多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种浆细胞恶性肿瘤，在其发生和发展过程中，骨髓瘤细胞与骨髓微环境的相互作用起到非常重要的作用^[1-2]。成骨细胞作为为骨髓微环境中的重要细胞成分之一，在MM中可出现明显的异常^[3]。MM患者成骨细胞的成骨活性下降，而破骨细胞活性亢进是骨髓瘤患者骨骼病变的核心机制^[4-6]。此外，如何纠正 MM 患者的成骨细胞功能障碍，也是 MM 领域的研究热点。多西环素（doxycycline，DOX）是一种临床上常用于抗菌治疗的抗生素。本课题组先前发现DOX在体外有抗骨髓瘤细胞增殖的作用^[7-8]。鉴于骨髓微环境中的成骨细胞在MM中的重要作用，本研究拟探索DOX在体外对成骨细胞株MC3T3⁃E1 成骨分化的影响及相应机制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠前成骨细胞系（MC3T3⁃E1细胞，中科院上海细胞库）；α⁃MEM 培养基、胎牛血清（FBS）（Gibco 公司，美国）；多西环素（Sigma公司，美国）；MEK抑制剂U0126（MCE公司，美国）；CCK⁃8试剂盒（同仁公司，日本）；PCR 引物（上海生工生物公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green试剂盒（Takara公司，日本）； 引物委托上海生工生物技术有限公司设计并合成。引物序列如下：OCN⁃F5′⁃TGACGAGTTGGCT⁃GACCA⁃3′，OCN⁃R 5′⁃AGGGTGCCTGGAGAGGAG⁃ 3′；Runx2⁃F5′⁃TTGACCTTTGTCCCAATGC⁃3′，Runx2⁃R 5′⁃AGGTTGGAGGCACACATAGG⁃3′；β⁃ac⁃tin⁃F5′⁃CCTGGCACCCAGACAAAT⁃3′，β⁃actin⁃R 5′⁃GGGCCGGACTCGTCATAC⁃3′。兔抗人p⁃ERK1/2抗体、兔抗人p⁃MEK抗体、兔抗人GAPDH抗体等（CST 公司，美国）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液（5×）、预染 Marker（杭州碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理

MC3T3⁃E1细胞用含有10％ FBS的α⁃MEM培养液培养，取生长状态良好的细胞进行实验。用于实验的 DOX 浓度为 5、10、20、40 mg/L，U0126 浓度为 5、10 μmol/L。

1.2.2 CCK⁃8检测细胞增殖

在96孔板中每孔接种50 μL的细胞悬液（1×10⁵ 个/mL），将DOX用培养液配制成所需的浓度，实验组孔加入50 μL药物；对照组加入50 μL培养液。在涡旋振荡器上轻轻摇匀，置于37℃培养箱分别培养 1、2、3 d后，取出96孔板，在每孔中加入10 μL CCK⁃8 试剂，避光孵育约1 h，酶标仪测量在450 nm波长处的吸光值并记录。

1.2.3 Western blot检测蛋白的表达

收集细胞，于冰上裂解，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。配制分离胶以及浓缩胶，按每个加样孔约 30 μg 蛋白量上样。电泳后转膜到孔径为 0.45 μm的PVDF膜上，封闭后将膜放入相应的一抗中，在4℃环境中摇床孵育过夜。洗膜、摇床上孵育二抗，孵育结束洗膜、曝光。用Image J软件进行灰度值分析。

1.2.4 茜素红染色检测成骨

当培养的 MC3T3⁃E1 细胞融合度达到 80%时，消化并调整细胞浓度1×10⁴ 个/mL接种至12孔板中的无菌爬片上，每孔培养体系为 1 mL。培养过夜后，不同组别更换培养基，每孔加入1 mL相应培养基。设置阴性对照组（含完全培养基）、诱导组（成骨诱导液）、实验组（含DOX的成骨诱导液）。每3 d 更换新鲜的各组培养基。诱导14、21 d时，经4%多聚甲醛固定30 min，茜素红染色检测成骨，日常光线下标本拍照、倒置显微镜下镜检。

1.2.5 实时定量PCR（qPCR）检测基因表达

收集细胞，冰上裂解，用 TRIzol 提取细胞总 RNA，酶标仪上测定浓度。按照试剂盒说明配制逆转录体系，在PCR扩增仪中进行逆转录；转录完后，将合成的 cDNA 放在冰上冷却。按 SYBR Green 试剂盒说明书在冰上配制 20 μL 反应体系，加入 8 连管中，在仪器中反应，最后进行数据处理分析。

