肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝癌，全球每年 HCC 患者死亡人数超过 80 万^[1]。HCC 的发生和发展是一个多步骤的过程，涉及众多基因和相关信号通路。研究表明， Hippo 信号通路中的上游因子通过一系列激酶级联反应转录激活下游终末效应分子 Yes 相关蛋白 （yes⁃associated protein，YAP）和具有 PDZ 结合基序的转录共活化因子（transcriptional co⁃activator with PDZ⁃binding motif，TAZ），进而调控下游影响细胞增殖、上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition， EMT）以及肿瘤转移等相关基因的表达，从而在肝癌的发生和发展进程中发挥关键作用^[2]。真核细胞翻译延伸因子 1α（EEF1A）的两个亚型 EEF1A1 和 EEF1A2，通过促进氨酰基 tRNA 与核糖体 A 位点的结合，在蛋白质合成过程中对新生多肽的延伸发挥重要作用^[3]。EEF1A1 为广泛表达的蛋白，而 EEF1A2 的表达具有组织特异性。研究发现， EEF1A2 在多种肿瘤（包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌等）中高表达，并与肿瘤的发生和发展密切相关^[3-4]； EEF1A2 在肝癌组织中高表达，并可通过 EEF1A2/ PI3K/AKT 信号轴调控肝癌的发生和发展^[5-6]，但是有关 EEF1A2 在肝癌发生和发展过程中的作用方式及其机制仍然有待进一步研究。研究发现 YAP 在肝癌组织中高表达，并与肝癌的发生和发展密切相关^[7-9]，然而，目前尚不清楚 YAP 能否通过调控 EEF1A2的表达影响肝癌的发生和发展。

本研究通过 YAP 和 EEF1A2 干扰表达和过表达，建立不同迁移能力的肝癌细胞模型，阐明 YAP 通过调控EEF1A2促进肝癌细胞迁移和侵袭的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株 HepG2、SMMC7721、Hep3B、 HCCLM3、SK⁃HEP1和HEK293T细胞由本实验室保存；DMEM 培养基和胎牛血清（Gibco 公司，美国）； 100 × 青霉素/链霉素双抗、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量检测试剂盒、蛋白上样缓冲液、超敏 ECL 化学发光试剂盒（苏州新赛美生物公司）；pLent⁃U6⁃Puro载体（ViGene Biosciences 公司，美国）；pMD2.G 和 psPAX2（Addgene 公司，美国）；TRIzol（Invitrogen 公司，美国）；Lenti⁃Pac慢病毒包装试剂盒（GeneCopoeia 公司，美国）；Transwell细胞培养小室（Corning公司，美国）；HiScript Q RT SuperMix for qPCR 和 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物公司）；兔抗人EEF1A2多克隆抗体（上海爱必信生物公司）；小鼠抗人E⁃Cadherin 单克隆抗体（BD公司，美国）；兔抗人 YAP/TAZ、YAP、Snail 单克隆抗体以及HRP标记的抗兔IgG和抗小鼠IgG以及染色质靶向酶切检测（cleavage under targets and release using nuclease，CUT&RUN）试剂盒（CST公司，美国）；小鼠抗 GAPDH 单克隆抗体（上海康成生物公司）；表达 YAP 的腺病毒、表达 EEF1A2 的腺病毒以及对照腺病毒（山东维真生物科技有限公司）；靶向 YAP、 EEF1A2 的寡核苷酸引物、对照引物以及定量 PCR 引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

所有细胞常规培养于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM高塘培养基中，于37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

