氧化应激损伤是造成急性和慢性肾损伤的重要机制之一。人体正常的生物代谢会产生超氧阴离子自由基、过氧化氢等活性氧（reactive oxygen species，ROS），体内完善的抗ROS 系统能及时将多余的ROS清除，较低水平的ROS对肾小管和微循环的生理调节有积极作用^[1]；但是在受到各种病原体或炎症因子刺激时，肾小管细胞中氧化还原状态调控失衡，造成 ROS 在肾组织蓄积、细胞膜损伤和超氧阴离子渗漏，最终导致肾损伤^[2]。以氧化应激为治疗靶点已经成为肾损伤治疗的热点。

Caspase⁃3 介导的线粒体途径凋亡是经典的细胞凋亡通路。有研究指出，氧化应激损伤和caspase⁃3 介导的线粒体途径细胞凋亡存在关联^[3-4]。我们在前期研究中发现，H₂O₂处理的人肾小管上皮细胞 HK⁃2中氧化应激水平升高，细胞增殖受到抑制、细胞凋亡增多；而caspase⁃3抑制剂能降低H₂O₂处理后肾小管细胞ROS水平，对氧化应激引起的细胞损伤有改善作用，说明肾小管上皮细胞的氧化应激损伤具有caspase⁃3依赖性，抑制caspase⁃3途径的细胞凋亡对 ROS 引起的脓毒症肾小管上皮细胞损伤有一定保护作用^[5]。Kaleem 等^[6] 指出，caspase 的释放受细胞中超氧阴离子浓度的调节。但是目前对肾小管上皮损伤中ROS 和caspase⁃3途径细胞凋亡的研究还较少，caspase⁃3 对 ROS 的调控是直接起作用，还是引起了其他基因、蛋白或通路的变化？除了线粒体⁃caspase 途径介导细胞凋亡，其他凋亡通路是否也参与其中？这些问题目前尚不清楚。

本研究拟利用芯片测序，对caspase⁃3抑制剂处理的氧化应激状态下肾小管上皮细胞转录组进行分析，筛选 caspase⁃3 抑制剂引起的差异表达基因 （differentially expressed gene，DEG），对DEG进行GO 分析和KEGG富集分析，对筛选出的关键基因进行生物学验证，深入探讨和揭示caspase⁃3调控ROS损伤肾小管上皮细胞的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞HK⁃2（上海中科院典型培养物保藏中心）。Ac⁃DEVD⁃CHO（上海碧云天生物技术有限公司）、VigoFect 转染试剂盒（北京威格拉斯生物技术有限公司）、TRIzol 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）、SuperReal PreMix Plus（北京天根生化科技有限公司）、MTT试剂盒（南京建成生物工程研究所）、细胞凋亡试剂盒（BD公司，美国）、Western blot一抗 （ABI公司，美国）、Western blot二抗（上海优宁维生物科技股份有限公司）。荧光定量 PCR 仪（ABI 公司，美国）、凝胶成像系统（Bio⁃Rad公司，美国），流式细胞仪（Beckman公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 芯片样本制备

本研究利用H₂O₂诱导HK⁃2细胞建立氧化应激状态，通过酶生化法检测 HK⁃2 细胞内的抗氧化指标的含量：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和丙二醛（malonic dialdehyde，MDA），验证模型是否成功。将对数生长期的人肾小管上皮细胞 HK⁃2 接种在直径 90 mm 的细胞培养皿，用终浓度为 300 μmol/L 的 H₂O₂处理 6 h后，随机分为对照组（不做处理）和caspase⁃3 抑制剂组（Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L），各组设置 3 个独立样本，将样本送公司完成测序及分析。

1.2.2 DEG的筛选

本次所用测序平台为 Illumina Hiseq 2500， 100PE。用 R 软件 Affy 包（Version：R3.4.0）的 RMA 法通过质控标准过滤去除原始数据中的接头序列、低质量数据和未检出碱基等无效数据，得到有效数据；将原始图像数据转化为序列数据。用 R 语言的 Limma 包^[7] 分析各组基因表达，采用随机方差 t 检验筛选差异基因，计算 P 值并多重检验进行校正，将校正后的 P 值由小到大排列，同时满足 |log₂FC（fold change）|≥ 2 和校正 P 值 <0.05 的基因为差异表达基因。用完全链接聚类法（complete⁃ linkage clustering）对差异基因进行聚类分析，用 pheatmap 包绘制热图，用ggplot2包做火山图。