1.3 统计学方法

数据处理、统计分析用GraphPad Prism 5.0软件进行操作；用Image J软件计算蛋白及茜素红染色灰度值。实验数据用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，数据资料符合正态分布（S⁃W检验），用单因素方差分析方法对各实验组组间进行两两比较（Dunnett⁃t检验）。 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度 DOX 对前成骨细胞 MC3T3⁃E1 细胞增殖的影响

取生长状态良好的 MC3T3⁃E1 细胞，按实验分组处理 1、2、3 d，发现与对照组相比，5~40 mg/L 的 DOX 对 MC3T3⁃E1 细胞增殖没有明显的抑制作用 （图1）。

2.2 茜素红染色检测 DOX 对 MC3T3⁃E1 细胞成骨分化的影响

既往Wiśniewska等^[9] 发现DOX本身可以直接抑制 ALP 的活性，对 ALP 染色有干扰，我们前期实验结果与其报道一致，故本研究不采用ALP染色作为成骨分化标志。MC3T3′⁃E1 细胞株体外成骨诱导过程中，在第 14、21 天进行茜素红染色，检测成骨分化的效果。在第 14 天时，肉眼及显微镜下观察茜素红染色3组间没有明显区别（图2A、B）。成骨诱导21 d时，诱导组与实验组均可见明显红染。与诱导组比较，加入DOX的实验组染色更强、钙结节更多（P <0.05，图2C~E）。这一结果提示，在体外成骨诱导分化中，DOX可促进MC3T3⁃E1细胞的成骨分化功能。

2.3 qPCR检测DOX对MC3T3⁃E1细胞相关成骨基因的影响

MC3T3⁃E1 细胞经成骨诱导 21 d 后，提取总 RNA 后利用 qPCR 检测相关成骨基因 OCN、Runx2 的相对表达量。与阴性对照组对比，诱导组及 10 mg/L DOX实验组，相关成骨基因均上调，说明成骨诱导成功，但诱导组与实验组间比较，无统计学差异（图3），这提示在成骨诱导的21 d，有DOX与无 DOX组的OCN和Runx2的mRNA水平无差异。

2.4 DOX处理MC3T3⁃E1细胞后，N⁃cadherin、p⁃MEK、 p⁃ERK蛋白的表达情况

用5、10 mg/L 的DOX 分别处理MC3T3⁃E1细胞 2 d，Western blot 法检测 N ⁃cadherin 蛋白的表达情况。结果发现，与对照组比较，不同浓度DOX处理 MC3T3⁃E1细胞2 d后，其N⁃cadherin蛋白表达下降，且差异有统计学意义（P <0.05，图4A）。结合DOX 对细胞增殖和蛋白表达的影响，后续的成骨及Western blot 实验 DOX 浓度均选用 10 mg/L。随后 Western blot 法检测 p ⁃MEK、p ⁃ERK 蛋白水平后发现，与对照组比较，10 mg/L DOX处理2 d后p⁃MEK、 p ⁃ERK 蛋白表达上调，且差异具有统计学意义 （P <0.05，图4B、C）。

2.5 MEK抑制剂U0126处理MC3T3⁃E1细胞，检测 N⁃cadherin蛋白及相关通路蛋白的表达情况

为了进一步探究 DOX 是否对 MEK/ ERK 通路产生影响。用浓度为5、10 μmol/L的MEK的抑制剂 U0126处理MC3T3⁃E1细胞2 d后，Western blot检测 N⁃cadherin、p⁃ERK、p⁃MEK表达量。与对照组比较，不同浓度 U0126 处理 2 d 后 N⁃cadherin 蛋白表达上调（P <0.05，图5A）；与此同时，p⁃MEK、p⁃ERK蛋白表达下降，但5 μmol/L的U0126对p⁃ERK的抑制作用更明显（P <0.05，图5B、C），故后续实验U0126选用5 μmol/L。

2.6 U0126联合DOX处理MC3T3⁃E1细胞，检测相关目的蛋白的表达情况

用 5 μmol/L U0126 联合 10 mg/L DOX 处理 MC3T3⁃E1细胞2 d，Western blot法检测N⁃cadherin、 p⁃MEK和p⁃ERK蛋白的表达。与DOX单独处理组比较，联合处理组N⁃cadherin水平较DOX单独处理组升高，且联合处理组p⁃MEK及p⁃ERK蛋白表达较单独处理组降低（图6）。

