替格瑞洛是一种新型抗血小板聚集药物，无需通过肝脏代谢活化，可直接抑制血小板 P2Y12 受体，减少ADP的结合位点^[1]。大量研究表明，与氯吡格雷相比，替格瑞洛能显著降低急性冠脉综合征 （acute coronary syndrome，ACS）患者的病死率^[2]。因此，替格瑞洛目前已成为指南推荐的ACS抗血小板聚集首选药物^[3]。

有研究者认为替格瑞洛改善 ACS 患者预后不单纯依赖其强效的抗血小板聚集作用^[4]。血管内皮功能障碍在冠心病的发生发展中起着重要的作用，有研究发现替格瑞洛可能还具有改善血管内皮功能的作用，但具体机制尚未明确^[5-6]。p16基因是一种调控细胞周期的重要基因，其编码产物p16蛋白直接调控细胞周期 G1~S 转换，负调节细胞增殖及分裂，并促进细胞凋亡和衰老^[7]。

本文研究替格瑞洛对氧化型低密度脂蛋白（ox⁃ idized low⁃density lipoprotein，ox⁃LDL）诱导血管内皮细胞损伤的保护作用，并探讨p16基因在替格瑞洛保护内皮功能中的作用及潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人内皮素1（endothelin⁃1，ET⁃1）elisa试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司）；一氧化氮（nitricox⁃ ide，NO）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；替格瑞洛（阿拉丁公司，中国）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical endothelial cell，HUVEC）、 EdU检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL底物发光液、无血清冻存液、内皮细胞培养液（苏州君欣生物科技有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（Roche 公司，美国）；Transwell 迁移小室 （Corning公司，美国）；TRIzol RNA提取试剂、逆转录试剂和Real⁃time PCR试剂（江苏康为世纪生物科技有限公司）；抗 DNMT1、p16 和β⁃Actin 抗体（Abcam 抗体，美国）；CCK⁃8检测试剂盒、基因组DNA 提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、琼脂糖胶（北京天根生化科技有限公司）；EZ DNA Methylation⁃Gold Kit 甲基化试剂盒（Zymo Research公司，美国）；Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国）；胰酶和青霉素/链霉素 （Sigma⁃Aldrich公司，美国）；全功能酶标仪、细胞培养箱（Thermo公司，美国）；生物安全柜（江苏苏净集团有限公司）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；超高速低温离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；超低温冰箱（安徽中科都菱商用电器股份有限公司）；流式细胞仪（Millipore公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 血清ET⁃1、NO含量测定

采集ACS患者双联（阿司匹林+替格瑞洛或阿司匹林+氯吡格雷）治疗前及治疗后1个月的外周静脉血 5 mL，常温下 3 000 r/min 离心 10 min，收集上清液，-80℃冰箱保存。采用 ELISA 试剂盒检测血清 ET⁃1的含量，按照NO检测试剂盒的说明书检测NO 的含量。研究经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准且研究对象知情同意（伦理批准文号： 2021NL⁃130⁃02）。

1.2.2 HUVEC培养

HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和链霉素的内皮细胞专用培养基，置于含 5% CO₂的37℃细胞培养箱中。隔天换液，于细胞密度80%左右时，胰酶消化传代、种植细胞。

1.2.3 基因过表达、敲除与细胞转染

p16 过表达构建于慢病毒载体 pcDNA⁃EGFP。 p16 DNA片段从HEK293 的cDNA中通过PCR扩增获取。PCR的反应体系如下：2 μL cDNA；10 μL 2× qPCR mixture；1 μL 上下游引物（10 μmol/L）；6 μL 无菌蒸馏水。real⁃time PCR 的反应程序如下：预变性，95℃，5 min；变性，95℃，5 s；退火，56℃，30 s；延伸，72℃，30 s；40个循环。PCR引物采购于上海捷瑞生物工程有限公司。 p16：正义 5′ ⁃ CCG⁃ GAATTCATGGGTCGCAGGTTCTTGG ⁃ 3′，反义 5′ ⁃ CGCGGATCC ⁃ CTATGCCCGTCGGTCTGG ⁃ 3′。PCR 产物连接到带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点的pcDNA⁃ EGFP载体中。