1.2.3 GO分析和KEGG通路富集分析

用DAVID数据库^[8] 对筛选出的DEG进行GO通路^[9] 和KEGG通路^[10] 富集分析。当通路上的差异基因数>2个，且矫正后的P <0.05时，认为富集结果有统计学意义。

1.2.4 候选基因的定量PCR验证

用TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA，反转录为cDNA后，以其为模板，用荧光定量PCR仪，用 SuperReal PreMix Plus 进行定量PCR反应，20 μL总体系中包含2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，50×ROX Reference DyeⅡ 2 μL，cDNA 2 μL，用灭菌去离子水补足体积。定量 PCR 引物序列见表1。扩增程序为：95℃ 15 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 32 s，共进行36个循环； 4℃ 10 min。以5批独立cDNA为模板，每组设3个复孔，以 GAPDH 为内参基因。根据内参基因和候选基因的C_T值，用ΔΔC_T法进行基因表达的相对定量分析。

1.2.5 CTNNB1表达载体转染HK⁃2细胞

将 HK ⁃2 细胞接种到 6 孔板中，以铺满板底 40％密度为宜，用终浓度为 300 μmol/L 的 H₂O₂处理 6 h 后，将细胞随机分组：对照组（不做处理）、 caspase⁃3 抑制剂组（Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L）、 CTNNB1 组[pcDNA3.1（+）⁃CTNNB1]、caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1 组[Ac⁃DEVD⁃CHO，15 μmol/L+pcD⁃ NA3.1（+）⁃CTNNB1]以及caspase⁃3抑制剂+CTNNB1 NC 组[Ac⁃DEVD ⁃CHO，15 μmol/L+pcDNA3.1（+）⁃ CTNNB1 NC]。转染前1 h更换新鲜培养基，用VigoFect 转染试剂盒，根据操作说明进行转染，将细胞放回培养箱培养，6 h后更换新鲜完全培养基。48 h后收集细胞检测转染效率。

1.2.6 细胞增殖和凋亡检测

将 HK⁃2 细胞按 1×10³ 个/孔接种到 96 孔板，根据不同分组给予相应处理，在第 0 h 和第 48 h，向每孔各加入 20 μL MTT 溶液，放在培养箱中培养 4 h，取出用酶标仪检测 490 nm 的吸光度，换算成存活率，并以时间为横坐标，存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线。将 HK⁃2 细胞制成 1×10⁵ 个/mL 悬液，并加入 100 μL 至流式管中，分别加入 20 μL Annexin⁃FITC 和 PI 染料，避光孵育 20 min 后，加入 500 μL PBS，用涡旋仪震荡混匀后，流式细胞仪检测凋亡细胞百分数。

1.2.7 Western blot检测

胰蛋白酶消化并收集各组 HK⁃2 细胞，提取总蛋白，用BCA蛋白定量后，加入1×上样缓冲液煮沸蛋白 5 min。先用 80 V 恒压电泳 20 min，再 120 V 恒压电泳 90 min；用硝酸纤维素薄膜 90 V 恒压转膜120 min。用5％脱脂奶粉封闭蛋白膜2 h，分别用 1∶1 000稀释的一抗4℃孵育过夜和用1∶500稀释的二抗溶液室温孵育45 min；洗膜后，用显影剂显影并用凝胶成像系统记录分析蛋白条带。

1.2.8 细胞ROS检测

胰蛋白酶消化并收集各组HK⁃2细胞，将细胞制成1×10⁵ 个/mL的单细胞悬液，向流式细胞管中加入100 μL 细胞悬液，再加入5 μmol/L DHE，室温避光孵育 30 min，用 PBS 洗涤后，流式细胞仪检测 ROS。

1.3 统计学方法

数据分析用SPSS 17.0软件，服从正态分布的计量资料统一表示为均数 ± 标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$），两组间比较用独立样本 t 检验，多组间比较用单因素方差分析（One ⁃ Way ANOVA），组间两两比较采用 LSD 法。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H₂O₂干预后HK⁃2细胞SOD、CAT和MDA的表达变化

