上海艾比马特公司）。二甲基亚砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索莱宝公司）。磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂（Roche 公司，瑞士）。 Matrigel基质胶（Corning公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及DEHP染毒

向高糖DMEM 中加入FBS和青霉素⁃链霉素双抗，使 FBS 和青霉素⁃链霉素双抗的终浓度分别为 10%和 1%，配制完全培养基。HCAEC 用完全培养基培养接种于无菌培养皿中，置于细胞培养箱常规培养，设定温度在37℃，CO₂浓度在5%，每2 d更换 1次培养基。DEHP染毒实验，选取生长良好处于对数生长期的细胞，以DMSO为阴性对照组，实验组参考相关研究的染毒时间和 DEHP 浓度^[5，18-20]，将 DEHP 溶解稀释于 DMSO，再与培养基混合，将 DEHP 稀释成 128、256、384、512 μmol/L，使 HCAEC 染毒（DMSO终浓度低于0.1%），模拟DEHP暴露。

1.2.2 细胞增殖⁃毒性实验

CCK⁃8试剂盒检测DEHP对细胞增殖能力的影响。将细胞以2 000个/孔的密度接种在96孔板中，过夜后用显微镜观察，细胞贴壁生长良好，弃去原有培养基后，设置空白对照组（无细胞仅有培养基）、阴性对照组（DMSO）、实验组（DEHP 128、256、 384、512 μmol/L），每组 5 个复孔，染毒后将 96 孔板放回培养箱继续培养12、24、48、72 h。染毒结束后，向每个孔加入10 μL CCK⁃8溶液，继续孵育2 h，2 h 后用酶标仪检测各组细胞在450 nm处吸光度值，各组结果表示为相应阴性对照组细胞活力的百分比，根据下列公式计算：（A-C）/（B-C）×100%（A：实验组吸光度值，B：阴性对照组吸光度值，C：空白对照组吸光度值）。

1.2.3 体外成管实验

制备细胞悬液，调整细胞密度为 1×10⁶ 个/mL。按照每孔50 μL将细胞悬液滴加到预先涂有基质胶的 96 孔板中，设置对照组（DMSO）、实验组（DEHP 128、256、384、512 μmol/L）。轻轻震荡，使细胞分布均匀。在培养箱中常规培养6 h。用倒置显微镜观察拍摄细胞成管情况，用 Image J 软件分析图片结果，定义至少3条管的交汇处为1个交点，以交点数目表示各组成管结果。

1.2.4 流式细胞实验

用 Annexin V⁃FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒检测DEHP对HCAEC凋亡的影响。6孔板常规培养细胞，设置对照组（DMSO）、实验组（DEHP 128、256、 384、512 μmol/L），在培养箱中常规培养染毒 72 h。染毒结束后，用不含乙二胺四乙酸（ethylene di⁃ amine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化并收集细胞。细胞用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗 2 次后，用 100 μL 结合缓冲液重悬细胞，加入 5 μL Annexin V⁃FITC 和 5 μL PI 染色液室温（20~25℃）避光孵育10 min。孵育结束后，加入400 μL结合缓冲液，轻轻混匀。此外，用未经处理的细胞样品作为阴性对照，用DEHP 256 μmol/L组的细胞分别进行Annexin V⁃FITC和PI单染。

在 1 h 内用流式细胞仪检测细胞样品，在双色流式细胞仪散点图上，早期凋亡细胞散在分布于右下象限，晚期凋亡细胞散在分布于右上象限。存活细胞和坏死细胞分别散布在左下象限和左上象限。定义各组结果为：凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.5 蛋白质印迹实验（Western blot）

用 Western blot 评估凋亡相关蛋白（Bcl ⁃ 2、 cleaved Caspase ⁃3、Caspase ⁃3、BAX）及通路蛋白 （p⁃PI3K、PI3K、p⁃AKT、AKT）的表达水平。细胞染毒72 h后，吸去培养基，用预冷的PBS冲洗细胞。每组细胞用细胞裂解液（RIPA）裂解，裂解液中添加磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。4℃裂解2 h后，将样品在 4℃下以 15 000 r/min 离心 20 min。使用增强的 BCA 蛋白质测定试剂盒测量上清液中蛋白质浓度，添加5×上样缓冲液后在100℃下变性15 min，分装冻存。通过 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并转移至 0.45 μm 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。然后，5%牛血清白蛋白封闭缓冲液室温下封闭 2 h，按照蛋白 Marker 位置与目标蛋白分子量裁剪 PVDF 膜，与相应的一抗在 4℃下孵育过夜。抗体包括 Bcl⁃2 （1∶1 000）、BAX（1∶1 000）、cleaved Caspase⁃3 （1∶1 000）、Caspase⁃3（1∶1 000）、GAPDH（1∶ 1 000）、p⁃PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p⁃AKT （1∶1 000）、AKT（1∶1 000）。第2天在脱色摇床上用添加 0.1% Tween⁃20 的 Tris 缓冲盐水将 PVDF 膜洗涤 3 次，每次 15 min，在室温下二抗孵育 2 h，然后使用上述方法再次洗涤 3 次。使用增强的化学发光试剂，用自动化学发光图像分析系统曝光免疫反应条带。通过 Image J 软件 v1.53 测量每个条带的积分密度，分析相应样品中目的蛋白/GAPDH 或磷酸化蛋白/总蛋白的比例来计算相对蛋白表达含量。