针对 DNMT1 和 p16 的特定短发夹 RNA（shDN⁃ MT1和shp16）与对照短发夹RNA（shNC）由上海Ge⁃ nePharma 设计和合成。将短发夹RNA 连接到慢病毒载体pLKO.1中AgeⅠ/EcoRⅠ位点。shDNMT1⁃1： 5′⁃GGATGAGTCCATCAAGGAAGA⁃3′；shDNMT1⁃2： 5′ ⁃GCACCTCATTTGCCGAATACA ⁃3′；shDNMT1⁃3： 5′⁃GGGCAAGCCCAAGTCCCAAGC⁃3′；shp16⁃1：5′⁃ GGGAGCAGCATGGAGCCTTCG ⁃ 3′；shp16 ⁃ 2：5′ ⁃ GCTGCCCAACGCACCGAATAG ⁃ 3′；shp16 ⁃ 3：5′ ⁃ GCAGTAACCATGCCCGCATAG⁃3′。

用Lipofectamine⁃2 000将病毒质粒转染进293T 细胞中，72 h 后收获病毒并感染 HUVEC，感染 72 h 后进行后续实验。

1.2.4 CCK⁃8法检测细胞活力

HUVEC以1×10⁴ /孔种植于96孔细胞培养板，每孔加入 10 μL CCK8 试剂，培养箱中继续培养 2 h，弃去培养液，每孔加入 200 μL DMSO，室温振荡 15 min，在酶联免疫检测仪上振荡10 s，检测450 nm 波长处的吸光值（OD 值）。统计、分析各组细胞的活力。

1.2.5 EdU法检测细胞增殖

HUVEC以5×10⁴ /孔种植于48孔细胞培养板，加入EdU，培养箱中继续培养2 h。弃去EdU，4％多聚甲醛固定 30 min，0.5％Triton X⁃100 穿透 15 min，并加入染色反应液避光孵育30 min，Hoechst染核。随机观察5个高倍视野，计数阳性染色细胞数，取平均值。统计、分析各组细胞的增殖情况。

1.2.6 Transwell法检测细胞迁移

将Transwell 小室装置放置于24孔细胞培养板中，HUVEC干预后经消化并重悬于含1%血清的培养基中，按照5×10⁴ /孔种植于Transwell小室中，下室加入含10%血清培养基；细胞培养箱培养过夜后取出 Transwell 小室，棉棒擦除上室滤膜上层细胞，下层细胞经4%多聚甲醛室温固定15 min，室温晾干后予以0.1%结晶紫室温染色30 min，移行细胞呈蓝紫色，随机观察5个高倍视野，计数移行细胞数，取平均值。统计、分析各组细胞的迁移情况。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡

HUVEC干预后经胰酶消化并重悬，离心后用预冷的标记缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为（0.5~1.0）×10⁶ /mL，依次加入 Annexin V ⁃FITC 和 PI 染色液，避光孵育20 min，再加入400 μL标记缓冲液，用流式细胞仪对细胞凋亡进行分析。统计、分析各组细胞的凋亡情况。

1.2.8 荧光定量PCR法测定DNMT1、DNMT3α、DN⁃ MT3β、p16基因表达

TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。real⁃time PCR法检测DNMT1、DNMT3α、DNMT3β、p16基因的表达。内参基因为β⁃actin。基因的相对表达量通过公式2^-ΔΔCT 计算。real⁃time PCR引物采购于上海捷瑞生物工程有限公司。DNMT1：正义 5′⁃GTCTGCTCCTGCGTG⁃ GAAG ⁃ 3′，反义 5′ ⁃ CTGAAGAAGCCGTCCCACTC ⁃ 3′。p16：正义 5′ ⁃CTTGGTGACCCTCCGGATTC ⁃3′，反义5′⁃TCAGTAGCATCAGCACGAGG⁃3′。β⁃actin：正义5′⁃TCTGGCACCACACCTTCTA⁃3′，反义5′⁃AG⁃ GCATACAGGGACAGCAC⁃3′。

