口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是最常见的口腔癌，占所有头颈部癌的90% 以上，其患者预后差，病死率高^[1]。OSCC涉及的分子发病机制十分复杂，包括多种遗传改变。寻找 OSCC潜在的生物标志物，对于疾病的确诊、治疗及预后的改善具有十分重要的研究意义。

环状 RNA（circular RNA，circRNA）因高保守性和组织特异性被认为是癌症诊疗有利的候选靶点。本课题组前期已开展OSCC与miR⁃181相关性研究，结果发现miR⁃181d⁃5p与OSCC细胞的生长、迁移和侵袭相关^[2]；miR⁃199a⁃5p能靶向调控mTOR通路^[3]，且有报道称其在OSCC中也发挥抑癌因子的作用^[4]。基于前期基础研究、现有文献报道以及数据库分析，本研究拟在分析临床患者样本的基础上，结合体外细胞实验，探讨circFAT1在OSCC中的作用，并初步了解其与miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p的关系。

1 对象和方法

1.1 对象

选取2021年1月—2021年10月在本院接受手术治疗的OSCC患者30例。收集临床组织样本，包括癌组织和癌旁组织，均经过病理学验证。纳入标准：①患者病理诊断经3位病理科医生核实确诊为 OSCC；②患者术前均没有接受放化疗。排除标准： ①存在其他全身系统性疾病；②术前接受其他抗肿瘤治疗。本研究方案获得院伦理委员会批准，患者均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及处理

正常口腔角质形成细胞系 hNOK（上海通派生物科技有限公司），OSCC细胞SCC⁃25、CAL⁃27（美国模式培养物研究所），HSC ⁃ 2、HSC ⁃ 3（Riken Cell Bank，日本）。所有细胞培养在含有 10%的胎牛血清及1% 双抗的DMEM培养基中，并放在37℃、5% CO₂ 的恒温培养箱中。根据美国 Invitrogen 公司的 Lipofectamine3000 的说明书将 circFAT1 小干扰RNA（Si⁃FAT1）、过表达质粒（FAT1）、miR⁃181d⁃5p mimic、miR ⁃181d ⁃5p inhibitor、miR ⁃199a ⁃5p mimic、 miR⁃199a⁃5p inhibitor以及各自的同型对照（Si⁃NC、 NC、MC、IC）转染到HSC⁃3或SCC⁃25细胞中。mimic 和inhibitor以及阴性对照购自广州锐博生物科技公司，siRNA和过表达质粒由上海吉玛基因合成。

为验证目的基因对于PI3K/Akt/mTOR通路的影响，转染前 1 h，向细胞中加入 50 μmol/L LY294002 （PI3K/Akt/mTOR 抑制剂）处理。LY294002 购自美国MedChemExpress公司。

1.2.2 实时定量PCR

使用TRIzol 试剂分别提取OSCC组织和细胞的总 RNA，采用北京全式金生物技术有限公司的 cDNA Synthesis试剂盒合成RNA逆转录后产物。利用美国 Applied Biosystems 公司的实时荧光定量 PCR 仪器和 SYBR Green Supermix 试剂进行实时定量 PCR以检测circFAT1、miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p 在OSCC 组织和细胞中表达量。GAPDH 和 U6 分别作为内参基因。利用 2^{-ΔΔ Ct} 法分析 circFAT1、 miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p的相对表达量。

引物序列如下：circFAT1（5′⁃AACAGAAGAGA⁃ ACTGGGGCG⁃3′，5′⁃GATCAGGGTGCCAATGGTGA⁃ 3′）；GAPDH（5′⁃TGTTCGTCATGGGTGTGAAC⁃3′，5′⁃ ATGGCATGGACTGTGGTCAT⁃3′）；miR⁃181d⁃5p（5′⁃ AACATTCATTGTTGTCGGTGGGTG⁃3′，5′⁃TCGTAT⁃ CCAGTGCGTGTCG⁃3′）；miR ⁃199a ⁃5p（5′ ⁃CCAGT⁃ GTTCAGACTACCTGTTC⁃3′，5′⁃GTA⁃TCCAGTGCGT⁃ GTCGTGG⁃3′）；U6（5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACA⁃3′； 5′⁃AACGCTTCACGAATTTGCGT⁃3′）。