1.3 统计学方法

用Excel 2019进行数据录入，SPSS 26.0进行数据的统计学分析，GraphPad Prism 8进行柱状图和折线图的绘制。本研究各组数据为正态分布且方差齐，结果以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）形式表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析 （One⁃way ANOVA），组间两两比较采用 LSD 检验。以双侧α=0.05 为显著性检验标准，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DEHP暴露对HCEAC细胞形态的影响

倒置显微镜观察可见（图1A），72 h时，实验组和对照（DMSO）组细胞均为单层贴壁生长，呈现卵圆形或鹅卵石外观，边界清楚，胞浆丰富，细胞核清晰。实验组整体细胞密度较对照组减低，实验组小部分细胞胞浆内出现空泡状结构，细胞变大且结构松散，细胞核增大。

2.2 DEHP抑制HCAEC的增殖

CCK⁃8 法观察 DEHP 对 HCAEC 增殖能力的影响。对DEHP浓度及染毒时间分别进行了单独效应检测。染毒12 h时，与对照（DMSO）组相比，实验组的细胞活力差异无统计学意义（P > 0.05）。染毒时间为24、48、72 h时，与对照（DMSO）组相比，实验组各浓度 DEHP（128、256、384、512 μmol/L）均能够抑制细胞的增殖能力（P < 0.05，图1B），随着DEHP浓度的增加，细胞活力依次降低，且 DEHP 128、256、 384、512 μmol/L组细胞活力相互之间的差异均有统计学意义（P < 0.05）。随着时间的延长，对照（DMSO）组细胞活力仅有轻微降低，各个时间点之间差异无统计学意义（P > 0.05，图1B）。随着染毒时间的延长，各实验组各时间点细胞活力依次降低，各时间点细胞活力相互之间的差异均有统计学意义（P < 0.05）。上述结果表明DEHP可抑制HCAEC 的增殖能力，并且染毒时间越长、DEHP浓度越高，毒性作用越明显，具有时间和浓度依赖性。

2.3 DEHP抑制HCAEC血管形成能力

体外成管实验能够在一定程度上模拟血管发生过程，通过观察细胞形成管腔的情况，评估DEHP 对 HCAEC 血管形成能力的影响。对照（DMSO）组细胞多呈现为拉长的梭形，互相连接成网状，形成的管状结构在 6 h 时趋于稳定，随着时间的延长逐渐崩解。实验组细胞多呈现孤立的圆形、卵圆形，散乱分布在视野中（图2A）。与对照（DMSO）组相比，DEHP 128 μmol/L组形成的交点数目减少，但是差异无统计学意义（P > 0.05）。DEHP 256、384、 512 μmol/L 组形成交点数目进一步减少，与对照 （DMSO）组相比，差异有统计学意义（P < 0.01，图2B）。以上结果说明 DEHP 可以抑制 HCAEC 的血管形成能力，具有浓度依赖性。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡，为了评价DEHP 对HCAEC 凋亡的影响，进行了细胞流式实验。与对照（DMSO）组相比，各实验组凋亡细胞比例增加，差异具有统计学意义（P < 0.05，图3A、B）。后续检测了凋亡相关蛋白的表达水平， Western blot 实验结果显示，与对照组 Bcl⁃2 表达水平相比，各实验组Bcl⁃2表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05，图3C、D）；与对照（DMSO）组BAX 表达水平相比，DEHP 128 μmol/L 组 BAX 表达水平降低，但是其差异无统计学意义（P > 0.05）。DEHP 256、384、512 μmol/L组BAX表达水平增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；与对照（DMSO）组 cleaved Caspase⁃3/Caspase⁃3比值相比，各实验组比值上升，差异具有统计学意义（P < 0.05）。以上结果说明 DEHP 可以改变凋亡相关蛋白的表达水平，诱导HCAEC的凋亡。

2.4 DEHP抑制PI3K/AKT信号通路

为了探究上述结果的可能原因，进行了 West⁃ ern blot实验，各组PI3K、AKT水平差异无统计学意义（P > 0.05，图4A）。当 DEHP 浓度≥256 μmol/L 时，实验组p⁃PI3K/PI3K、p⁃AKT/AKT 比值较对照组降低，差异有统计学意义（P < 0.05，图4B）。上述结果说明，DEHP可以降低关键蛋白的磷酸化水平，抑制PI3K/AKT通路。