1.2.2 慢病毒载体的构建、包装和稳定株的筛选

合成靶向YAP（正义链序列5′⁃GATCCGCTGGTC⁃ AGAGATACTTCTTAATTCAAGAGATTAGAAGTAT ⁃ CTCTGACCAGCTTTTTTA⁃3′；反义链序列5′⁃CGCG⁃ TAAAAAAGCTGGTCAGAGATACTTCTTAATCTCTT⁃ GAATTAAGAAGTATCTCTGACCGCG⁃3′）和EEF1A2 （正义链序列 5′ ⁃ GATCCTTCACCTCCCAGGTCAT⁃ CATCCTCGAGGATGATGACCTGGGAGGTGAATTT ⁃ TTA ⁃ 3′；反义链序列 5′ ⁃ CGCGTAAAAATTCACC ⁃ TCCCAGGTCATCATCCTCGAGGATGATGACCTGG ⁃ GAGGTGAAG ⁃3′）的寡核苷酸引物以及对照引物 （正义链序列 5′⁃GATCCTGGTTTACATGTCGACTA⁃ ATTCAAGAGATTAGTCGACATGTAAACCATTTTTT ⁃ A ⁃3′；反义链序列：5′ ⁃CGCGTAAAAAATGGTTTA⁃ CATGTCGACTAATCTCTTGAATTAGTCGACATGTA⁃ AACCACG⁃3′）；分别克隆到 pLent⁃U6⁃Puro 载体的 BamHⅠ和MluⅠ位点间，经测序成功后，与pMD2.G和 psPAX2 共转染 HEK293T 细胞进行慢病毒的包装，转染 60 h 后收集细胞上清并用 0.45 μm 的滤器过滤；使用慢病毒液分别感染 SMMC7721 和 SK⁃HEP1肝癌细胞后，采用嘌呤霉素筛选14 d获得稳定细胞株。

1.2.3 实时定量PCR（real⁃time quantitative PCR，RT⁃ qPCR）检测相关基因的mRNA表达水平

TRIzol 试剂盒提取对数生长期的各组细胞的总 RNA 后，采用 HiScript Q RT SuperMix for qPCR 试剂盒和 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒分别进行逆转录和qPCR。qPCR反应条件：95℃ 5 min 预变性；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40 个循环。 EEF1A2 的上游引物序列为 5′⁃GGACCATTGAGAA GTTCGAGA⁃3′，下游引物序列为 5′⁃AGCACCCAG⁃ GCATACTTGAA ⁃ 3′；Snail 的上游引物序列为 5′ ⁃ AATCGGAAGCCTAACTACAGCG⁃3′，下游引物序列为 5′⁃GT CCCAGATGAGCATTGGCA⁃3′；E⁃cadherin 的上游引物序列为5′⁃CAAGTGACC ACCTTAGAG⁃3′，下游引物序列为 5′⁃GAATTTGCAATCCTGCTT⁃3′； GAPDH 上游引物序列为 5′ ⁃GCACCGTCAAGGCT⁃ GAGAAC⁃3′，下游引物序列为5′⁃TGGTGAAGACGC⁃ CAGTGGA⁃3′。使用 LightCycler^®96 软件进行数据分析，以GAPDH为内参，按照2^-ΔΔCt方法计算出目的基因的相对表达量。

1.2.4 Western blot检测相关基因的蛋白表达水平

采用 RIPA 裂解液提取各组细胞中的总蛋白， BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量、变性后进行 SDS⁃PAGE，样品转膜至PVDF膜上，采用5%的脱脂奶粉封闭后与相应的一抗于4℃孵育过夜；加入相应二抗室温孵育后，滴加 ECL 发光液，于全自动化学发光仪成像。

1.2.5 细胞迁移与侵袭实验

实验按文献^[10] 的方法进行，简要过程如下：选择血清饥饿过夜后的各组细胞，制备细胞悬液； 细胞计数后，用不含胎牛血清的 DMEM 培养基将 SMMC⁃7721 细胞调整为 1.5×10⁵ 个/mL，SK⁃HEP1 细胞调整为 1.0×10⁵ 个/mL；分别取 200 μL 的上述细胞悬液接种到预先铺有 Matrigel 或未铺 Matrigel 的 Transwell 小室中，然后将 Transwell 小室放入含 600 μL完全培养基的Transwell下室中，于37℃继续培养24 h。取出Transwell小室置于4%多聚甲醛固定液中室温固定后，用棉签拭去小室内侧的细胞，采用结晶紫染液染色迁移和侵袭的细胞，于倒置相差显微镜下观察并统计迁移和侵袭的细胞数。