由图1可见，H₂O₂处理后的HK⁃2细胞的SOD和 CAT 水平分别为（23.07±1.62）kU/g 和（1.28±0.10） kU/g，较正常 HK ⁃2 细胞的 SOD 和 CAT 水平降低 （P <0.05），MDA 水平为（33.18±2.16）μmol/g，较正常HK⁃2细胞升高（P <0.05），说明H₂O₂干预成功诱导了细胞的氧化应激状态。

2.2 差异基因筛选

统计结果如图2所示，在对照组和caspase⁃3抑制剂组中共筛选出185个DEG，聚类热图和火山图见图2A、B。筛选出的显著性最高的前10位差异表达基因依次为FIS1、SOX18、EZR、SPARC、COL7A1、 SNRPB、RPL5、MAP4、CEBPB和CTNNB1。

2.3 差异基因的GO通路和KEGG通路富集分析

GO 注释表明，DEG 的功能主要集中在细胞成分的形态发生、胚胎器官形态发生、细胞内受体介导的通路、线粒体形态发生等生物学过程（biological process，BP），微管组织中心、细胞外基质成分、胶原蛋白三聚体、核糖核蛋白复合物等细胞组分 （cell constitutes，CC），以及结构分子活性、氨基酸跨膜转运蛋白活性等分子功能（molecule function， MF）（表2）。KEGG通路富集分析显著性排名前5的条目包括 RAC1 信号通路、RNA 代谢通路、RhoA 信号通路、糖尿病途径和细胞蛋白的凋亡裂解通路 （表3）。

2.4 候选基因的定量PCR验证

由图3可见，显著性排名前10的DEG中，FIS1、 EZR、COL7A1、RPL5、MAP4、CEBPB 和 CTNNB1 mRNA 在对照组细胞中高表达（P 均 <0.05）， SNRPB mRNA 在对照组细胞中低表达（P <0.05），与芯片结果一致。

2.5 CTNNB1 对 caspase⁃3 抑制剂处理的氧化应激状态HK⁃2细胞增殖和凋亡的影响

由图4A 可见，对照组、caspase ⁃3 抑制剂组、 CTNNB1组、caspase⁃3抑制剂+CTNNB1组和caspase⁃3 抑制剂 + CTNNB1 NC 组的细胞增殖率为分别 （125.20±5.24）%、（166.21±3.85）%、（116.43±3.08）%、 （140.27±7.31）%和（170.45±8.23）%。结果显示， caspase⁃3 抑制剂组增殖率高于对照组（P <0.05）； CTNNB1组增殖率低于对照组（P <0.05），caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1组增殖率较caspase⁃3抑制剂组低 （P <0.05），但仍高于对照组（P <0.05）。

Caspase⁃3抑制剂组cleaved⁃caspase⁃3和cleaved⁃ PARP 蛋白水平低于对照组（P <0.05）；CTNNB1 组 cleaved⁃caspase⁃3和cleaved⁃PARP 蛋白水平高于对照组（P <0.05）；caspase ⁃ 3 抑制剂 + CTNNB1 组 cleaved ⁃ caspase ⁃3 和 cleaved ⁃ PARP 蛋白水平均较 caspase ⁃3 抑制剂组高（P <0.05），但低于对照组 （P <0.05）。对照组、caspase⁃3 抑制剂组、CTNNB1 组、caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1 组和 caspase⁃3 抑制剂+ CTNNB1 NC 组细胞的凋亡率分别为（16.35±2.45）%、（7.21±0.98）%、（22.24±1.21）%、（12.17±1.67）% 和（6.90±0.48）%。caspase⁃3 抑制剂组凋亡率低于对照组（P <0.05），CTNNB1 组凋亡率高于对照组 （P <0.05）；caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1 组凋亡率高于caspase⁃3组（P <0.05），但低于对照组（P <0.05，图4B、C）。