1.2.3 靶基因关系的预测和验证

将 circFAT1 的野生型或突变型序列重组到双荧光素酶报告载体 pmirGLO 中构建双荧光素酶质粒（FAT1⁃wt 或 FAT1⁃mut）。SCC⁃25 和 HSC⁃3 细胞在完全培养基中培养并用 miR ⁃181d ⁃5p mimic 或 miR⁃199a⁃5p mimic和双荧光素酶重组质粒共转染，以mimic control（MC#1，MC#2）作为对照。随后，使用美国Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统检测相对荧光素酶活性。

1.2.4 CCK⁃8检测细胞活力

细胞转染后，将SCC⁃25或HSC⁃3细胞（1×10³ 个/孔） 接种到96孔板中。培养72 h后，采用北京索莱宝科技有限公司的CCK⁃8溶液与细胞反应3 h左右。随后，使用 SpectraMax iD3 酶标仪分析细胞的相对存活率。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭

Transwell实验被用于测定目的基因对OSCC细胞迁移和侵袭的影响。不同的是在侵袭实验中， Transwell 小室要预先加入北京索莱宝的基质胶处理。随后，转染的细胞消化重悬后被加入到 Tran⁃ swell上室在无血清的培养基中培养，而Transwell下室加入含有胎牛血清的完全培养基，培养48 h。固定液固定细胞后，用北京索莱宝的 0.1% 的结晶紫染色；镜检结果，并记录数据。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期

采用上海碧云天公司的细胞周期检测试剂盒检测细胞周期，Annexin V⁃FITC 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。对于细胞凋亡检测，将细胞消化后，置于 EP 管中，加入试剂盒中的 Annexin V⁃FITC 结合液重悬细胞，随后按顺序加入Annexin V⁃FITC 和碘化丙啶染色液轻轻混匀，室温避光培养15 min 左右，利用美国 Beckman Coulter 公司的 CytoFLEX 流式细胞仪进行检测。对于周期检测，将细胞消化清洗后，加入70%的乙醇，4℃过夜固定；随后加入配制好的碘化丙啶工作液37℃避光染色30 min，随后通过流式细胞仪检测分析结果。

1.2.6 免疫印迹法（Western blot）检测蛋白水平

细胞中加入购自上海碧云天公司的 RIPA裂解液进行裂解，通过BCA 试剂盒进行蛋白含量测定。经过上样电泳及转膜后，将蛋白转移至购自美国 Thermo Scientific 公司的 PVDF 膜上；封闭后，加入相应的一抗和二抗孵育；曝光显影后，以GAPDH作为内参对照，分析蛋白表达的相对量。抗体均购买自英国 Abcam 公司。英国 Abcam 公司提供的山羊抗兔IgG H&L（HRP）和山羊抗鼠IgG H&L（HRP）作为二抗。

1.3 统计学方法

使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析，计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用配对样本s检验或独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circFAT1、miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p 在 OSCC 组织和细胞中的表达及关系

利用 starBase 及 GSE131182 数据集鉴定出 7 个 circRNA（NCOA1、ATXN1、FAT1、TNPO3、FNDC3B、 SSH2、MAP3K4）（图1A），它们既有miR⁃181/miR⁃199 海绵吸附结合位点，同时也是OSCC相关的circRNA。进一步验证发现，在 OSCC 组织和细胞中，circFAT1 的表达升高，而miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p表达下降 （P <0.001，图1B~G）。图1H⁃I分别显示了circFAT1 与miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p的结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证了miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p 均可以作为 circFAT1 的靶 miRNA（P <0.01，图1J~M）。

2.2 circFAT1 通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p 影响OSCC细胞活力

图2A 显示 siFAT1 显著降低了 circFAT1 水平 （P <0.001），miR⁃181d⁃5p inhibitor对circFAT1水平无明显影响（P >0.05）。miR⁃181d⁃5p的相对表达量在 siFAT1+IC#1 组显著升高（P <0.001），在 siNC+ miR⁃181d⁃5p inhibitor 组显著下降（P <0.01），而 siFAT1+miR⁃181d⁃5p inhibitor组逆转了上述两组对 miR⁃181d⁃5p水平的影响（P <0.001，图2B）。FAT1 过表达质粒显著促进了circFAT1的表达（P <0.001）， miR ⁃ 181d ⁃ 5p mimic 对 circFAT1 水平无明显影响 （P >0.05，图2C）。miR⁃181d⁃5p 的相对表达量在 FAT1+MC#1 组显著降低（P <0.001），在 NC+miR⁃ 181d ⁃5p mimic 组显著上调（P <0.001），而 FAT1+ miR⁃181d⁃5p mimic组逆转了上述两组对miR⁃181d⁃5p 水平的影响（P <0.001，图2D）。miR⁃199a⁃5p inhibitor 抑制 miR⁃199a⁃5p 表达，miR⁃199a⁃5p mimic 促进 miR⁃199a⁃5p表达；miR⁃199a⁃5p对circFAT1表达无影响，但逆转了 circFAT1 对 miR⁃199a⁃5p 表达的调控作用（P <0.01，图2E~H）。