1.2.6 CUT&RUN⁃qPCR实验

CUT&RUN 试剂盒为美国 CST 公司产品，按照试剂盒操作说明书操作。简要过程如下： SMMC7721 细胞与磁珠孵育后，加入兔抗人 YAP 单克隆抗体与细胞中 YAP 结合，与二抗孵育后加入 Protein A/G⁃Tn5 转座体与抗体结合后，再加入 Mg²⁺ 激活转座体，使得DNA片段化，提取DNA进行 qPCR 验证，qPCR 上游引物序列为 5′⁃CATGGTGC⁃ GCCCAGGAG ⁃ 3′，下游引物序列为 5′ ⁃ GGCCT⁃ CAGGGTGGAAATCTG⁃3′。分别计算 YAP 抗体和 IgG富集后扩增的DNA占输入染色质的比值，实验结果用YAP抗体富集的DNA与IgG富集的DNA的倍数表示。

1.3 统计学方法

应用软件SPSS19.0和Excel 2013对数据进行分析，数据采用均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用t检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YAP和EEF1A2对不同迁移能力的肝癌细胞迁移和侵袭的影响

通过查阅癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库（http：//gepia.cancerpku.cn/index. html）分析 EEF1A2 在肝癌组织以及癌旁组织中的表达，结果显示 EEF1A2 在肝癌组织中的 mRNA 水平显著高于癌旁组织（P <0.01，图1A）。Western blot 法检测不同迁移能力的肝癌细胞系（低迁移能力的 HepG2、SMMC7721 和 Hep3B 细胞系以及高迁移能力的HCCLM3和SK⁃HEP1细胞系）中YAP/TAZ 和 EEF1A2 的表达，结果显示 YAP/TAZ 和 EEF1A2 在高迁移能力的肝癌细胞 HCCLM3 和 SK⁃HEP1 中的表达均高于低迁移能力的肝癌细胞 HepG2、 SMMC7721 和 Hep3B（图1B），该结果表明 YAP/ TAZ 和 EEF1A2 的表达可能与肝癌细胞的迁移能力相关。

为了研究YAP和EEF1A2对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，本研究制备干扰 YAP 表达和干扰 EEF1A2 表达的重组慢病毒以及对照慢病毒，分别感染低迁移能力的SMMC⁃7721细胞和高迁移能力的SK⁃HEP1细胞，采用嘌呤霉素筛选2周后，建立了稳定干扰表达细胞模型；其次，通过在SMMC7721和 SK⁃HEP1 细胞中分别感染表达 YAP、EEF1A2 的腺病毒，构建了YAP和EEF1A2过表达的肝癌细胞模型；采用Western blot 方法进行基因表达鉴定，结果如图1C、D 可见，与干扰对照组（NC1）相比，敲低 YAP（KD⁃YAP）和 EEF1A2（KD⁃EEF1A2）均显著降低 SMMC ⁃ 7721 细胞和 SK ⁃ HEP1 细胞中 YAP 和 EEF1A2表达；与过表达对照组（NC2）相比，过表达 YAP（OE⁃YAP）和 EEF1A2（OE⁃EEF1A2）均显著上调细胞中YAP和EEF1A2表达。该结果表明，本研究成功建立了YAP和EEF1A2干扰和过表达的肝癌细胞模型，可用于后续实验研究。