2.6 CTNNB1 对 caspase⁃3 抑制剂处理的氧化应激状态HK⁃2细胞ROS的影响

由图5可见，对照组、caspase⁃3抑制剂组、CTN⁃ NB1 组、caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1 组和 caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1 NC 组细胞中 ROS 平均荧光强度分别为 1 615±112、1 212±69、1 798±85、1 476±101 和 1 179±76。caspase⁃3 抑制剂组 ROS 水平较对照组降低（P <0.05），CTNNB1组ROS水平较对照组升高（P <0.05），caspase⁃3 抑制剂+CTNNB1 组细胞中 ROS 水平较 caspase⁃3 抑制剂组高（P <0.05），但仍高于对照组（P <0.05）。

3 讨论

我们在对照组和 caspase⁃3 抑制剂组中共筛选到 185 个 DEG，可见无论在 caspase⁃3 抑制剂处理还是氧化应激状态下，肾小管上皮细胞内时刻都在发生着大量复杂的生物学事件。KEGG 分析主要富集到的有 RAC1 信号通路、RNA 代谢通路、 RhoA 信号通路、糖尿病途径和细胞蛋白的凋亡裂解通路。CTNNB1 基因的编码产物——β⁃连环蛋白（β⁃catenin）是经典 Wnt 信号通路的核心组分， Wnt/β⁃catenin 通路是一条非常重要的信号通路，在人类诸多生理活动和病理过程中都有广泛的调节作用。在结肠癌中，活化 caspase⁃3 能特异性降解β⁃catenin，抑制Wnt/β⁃catenin通路诱导的细胞凋亡^[11]；而抑制Wnt/β⁃catenin通路信号能加速H₂O₂诱导的成纤维细胞凋亡^[12]。

H₂O₂诱导ROS依赖的信号转导能抑制β⁃catenin 下游转录因子的活性^[13]。在恶性肿瘤中存在 β ⁃catenin 信号转导和 ROS 积累的复杂相互作用。可见，β⁃catenin和氧化应激存在关联。β⁃catenin 参与了RAC1信号通路和RhoA信号通路，过度激活的 RACl 参与了氧化应激和炎症反应过程，而 RhoA 通路也能激活 Nox4，通过产生 ROS 产物引起氧化应激，都从侧面印证了β⁃catenin 与氧化应激的关系。Wnt/β⁃catenin 通路与肾脏疾病的关系已经有大量研究，Zhou 等^[14] 报道 Wnt/β⁃catenin 能将氧化应激与肾足细胞损伤和蛋白尿联系起来。考虑到 Wnt/ β ⁃catenin 通路在人类疾病中的重要作用、 β⁃catenin与氧化应激的关系，以及芯片和定量PCR 结果都证实了其在H₂O₂处理的HK⁃2细胞中异常表达，提示β⁃catenin可能参与氧化应激状态下肾小管细胞损伤，值得更多研究。

我们关注的重点是β⁃catenin 对 ROS 和线粒体途径的细胞凋亡之间的调控。用 Ac⁃DEVD⁃CHO 联合 H₂O₂处理 HK⁃2 细胞，细胞中 ROS 水平较对照组降低，提示H₂O₂诱导的氧化应激具有一定的caspase⁃ 3依赖性，抑制caspase⁃3能部分减弱HK⁃2细胞的氧化应激损伤。细胞生物行为检测显示，caspase⁃3抑制剂联合H₂O₂处理的HK⁃2细胞增殖率较对照组升高，凋亡率降低，且凋亡蛋白水平降低，说明氧化应激对肾小管细胞增殖和凋亡的作用具有 caspase⁃3 依赖性，caspase⁃3抑制剂能逆转氧化应激对肾小管细胞的增殖和凋亡的效应。用CTNNB1表达载体转染细胞后，caspase⁃3抑制剂+CTNNB1组细胞增殖率较 caspase⁃3 抑制剂组低（P <0.05），说明 β⁃catenin 对caspase⁃3抑制剂促进氧化应激状态下肾小管上皮细胞增殖有抑制作用；而细胞凋亡率高于caspase⁃3 抑制剂组，β⁃catenin能部分抵消caspase⁃3抑制剂对氧化应激状态下肾小管上皮细胞凋亡的抑制作用。caspase⁃3抑制剂+CTNNB1组细胞的ROS水平较 caspase⁃3 抑制剂组高（P <0.05），表明 caspase⁃3 抑制剂能降低 H₂O₂诱导的 HK⁃2 细胞氧化应激水平，而β⁃catenin对这一效应有一定逆转作用。我们也观察到，caspase⁃3抑制剂+CTNNB1组细胞的增殖能力减弱，而凋亡增强，但与对照组相比仍有差异，提示除了β⁃catenin，caspase⁃3途径对氧化应激状态下肾小管上皮的效应可能还有其他作用途径。