3 讨论

随着聚氯乙烯制品的广泛应用，DEHP 的产量逐年上升，年产量已超过200万吨^[1]。DEHP是美国食品和药物协会批准的医疗器械中最常用的增塑剂，应用于储血袋、管道回路、肠内营养管、气管插管等。生活中进入人体的DEHP的量与生活方式和医疗器械的使用情况相关，接受医疗措施患者的血液 DEHP 浓度往往较高^[21]。输血治疗后成年人血液 DEHP 浓度为 72.5~295.2 μg/mL，儿童输血治疗后血液 DEHP 浓度则更高，为 27.6~405 μg/mL（DEHP 100 μg/mL=256 μmol/L）^[5]。成人冠状动脉搭桥和心脏移植手术DEHP暴露剂量分别为1.0、2.4 mg/（kg·d），成人和儿童进行体外循环手术时 DEHP的暴露量分别为3.0、14.0 mg/（kg·d），均超过人体耐受剂量即 0.6 mg/（kg·d）^[22]。美国环保局数据显示，20 μg/（kg·d） 的DEHP暴露剂量即有造成肝脏肿大的风险，欧洲食品安全局报告称，50 μg/（kg·d）的DEHP暴露剂量可能具有睾丸毒性^[1]。

近年，DEHP 的心血管毒性受到关注。研究显示，体外DEHP灌流大鼠心脏，可使其心率变慢、单位时间内冠脉流量下降^[23]。流行病学调查显示， DEHP 暴露可导致青少年左室收缩压升高、心律失常^[24-25]，增加老年人群冠状动脉粥样硬化的风险，尿液 DEHP 水平亦与检测到的血管斑块回声成正相关^[14]。对载脂蛋白 E 缺陷的小鼠给予 DEHP 灌胃，4周后小鼠表现出高脂血症、动脉粥样硬化加重和动脉内皮细胞的炎症损伤。动脉内皮细胞衬于血管内壁，它的凋亡被认为是动脉粥样硬化的始动因素之一，抑制内皮细胞凋亡可能是一种潜在的治疗动脉粥样硬化的策略^[13]。因此，本研究根据临床患者可能的DEHP暴露情况和相关文献记载，建立了HCAEC的DEHP暴露模型^[5，18-19]，观察DEHP暴露对HCAEC的影响及可能机制。

内皮细胞是心肌血管的重要组成部分，是血管快速新生和维持内皮层完整性的基础^[26]。CCK⁃8结果表明，DEHP 能够以时间和剂量依赖的方式抑制 HCAEC 增殖能力。体外成管实验中，6 h时实验组交点数目比对照组减少，而染毒时间≤12 h 实验组和对照组增殖能力差异无统计学意义，说明DEHP 可以在不影响增殖的情况下对HCAEC血管形成能力产生抑制。

Western blot 结果显示实验组和对照组 PI3K、 AKT 差异无统计学意义。DEHP 浓度≥256 μmol/L 时，实验组p⁃PI3K/PI3K、p⁃AKT/AKT较对照组降低，差异有统计学意义，说明DEHP可降低PI3K/AKT信号通路关键蛋白的磷酸化。生理情况下PI3K的激活可以磷酸化和激活AKT，通过与其PH域结合，导致AKT移位到细胞膜的内表面^[27-28]。磷酸化的AKT（p⁃AKT）可以进一步调节下游信号，如Bcl⁃2家族蛋白（如Bcl⁃2、BAX）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族蛋白（如 Caspase⁃3）^[29-30]。Caspase⁃3 在多条凋亡信号转导通路中发挥重要作用。Caspase⁃3以酶原形式存在于细胞质中，在细胞凋亡的早期被剪切激活，剪切的Caspase⁃3（cleaved Casepase⁃3）会引起一系列的级联反应，激活核酸内切酶，分解DNA片段，最终诱导细胞凋亡。Bcl⁃2和Bax是Bcl⁃2家族成员中的一对凋亡调控基因，参与细胞线粒体凋亡途径的调控机制。Bax 和 Bcl⁃2 主要作用于线粒体膜。 Bax 是一种促凋亡基因，可促进线粒体释放细胞色素 C，从而促进细胞凋亡。Bcl⁃2 是一种抗凋亡基因，可以抑制细胞色素C的释放，并拮抗Bax的促凋亡作用^[31-32]。本研究结果显示，与对照（DMSO）组相比，实验组Bcl⁃2降低，同时BAX和cleaved Caspase⁃ 3/Caspase⁃3增加，与对照组差异有统计学意义（P < 0.05）。此结果与流式细胞实验相符，与对照 （DMSO）组相比，实验组细胞凋亡比例上升，差异有统计学意义（P ＜0.05）。DEHP对HCAEC凋亡的诱导作用，恰恰反映其毒性的可调控性，从细胞凋亡角度，PI3K/AKT参与DEHP诱导的HCAEC凋亡，提示其可能作为将来治疗研究的一个切入点。

本研究表明，以临床患者可能接触的DEHP剂量作用于 HCEAC，可以通过抑制 PI3K/AKT 信号通路诱导其凋亡，抑制其增殖、成管能力（图5），这将为寻求临床 DEHP 暴露致 HCAEC 损伤的治疗方法提供理论基础。

参考文献