1.2.9 Western blot法测定DNMT1、p16蛋白表达

RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。采用 10%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）进行电泳，电泳条件：浓缩胶为恒压100 V，30 min；分离胶为恒压120 V，1 h。将蛋白条带转印至 PVDF 膜，转膜条件：恒压 100 V，1 h。采用5%的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h。将膜与一抗 （抗 DNMT1、p16 和β⁃actin 抗体）孵育，4℃，过夜。 TBST溶液洗膜，室温，5 min，3次。将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，室温，1 h。ECL 底物发光液检测蛋白质条带。内参基因为β⁃actin。Image J 软件分析蛋白质条带信号强度。

1.2.10 甲基化特异性 PCR（methylation ⁃ specific PCR，MSP）法测定p16基因启动子区甲基化水平

DNA提取试剂盒提取细胞的基因组DNA，甲基化试剂盒进行基因组 DNA 甲基化转化。Taq DNA 聚合酶进行 PCR 实验，PCR 的反应体系如下：2 μL cDNA；10 μL 2× PCR mixture；1 μL 上下游引物 （10 μmol/L）；36 μL 无菌蒸馏水。real⁃time PCR 的反应程序如下：预变性：95℃，5 min；变性：95℃，5 s； 退火：56℃，30 s；延伸：72℃，30 s；40个循环。PCR 产物采用1%的琼脂糖胶进行电泳，电泳条件：100 V， 30 min。手持式紫外灯照射后拍照记录结果。引物采购于上海捷瑞生物工程有限公司。甲基化引物：正义 5′⁃TTTAGAATGTTGGGATTATAGACGT⁃3′，反义 5′⁃AAAAAACTAAAACAAAAAAATCGCT⁃3′。未甲基化引物：正义 5′⁃TTTAGAATGTTGGGATTATA⁃ GATGT⁃3′，反义 5′⁃AAAAAACTAAAACAAAAAAA⁃ TCACT⁃3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。所有实验均重复3次。两两比较用双尾Student’s t⁃test 进行分析；多组比较采用 Prism 软件中的方差分析及多重比较。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后人血清ET⁃1、NO水平比较

为研究替格瑞洛的治疗作用，通过ELISA实验检测替格瑞洛治疗前后人血清ET⁃1和NO含量，发现两组患者治疗前ET⁃1和NO含量均无显著性差异 （P＞0.05，表1）；治疗1个月后，替格瑞洛组ET⁃1含量显著低于氯吡格雷组，而血清 NO 含量则显著高于氯吡格雷组（P <0.05，表1），结果表明替格瑞洛对血管内皮功能有保护作用。

2.2 替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC损伤的影响

为研究替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC损伤的影响，通过CCK8、EdU、Transwell等实验分别检测 HUVEC活力、增殖与迁移能力变化，发现ox⁃LDL可使 HUVEC 活力、增殖能力及迁移能力显著降低 （P <0.01，图1A~C），而替格瑞洛干预后，细胞活力、增殖能力及迁移能力明显增加（P <0.01，图1A~C）。Annexin V/PI 流式凋亡实验结果显示 ox⁃ LDL可使HUVEC凋亡率明显增加，而替格瑞洛干预后，ox⁃LDL诱导的细胞凋亡显著减轻（图1D）。以上结果表明，替格瑞洛可以减轻 ox⁃LDL 诱导的 HU⁃ VEC损伤。

2.3 替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC p16表达的影响

为研究替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC p16 表达的影响，通过real⁃time PCR和Western blot实验分别检测 p16 表达情况，发现 ox⁃LDL 可使 HUVEC 中p16 mRNA及蛋白表达上调（P <0.01，图2A、B），而替格瑞洛干预后，ox ⁃ LDL 诱导的 HUVEC p16 mRNA 及蛋白表达显著降低（P <0.01，图2A、B）。以上结果显示，替格瑞洛可抑制ox⁃LDL诱导的HU⁃ VEC中p16的表达。