CCK ⁃8 显示 siFAT1 抑制了细胞活性，过表达 circFAT1则相反；miR⁃181d⁃5p inhibitor及miR⁃199a⁃ 5p inhibitor 促进细胞活性，miR ⁃181d ⁃5p mimic 及 miR⁃199a⁃5p mimic发挥了相反的作用；miR⁃199a⁃5p 及miR⁃181d⁃5p均逆转circFAT1对细胞活性的调控作用（P <0.01，图2I~L）。

2.3 circFAT1 通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p 影响OSCC细胞迁移和侵袭

Transwell迁移实验结果显示，siFAT1、miR⁃181d⁃5 p mimic以及miR⁃199a⁃5p mimic降低了细胞迁移，而过表达 FAT1，miR ⁃ 181d ⁃ 5p inhibitor 以及 miR ⁃ 199a⁃5p inhibitor 则加速了细胞迁移（P <0.01）；值得注意的是，miR⁃181d⁃5p inhibitor 以及 miR⁃199a⁃ 5p inhibitor 均可以部分逆转 siFAT1 降低的相对迁移率，而miR⁃181d⁃5p mimic以及miR⁃199a⁃5p mimic 均部分降低了过表达FAT1升高的相对迁移率（P <0.01，图3）。侵袭实验呈现了相同的现象，沉默circ⁃ FAT1、miR⁃181d inhibitor及miR⁃199a⁃5p inhibitor抑制了细胞侵袭，过表达circFAT1、miR⁃181d mimic及 miR⁃199a⁃5p mimic促进了细胞侵袭（P <0.05）；miR⁃ 199a⁃5p及miR⁃181d均逆转circFAT1对细胞侵袭的调控作用（P <0.01，图3B）。

2.4 circFAT1 通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p 调节OSCC细胞凋亡

与siNC+IC#1组相比，siFAT1+IC#1组的细胞凋亡率明显升高（P <0.001），而 siNC+miR⁃181d⁃5p inhibitor 组的细胞凋亡率下降（P <0.05）；siFAT1+ miR ⁃181d ⁃5p inhibitor 组逆转了 siFAT1+ IC#1 组和 siNC+miR ⁃181d ⁃5p inhibitor 组对凋亡的调控作用（P <0.001，图4）。相反地，过表达circFAT1减弱细胞凋亡，miR⁃181d⁃5p mimic促进细胞凋亡且部分逆转过表达circFAT1对细胞凋亡的影响（P <0.01，图4）。miR⁃199a⁃5p 与 miR⁃181d⁃5p 对细胞的作用相同，且均可部分逆转circFAT1对HSC⁃3或SCC⁃25细胞凋亡的作用（P <0.05，图4）。

2.5 circFAT1 通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p 改变OSCC细胞周期进展

与siNC+IC#1组相比，siFAT1+IC#1组的细胞周期明显被阻滞（P <0.05），而 siNC+miR⁃181d⁃5pinhibitor 组的细胞周期被促进（P <0.05）；siFAT1+ miR ⁃181d ⁃5p inhibitor 组逆转了 siFAT1+ IC#1 组和 siNC+miR⁃181d⁃5p inhibitor组对细胞周期的调控作用（P <0.001，图5）。过表达circFAT1缩短了SCC⁃25 细胞的G0/G1期并相对的延长了S期，miR⁃181d⁃5p mimic则诱导了SCC⁃25细胞的G0/G1期阻滞，且部分逆转了过表达circFAT1对细胞周期的促进作用（P <0.05，图5）。类似地，miR⁃199a⁃5p inhibitor 促进细胞周期进展，且部分逆转siFAT1对细胞周期的阻滞作用，miR ⁃199a ⁃5p mimic 则诱导了 SCC ⁃25 细胞的 G0/G1 期阻滞，且部分逆转了过表达 circFAT1 对细胞周期的促进作用（P <0.05，图5）。

2.6 circFAT1 通过 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p 调控 PI3K/Akt/mTOR信号通路