基于YAP和EEF1A2在肝癌中高表达^[5-9]，本研究进一步利用 Transwell 细胞迁移和侵袭实验观察干扰 YAP 和 EEF1A2 表达对低迁移能力的 SMMC7721细胞和高迁移能力的SK⁃HEP1细胞迁移和侵袭的影响。结果显示，与各自对照组细胞相比，干扰YAP表达和干扰EEF1A2表达均可以显著抑制 SMMC7721 细胞和 SK⁃HEP1 细胞的迁移和侵袭（图2A、B，YAP 干扰表达细胞与各自对照组迁移和侵袭的相对细胞比例：SMMC7721 细胞为 0.663 ± 0.110 vs.1.002 ± 0.067 和 0.603 ± 0.156 vs.1.004 ± 0.117；SK ⁃ HEP1 细胞为 0.665 ± 0.153 vs.1.003 ± 0.094 和 0.637 ± 0.147 vs.1.007 ± 0.125。干扰EEF1A2表达细胞与各自对照组迁移和侵袭的相对细胞比例：SMMC7721 细胞为 0.563 ± 0.131 vs.1.006 ± 0.088 和 0.561 ± 0.102 vs.1.004 ± 0.065； SK ⁃HEP1 细胞为 0.549 ± 0.132 vs.1.002 ± 0.117 和 0.479 ± 0.162 vs.1.001 ± 0.127；P <0.05）。该结果表明，YAP 和 EEF1A2 在肝癌细胞迁移和侵袭过程中发挥重要调控作用。

2.2 YAP 对肝癌细胞中 EEF1A2 及 EMT 相关基因表达的影响

本课题组前期建立了Hippo通路下游效应分子 YAP和TAZ干扰表达的SMMC7721细胞模型，并通过 RNA 测序（RNA ⁃ sequencing，RNA ⁃ seq）对干扰 YAP、TAZ 和空载对照的 SMMC7721 细胞进行了转录组分析^[11]。本研究进而对干扰 YAP 和 TAZ 所得的差异表达基因取交集，发现有432个重叠基因（图3A）；基因功能富集分析显示，这些重叠基因参与调控细胞迁移、细胞运动和细胞增殖（图3B），其中包括 EEF1A2 以及与 EMT 相关的 SNAIL 和 CDH1 等。为了证实YAP对EEF1A2、SNAIL和CDH1表达的影响，我们首先采用 RT ⁃ qPCR 验证了 YAP 对 SMMC7721 细胞中 EEF1A2、Snail（SNAIL 的表达产物）和E⁃cadherin（E⁃CAD，CDH1的表达产物）mRNA 水平的影响，检测结果与RNA⁃seq结果相一致，YAP 干扰表达可以下调EEF1A2和Snail的mRNA水平，上调E⁃CAD的mRNA水平（图3C，YAP干扰和过表达的 SMMC7721 细胞与各自对照组细胞中 EEF1A2、E⁃cadherin 和 Snail 的 mRNA 相对表达量： EEF1A2为0.521±0.150vs.1.001±0.083和1.482±0.182 vs.1.053 ± 0.093；E ⁃ cadherin 为 1.651 ± 0.192 vs.1.002 ± 0.113 和 0.522 ± 0.202 vs.1.113±0.103；Snail 为 0.581 ± 0.173 vs.1.013±0.103 和 1.723±0.282 vs.1.016 ± 0.073，P <0.05）；其次，应用建立的 YAP 干扰和过表达的 SMMC⁃7721 和 SK⁃HEP1 肝癌细胞模型，通过 Western blot 方法检测了 YAP 干扰和过表达对细胞中 EEF1A2、Snail 以及 E⁃CAD 蛋白表达水平的影响，检测结果与 RT⁃qPCR 验证结果相一致，干扰 YAP 表达可以下调 EEF1A2 和 Snail，上调 E ⁃CAD，而 YAP 过表达则可以上调 EEF1A2 和Snail，下调E⁃CAD（图3D、E）。上述实验结果表明， YAP可以调控肝癌细胞中EEF1A2的表达。为了探究YAP是否通过转录调控EEF1A2的表达，进一步开展了 CUT&RUN 结合 qPCR 实验，由图3F 可见， EEF1A2基因的启动子序列可以被抗YAP的单克隆抗体富集（细胞中 EEF1A2 启动子的 Anti ⁃YAP 与 IgG的相对富集量为6.501 ± 1.250 vs.1.001 ± 0.101， P <0.01），该结果证实 YAP 可以与 EEF1A2 基因的启动子序列结合，促进EEF1A2的表达。此外，本研究进一步采用 Western blot 方法检测了 EEF1A2 干扰和过表达对SMMC⁃7721和SK⁃HEP1细胞中EMT 相关的 Snail 和 E⁃CAD 表达的影响，结果显示干扰 EEF1A2 可以下调细胞中 Snail、上调 E ⁃CAD 的水平，而 EEF1A2 过表达则可以上调细胞中 Snail、下调E⁃CAD（图3G、H），该结果表明EEF1A2可以调控肝癌细胞的EMT进程。