2.4 p16过表达与敲除系统的构建

为研究p16过表达与敲除系统的有效性，通过 real⁃time PCR和Western blot实验分别检测p16表达情况，发现与对照组相比，p16过表达显著升高HU⁃ VEC 中 p16 mRNA 及蛋白的表达（P <0.01，图3A、 B）；p16敲除显著抑制HUVECs中p16 mRNA及蛋白的表达（P <0.01，图3C、D）。以上结果表明成功构建了p16过表达与敲除系统。

2.5 p16 过表达抑制替格瑞洛对 ox ⁃LDL 诱导的 HUVEC损伤的影响

为研究 p16 对替格瑞洛功能的影响，通过 CCK8、EdU、Transwell 等实验分别检测 HUVEC 活力、增殖与迁移能力变化，发现过表达p16抑制了替格瑞洛对ox⁃LDL 诱导的HUVEC活力、增殖能力及迁移能力的影响（P <0.01，图4A~C）。Annexin V/PI 流式凋亡迁移实验结果显示过表达p16抑制了替格瑞洛对ox⁃LDL 诱导的HUVEC凋亡的影响，即流式凋亡象限图右下角的早期凋亡以及右上角的晚期凋亡细胞比例下降（图4D）。以上结果表明，过表达 p16抑制了替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVECs损伤的影响。

2.6 DNMT1抑制p16的表达

为研究DNMT1过表达与敲除系统的有效性，通过 Real⁃time PCR 和 Western blot 实验分别检测 DN⁃ MT1 表达情况，发现本研究在 HUVEC 中成功构建了DNMT1敲除与过表达系统（P <0.01，图5A~C）。

为研究 DNMT1 对 p16 表达的调控，通过 real⁃ time PCR 和 Western blot 实验分别检测 p16 表达情况，发现了 DNMT1 敲除可以有效促进 HUVEC 中 p16 mRNA及蛋白的表达；而DNMT1过表达则抑制 p16 mRNA及蛋白的表达（P <0.01，图5D、E）。

为研究 DNMT1 调控 p16 表达的机制，先通过 MethPrimer 预测p16 启动子甲基化富集区（图5F），然后采用MSP实验检测p16 启动子甲基化水平，发现与对照组相比，DNMT1敲除可以有效降低p16启动子区的甲基化水平（图5G）。综上所述，DNMT1 可抑制HUVEC中p16的表达。

2.7 替格瑞洛通过调控DNMT1/p16信号通路影响 ox⁃LDL诱导的HUVEC损伤

为研究替格瑞洛对 ox⁃LDL 诱导的 HUVEC 中 DNMT1/p16信号通路的影响，通过Real⁃time PCR和 Western blot实验分别检测p16表达情况，发现shD⁃ NMT1可以部分逆转替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HU⁃ VEC p16表达的抑制（P <0.01，图6A、B）。

为研究 DNMT1/p16 信号通路对替格瑞洛功能的影响，通过CCK8、EdU、Transwell等实验分别检测HUVEC 活力、增殖与迁移能力变化，发现 shp16 可以部分逆转shDNMT1对替格瑞洛促进ox⁃LDL诱导的HUVEC活力、增殖及迁移能力的影响（P <0.01，图6C~E）。Annexin V/PI流式凋亡迁移实验结果显示 shp16 可以部分逆转 shDNMT1 对替格瑞洛抑制 ox⁃LDL 诱导的 HUVEC 凋亡的影响，即流式凋亡象限图右下角的早期凋亡以及右上角的晚期凋亡细胞比例下降（图6F）。