免疫印迹实验显示，siFAT1、miR⁃181d⁃5p mimic 以及 miR⁃199a⁃5p mimic 抑制了 PI3K/Akt/mTOR 磷酸化，而过表达 FAT1、miR ⁃181d ⁃5p inhibitor 以及 miR⁃199a⁃5p inhibitor 则相反（P <0.05，图6）；值得注意的是 miR⁃181d⁃5p inhibitor 以及 miR⁃199a⁃5p inhibitor 均可以部分逆转 siFAT1 抑制的 PI3K/Akt/ mTOR 通路，而 miR⁃181d⁃5p mimic 以及 miR⁃199a⁃ 5p mimic 均部分减弱了过表达 FAT1 激活的 PI3K/Akt/mTOR通路（P <0.01，图6）。

2.7 LY294002 预处理对于 circFAT1/miR⁃181d⁃5p/ miR⁃199a⁃5p轴的影响

免疫印迹实验显示，LY294002 预处理 SCC⁃25 细胞降低了过表达circFAT1激活的PI3K/Akt/mTOR 通路，且与miR⁃181d⁃5p mimic和miR⁃199a⁃5p mimic 具有协同作用（P <0.05，图7A、B）。CCK⁃8 结果表明LY294002预处理SCC⁃25细胞部分抑制了过表达circFAT1增强的细胞活性，且与miR⁃181d⁃5p mimic 和miR⁃199a⁃5p mimic具有协同作用，进一步降低了细胞活性（P <0.01，图7C）。

3 讨论

本研究在前期研究的基础上发现了一个在OSCC 中发挥作用的circRNA，即circFAT1，揭示了circFAT1 通过 miR ⁃181d ⁃5p/miR ⁃199a ⁃5p 轴调控 PI3K/Akt/mTOR通路进而参与OSCC细胞恶性进展的机制。

针对OSCC 开展的circRNA 的研究在近几年逐渐引人瞩目。在OSCC中，circ_0000140 作为“分子海绵”竞争性结合 miR⁃31 以上调 LATS2 轴介导的 Hippo 信号通路发挥肿瘤抑制作用^[5-6]。circIGHG 诱导的上皮间质转化通过 miR⁃142⁃5p/IGF2BP3 信号传导促进口腔鳞状细胞癌进展^[7]。本研究证明了 circFAT1作为致癌因子，在OSCC中过度表达，并加速了OSCC细胞系的迁移、侵袭、周期进展并减弱了细胞凋亡。这与最新发表的一篇研究结果相似，即 circ_0001461 通过 miR ⁃ 145/TLR4/NF ⁃ κB 轴促进 OSCC进展^[8]。不同的是，本研究还发现miR⁃181d⁃5p 和miR⁃199a⁃5p均在OSCC组织和细胞中下调表达，且circFAT1可分别影响miR⁃181d⁃5p和miR⁃199a⁃5p 进而调控OSCC细胞的生物学功能。

PI3K是一类与肿瘤密切相关的蛋白家族，可诱导 PIP2 转化为 PIP3，进而活化 AKT，激活 mTOR 通路，最终促进OSCC进展。目前，PI3K/Akt/mTOR 通路作为肿瘤潜在的治疗靶点备受关注。Per2 以 PI3K/Akt/mTOR 通路依赖性方式刺激自噬以及抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来抑制 OSCC 进展^[9]。 circEPSTI1/miR⁃942⁃5p/LTBP2 轴通过加速 EMT 和 PI3K/Akt/mTOR 信号通路组分的磷酸化影响 OSCC 细胞增殖和侵袭^[10]。本研究发现 circFAT1 参与调节PI3K/Akt/mTOR通路，而PI3K抑制剂 LY294002、 miR⁃181d⁃5p 和 miR⁃199a⁃5p 均阻断了 circFAT1 激活的 PI3K/Akt/mTOR 通路。此外本研究发现 LY294002 显著抑制了过表达 circFAT1 所增强的 OSCC 细胞活力，并与 miR⁃181d⁃5p 和 miR⁃199a⁃5p 具有协同作用。因此，circFAT1 似乎通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p轴激活PI3K/Akt/mTOR通路促进OSCC进展。

综上所述，在 OSCC 组织和细胞中 circFAT1 表达上调，miR⁃181d⁃5p 和 miR⁃199a⁃5p 表达下调。 circFAT1 过度表达将会加速 OSCC 细胞的恶性进展，circFAT1沉默则作用相反。此外，circFAT1通过靶向 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p 轴磷酸化 PI3K/Akt/ mTOR通路相关蛋白，进而调控OSCC细胞的生物学功能。本研究揭示了OSCC发生发展中一条新的调控途径，为OSCC的诊断和治疗提供了潜在的靶标。

参考文献