除了CTNNB1，我们还筛选到了其他一些基因可能与caspase⁃3途径调控ROS，参与氧化应激所致肾小管上皮损伤有关。线粒体分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，FIS1）主要调控线粒体融合蛋白和视神经萎缩蛋白。FIS1 主要定位在细胞线粒体外膜，能促进线粒体分裂，抑制线粒体融合，造成动力学平衡破坏，形成小球或小泡状的异常形态结构，线粒体嵴不清或消失，导致细胞的线粒体受损；呼吸链断裂会导致钙离子内流和氧自由基形成，加重氧化应激损伤^[15]。降低大鼠肺泡巨噬细胞中线粒体的 FIS1 水平，能抑制内毒素所致的肺泡内巨噬细胞凋亡，减轻氧化应激和炎症反应^[16]。虽然目前尚未见 FIS1 在肾小管上皮氧化应激的研究，但以上结果都提示 FIS1 与氧化应激状态下的肾小管上皮细胞损伤有关。EZR基因编码埃兹蛋白Ezrin，主要参与细胞骨架重组、细胞内信号转导，并与细胞存活、黏附、迁移等有关，在肿瘤发生发展和转移中有重要作用^[17]。目前尚未见EZR 与氧化应激或肾小管损伤的相关报道。有研究报道，糖体蛋白 L5（ribosomal protein L5，RPL5）突变与先天性纯红细胞再生障碍性贫血有关，并会增加癌症的发病风险^[18]。小核核糖核蛋白肽 B 和 B1（small nuclear ribonucleoprotein polypeptides B and B1，SNRPB），负责参与对前mRNA的选择性剪接，通过剪接复合体的核心成分，调控细胞的增殖、凋亡和活性^[19]。选择性剪接能参与基因调控、细胞分化和内环境平衡等，导致肌萎缩等的发生，其与肿瘤的关系受到较多关注，但是RPL5和SNRPB 在脓毒症肾损伤或与氧化应激之间的关系均未见报道。微管相关蛋白 4（microtubule⁃associated protein 4，MAP4）的 C⁃末端的微管结合域磷酸化对细胞周期有重要的调控作用^[20]。近来一些研究发现，MAP4 与肿瘤的过程有关^[21-22]，但与肾小管氧化应激损伤无报道。转录因子 CCAAT 增强结合蛋白β（CCAAT enhancer ⁃ binding protein β，CEBPB）在多种人类实体肿瘤和血液肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生发展关系密切^[23-25]。 CEBPB主要通过对胞外信号分子产生应答，进而实现对靶基因水平的调节，是一种对细胞增殖、分化、凋亡、周期等过程有调控作用的转录因子；还参与炎症、能量代谢等过程^[26-27]。但目前也未见与氧化应激的报道。这些新的差异基因的筛选和鉴定为后续深入探讨caspase⁃3调控ROS 损伤肾小管上皮细胞的机制提供目标靶点。

综合以上，本研究通过基因芯片，筛选到185个在H₂O₂处理的肾小管上皮细胞和caspase⁃3抑制剂结合 H₂O₂处理的肾小管上皮细胞中差异表达的基因，对显著性排名前10的基因进行定量PCR验证，证实了 FIS1、EZR、COL7A1、RPL5、MAP4、CEBPB、 CTNNB1 和 SNRPB mRNA 表达水平与芯片结果一致。利用CTNNB1表达载体转染细胞，结合细胞生物学行为分析，证明了氧化应激对肾小管细胞的增殖和凋亡的作用具有caspase⁃3依赖性，而CTNNB1 可能参与了 caspase⁃3 依赖的氧化应激对肾小管上皮细胞的损伤作用。

参考文献