2.3 YAP通过EEF1A2调控肝癌细胞的迁移和侵袭

为了研究YAP是否可以通过促进EEF1A2表达进一步调控肝癌细胞的迁移和侵袭，本研究分别在干扰 YAP 表达的 SMMC7721 和 SK⁃HEP1 细胞中联合过表达 EEF1A2、在 YAP 过表达的 SMMC7721 和 SK ⁃HEP1 细胞中联合干扰 EEF1A2 表达后，利用 Transwell 细胞迁移和侵袭实验观察了细胞迁移和侵袭能力的改变。Transwell 细胞迁移和侵袭实验结果由图4 可见，与干扰 YAP 表达细胞组相比， EEF1A2 过表达可以显著促进干扰 YAP 表达的 SMMC⁃7721和SK⁃HEP1细胞的迁移和侵袭（在干扰 YAP表达的细胞中过表达EEF1A2与干扰YAP表达细胞组迁移和侵袭的相对细胞比例：SMMC7721细胞为1.450 ± 0.181 vs.1.002 ± 0.112和1.374 ± 0.224 vs.1.004 ± 0.059；SK⁃HEP1 细胞为 1.411 ± 0.157 vs.1.003 ± 0.101 和 1.419 ± 0.224 vs.1.001 ± 0.105；与YAP 过表达细胞组相比，干扰 EEF1A2 表达可以显著抑制YAP过表达的SMMC⁃7721和SK⁃HEP1细胞的迁移和侵袭（在过表达 YAP 的细胞中干扰 EEF1A2表达后与YAP过表达细胞组迁移和侵袭的相对细胞比例：SMMC7721 细胞为 1.246 ± 0.133 vs.1.519 ± 0.221 和 1.312 ± 0.163 vs.1.538 ± 0.201； SK ⁃HEP1 细胞为 1.318 ± 0.155 vs.1.631 ± 0.213 和 1.250 ± 0.217 vs.1.683 ± 0.211，P <0.05）。该研究结果提示YAP可以通过上调EEF1A2而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

3 讨论

人类的EEF1A主要通过与氨酰基tRNA结合并将其携带到核糖体上，在蛋白质翻译过程中对新生多肽的延伸发挥重要调控作用。在 EEF1A 的两个亚型中，EEF1A1 在人类组织中广泛表达，而 EEF1A2 表达仅限于心脏、骨骼肌、大脑等组织，具有明显的组织特异性^[12]。人类的EEF1A2基因定位于 20q13，研究表明，EEF1A2 在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝癌等多种肿瘤中高表达，并与这些肿瘤的发生、发展以及患者的生存期密切相关^{[3-6，13-15]}。尽管有研究显示，EEF1A2可以通过激活 PI3K/AKT 信号通路，调控肌动蛋白细胞骨架重塑，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，并证实 EEF1A2/PI3K/AKT 信号轴在肝癌的发生和发展进程中发挥重要的调控作用^[4-6]，但是有关EEF1A2的自身表达调控以及相关作用机制尚不明确。