综上所述，替格瑞洛可通过调控DNMT1/p16信号通路影响ox⁃LDL诱导的HUVEC损伤。

3 讨论

血管内皮细胞损伤和功能障碍是动脉粥样硬化发生发展的始动环节，而ox⁃LDL是目前公认的内皮损伤的主要危险因素，可降低内皮细胞活力、诱导细胞凋亡并促进炎症因子激活，进而导致炎细胞浸润、斑块破裂等^[8]。因此，改善内皮功能被认为是冠心病防治的重要措施。本研究发现替格瑞洛可改善 ACS 患者血管内皮功能；同时在 ox⁃LDL 诱导 HUVEC 损伤模型上观察到，替格瑞洛可明显促进 HUVEC 的活力、增殖及迁移能力，并显著抑制 ox⁃ LDL诱导的细胞凋亡；此外，研究发现替格瑞洛改善内皮功能的机制可能与DNMT1/p16调控通路有关。

替格瑞洛是新一代的P2Y12受体抑制剂，与氯吡格雷相比，其抗血小板聚集作用起效快、可逆且不易耐药^[9]。2020年ESCSTEMI指南对双联抗血小板治疗推荐做了更新，首选替格瑞洛或普拉格雷。既往动物研究发现替格瑞洛能增加内皮依赖性NO 合成^[10]；一项纳入127例ACS患者的临床研究也发现替格瑞洛与氯吡格雷、普拉格雷相比，能明显改善外周血管内皮功能^[11]；另一项随机对照研究中，与氯吡格雷比较，ACS患者服用替格瑞洛1个月后循环祖细胞CD34水平明显升高，间接改善脉管系统的内皮功能，这种作用独立于抗血小板活性^[12]。本研究结果显示，替格瑞洛可降低ACS患者血清ET⁃1含量并升高NO含量，这与既往研究结果相符^[13]。目前，替格瑞洛对内皮功能的影响仍存在争议，但大部分研究均支持替格瑞洛对于高危、原有内皮功能障碍的冠心病患者是具有内皮保护作用的^[14]。

p16基因又称p16INK4a基因、CDKN2A基因，是 1994年Kamb等^[15] 在人类染色体9p21上发现的新抑癌基因，可调控细胞生长、增殖、衰老及凋亡等^[16]。既往p16研究主要集中在肿瘤领域，p16蛋白表达水平可作为多种恶性肿瘤预后的预测指标^[17]。近年来， p16在动脉粥样硬化领域也逐渐受到重视，p16在动脉粥样硬化斑块中异常表达，且与斑块稳定性密切相关^[18]。既往研究也发现p16表达在过氧化氢诱导的 HUVEC 衰老中也发挥重要作用^[19]。本研究中，替格瑞洛干预HUVEC后p16表达显著降低，而过表达p16可逆转替格瑞洛对ox⁃LDL诱导的HUVEC增殖迁移、凋亡的影响，提示p16基因在替格瑞洛调控内皮细胞功能中同样发挥重要作用。

目前认为 p16 表达异常主要与 p16 基因的缺失、突变和DNA甲基化有关。DNA甲基化是基因组 DNA一种主要表观遗传修饰方式，能在不改变DNA 序列的前提下改变遗传性状，是调控基因组功能状态的重要手段^[19]。在哺乳动物中，DNA甲基化由3种 DNA 甲基化转移酶（DNA methyltransferases，DN⁃ MTs）催化：DNMT1，DNMT3A 和 DNMT3B^[21]。DN⁃ MT1是主要的维持性DNA甲基化转移酶，DNMT3A 和 DNMT3B 是从头合成性 DNA 甲基化转移酶^[22]。 DNA甲基化调控基因表达，影响DNA修复、细胞生长、分化、增殖以及肿瘤发生等过程^[21]。我们既往研究证实p16基因表达受DNMT1介导DNA甲基化调控^[23]。本研究发现在ox⁃LDL 诱导的HUVEC中， DNMT1 可调控 p16 启动子区的甲基化水平并影响其表达，而替格瑞洛可通过DNMT1/p16信号通路发挥保护内皮功能的作用。

综上所述，本研究证明替格瑞洛可通过DNMT1 介导的DNA甲基化调控p16表达，进而减轻ox⁃LDL 诱导的HUVEC损伤，改善血管内皮功能。

参考文献