2.7 U0126联合DOX处理MC3T3⁃E1细胞，茜素红检测MC3T3⁃E1细胞成骨分化的变化

随后的实验探索使用U0126抑制MEK/ERK 通路对DOX促进MC3T3⁃E1细胞成骨分化的作用有何影响。实验共分为5组：①阴性对照组，②阳性成骨对照组，③DOX处理组，④U0126处理组，⑤DOX联合U0126处理组。成骨诱导21 d后，阳性成骨组出现较多的红色钙结节，成不规则片状或散在分布； DOX+U0126 组，红染率低于 DOX 处理组，但高于 U0126 处理组（P <0.05，图7）。这一结果提示， MEK/ERK 通路参与 MC3T3⁃E1 细胞成骨分化的调节，而DOX通过MEK/ERK通路来调节MC3T3⁃E1细胞的成骨分化。

3 讨论

在MM细胞与骨骼微环境的相互作用过程中，肿瘤细胞可引起微环境中多种细胞和非细胞成分异常，其中成骨细胞成骨功能和分化的受损尤其明显^[2，10]。即使MM患者经有效治疗后，成骨细胞等的异常仍然存在，并且这些异常与MM细胞的耐药和复发密切相关^[4，6，11]。因此，成骨细胞的异常，不但与MM骨骼病变相关，也与MM细胞的生存、耐药等有密切关系。正因为如此，MM骨骼病变的机制和干预方法是MM基础和临床研究的重要方向。

本研究结果提示 DOX 促进前成骨细胞株 MC3T3⁃E1的体外成骨分化，并且对其N⁃cadherin的表达也有影响。既往研究报道DOX有一定的抗实体肿瘤、抑制血管生成等作用^[12-13]。另外，也有研究报道DOX促进人和大鼠成骨细胞的增生和矿物质沉积，有正性成骨作用^[14-15]，这与本研究结果类似。除了作用成骨细胞，DOX还可以通过其他机制来影响骨骼生成。例如动物实验发现，DOX可以抑制基质金属蛋白酶，减轻骨关节炎^[16]。此外，DOX 可以抑制大鼠的破骨细胞活性，有助于减少破骨细胞溶骨亢进引起骨骼破坏^[17]。在乳腺癌骨转移时，DOX 可以抑制转移灶局部破骨细胞活性及数量，改善溶骨性病变^[18]。上述结果提示，DOX可以通过多种机制阻止骨骼破坏，是一个潜在的治疗MM骨骼病变的药物。

Gomes 等^[15] 研究发现，DOX 可以作用于 Wnt 信号通路，进而影响成骨细胞的分化。而本研究发现， DOX 也可通过 MEK/ERK 信号通路影响 MC3T3⁃E1 细胞的成骨分化。多项研究发现，MEK/ERK信号通路参与成骨细胞的成骨分化的调节^[19-21]，这与本研究观察到DOX对MEK/ERK信号通路的影响及茜素红染色的结果相一致。除了参与成骨分化调节之外，有研究报道 MEK/ERK 信号通路对成骨细胞的黏附、迁移等细胞行为也有调节作用^[22]。本研究还发现，DOX 可以下调 MC3T3⁃E1 细胞株 N⁃cadherin 的表达，并且 MEK/ERK 信号通路参与 DOX 对 N⁃cadherin 下调的作用。既往研究报道 N⁃cadherin 可以与Wnt受体结合，竞争性抑制Wnt/β⁃Catenin信号通路的激活，干扰成骨细胞的成骨分化^[23]。有意思的是，N ⁃ cadherin 表达变化后，反过来还会对 PI3K/Akt、MEK/ERK和Wnt/β⁃catenin信号通路产生影响^[24-25]。所以，上述研究提示DOX处理MC3T3⁃E1 细胞株后，可以通过MEK/ERK通路下调N⁃cadherin 表达，而N⁃cadherin水平变化后，反过来也可能参与对MEK/ERK信号通路的上调作用。

综上所述，本研究以 MC3T3⁃E1 细胞株为对象证实，DOX 可以促进其成骨分化，并且下调其 N⁃cadherin 蛋白水平。另外初步的机制研究发现， MEK/ERK 信号通路在 DOX 对 MC3T3⁃E1 细胞株成骨分化和N⁃cadherin 表达的影响中起到重要作用。这提示DOX不仅可以直接杀伤MM细胞^[7-8]，还可能同时通过对骨微环境中成骨细胞的调节作用影响 MM的病理生理过程。DOX对骨微环境的影响有待进一步深入研究。

参考文献