本研究首先通过查阅 TCGA 数据库，分析了 EEF1A2 在肝癌以及癌旁组织中的表达，结果显示 EEF1A2 在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，提示EEF1A2可能参与调控肝癌的发生和发展。其次，本研究采用Western blot方法检测了不同迁移能力的肝癌细胞系（低迁移能力的HepG2、SMMC7721 和 Hep3B 以及高迁移能力的 HCCLM3 和 SK⁃HEP1 细胞）中YAP和EEF1A2的表达差异，结果显示YAP 和EEF1A2在高迁移能力的肝癌细胞中表达高于低迁移能力的肝癌细胞，提示YAP和EEF1A2的表达可能与肝癌细胞的迁移能力相关。有关 YAP 干扰表达和过表达对肝癌细胞迁移和侵袭影响的研究已经有相当多研究报道^[16-20]，本研究重点围绕YAP 能否通过调控EEF1A2的表达而促进肝癌细胞迁移和侵袭开展了进一步探究。基于YAP和EEF1A2在肝癌组织中高表达^[5-9]，本研究首先选择低迁移能力的肝癌细胞SMMC⁃7721和高迁移能力的肝癌细胞SK⁃HEP1为研究对象，建立了慢病毒介导的稳定敲低 YAP 和敲低 EEF1A2 的细胞模型，采用 Transwell 细胞迁移和侵袭实验分别检测了干扰 YAP 和 EEF1A2 表达对肝癌细胞迁移和侵袭的影响，结果表明干扰YAP和EEF1A2表达均可以显著降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力。

课题组前期分别建立了稳定敲低 YAP 和敲低 TAZ 的 SMMC7721 细胞模型，采用 RNA⁃seq 分析了敲低YAP和敲低TAZ的细胞中转录组的改变，通过对二者差异表达基因取交集，发现两组差异表达基因的重叠基因中，除了已经被证明受YAP/TAZ调控的与 EMT 相关的 Snail 和 E⁃CAD 外^{[11，16，21]}，还包括 EEF1A2。本研究采用RT⁃qPCR和Western blot方法检测显示、干扰YAP表达可以下调EEF1A2，而YAP 过表达则可以上调 EEF1A2，提示 YAP 可以调控 EEF1A2 的表达。基于 Hippo 通路的下游效应分子 YAP 作为转录共活化因子可以调控相关基因的表达而促进肿瘤的发生和发展^[19，22]，本研究进一步利用 CUT&RUN ⁃ qPCR 实验证实了 YAP 可以与 EEF1A2 基因的启动子序列结合。CUT&RUN 实验主要用于验证及探寻特定蛋白质和DNA的特定序列的直接相互作用，应用于研究转录调控以及组蛋白修饰调控。与传统的染色质免疫沉淀技术 （chromatin immunoprecipitation，ChIP）相比，该技术的优点表现在所需要的细胞样品量低、无需交联、超声打断、背景信号低和重复性好等，近年来已经被研究者广泛使用^[23]。上述研究结果表明，YAP可以通过与EEF1A2的启动子结合而调控EEF1A2的表达。同时，本研究结果显示，EEF1A2 可以上调 SMMC⁃7721 和 SK⁃HEP1 细胞中 EMT 相关的 Snail、下调 E⁃CAD，该结果提示 EEF1A2 可能通过调控肝癌细胞中 EMT 相关基因的表达，进一步促进肝癌细胞的迁移和侵袭。为了探究 YAP 能否通过调控 EEF1A2 的表达而促进肝癌细胞的迁移和侵袭，本研究通过在 YAP 干扰和过表达的 SMMC7721 和 SK⁃HEP1肝癌细胞中分别联合过表达EEF1A2或干扰 EEF1A2 表达后，采用 Transwell 实验检测了细胞迁移和侵袭的改变，明确了 YAP 可以通过 EEF1A2 促进肝癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述，本研究结果表明，EEF1A2在肝癌组织中高表达，YAP 和 EEF1A2 与肝癌细胞的迁移能力相关；YAP 可以与 EEF1A2 基因的启动子序列结合，调控EEF1A2的表达，进一步促进肝癌细胞的迁移和侵袭。本研究结果可以进一步完善我们对YAP 和 EEF1A2 参与肝癌转移调控的理解，有可能为抗肝癌转移提供新的治疗靶标。

参考文献