胎儿肾脏发育不良（renal hypodysplasia，RHD） 是临床常见的胎儿泌尿系统畸形（congenital anoma⁃ lies of the kidney and urinary tract，CAKUT），在活产儿中的发病率为3‰~7‰，约占儿童慢性肾病和肾衰竭病因的 70%^[1]，严重影响患儿远期生活质量。其表型主要有3类：①肾脏缺如，由胚胎期肾脏发育未正常启动所致；②肾脏发育异常，肾脏含有未完全成熟化的组织，如囊性病变；③肾脏发育不全，肾脏含有较少的肾单位和/或肾脏体积缩小^[2]。

RHD致病机制复杂，涉及多种基因突变或者信号通路异常^[3-4]。目前，约40个CAKUT致病基因已被确定，解释了5％~20％的患者病因^[5]。另外大约 16％的病例被确定为基因拷贝数变异导致，其中研究比较多的是 17 号染色体上的 HNFB1 基因座与 22 号染色体上的 Di ⁃ George 综合征区域^[6]。 16p11.2基因座是CAKUT 研究热点区域，与全面发育迟缓、畸形、癫痫等相关，部分患者表现出肾脏畸形或其他肾脏疾病^[7]。该区域的喹啉磷酸核糖基转移酶（quinolinic phosphoribosyl transferase， QPRT）基因在肾脏组织中的表达最高，但其对胎儿肾脏发育的影响尚不明确。

本研究利用免疫组化在胎鼠肾脏组织中对 QPRT基因定位，并进一步构建了QPRT基因敲除小鼠模型，观察小鼠及其子代肾脏病理组织学及肾功能变化，探讨QPRT基因缺陷对肾脏发育的影响，为挖掘RHD新致病基因提供新证据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验采用的动物均为 C57BL/6JGpt 品系背景， QPRT基因敲除的F0代小鼠购自南京大学南京生物医药研究所，于淮安市第一人民医院无特定病原体 （specific pathogen free，SPF）级环境中饲养及配繁，动物饲养环境严格保证温度为18~22℃、相对湿度为 40%~70%且明暗交替时间12 h/12 h（07：00⁃19：00），喂养灭菌水和 SPF 级繁殖鼠料，自由进食水。取 E13 胎鼠肾脏组织，用免疫组织化学（immunohisto⁃ chemistry，IHC）检测 QPRT 基因在肾脏中的表达。本研究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会批准[批准文号：南医大伦审（YX ⁃2⁃2022⁃021⁃01 号]，所有实验动物的操作与饲养均符合国标及江苏省实验动物中心管理饲养条例，符合伦理规范要求。

QPRT引物由南京大学南京生物医药研究所设计，引物及琼脂糖粉末购自生工生物工程（上海）股份有限公司，QPRT 引物序列如表1。正义 5′ ⁃ GAAGGGCAAACCATTAAGAGAAGC ⁃ 3′，反义 5′ ⁃ GCAGTAACAGCAATCCTGTGGAAG ⁃ 3′，引物长度 24 bp，产物长度256 bp，退火温度65℃。

1.2 方法

1.2.1 QPRT在胎鼠肾脏组织的表达

取 E13 胎鼠肾脏组织，用 4%多聚甲醛过夜固定，取出冲洗后脱水，组织包埋切片，对石蜡切片进行免疫组化。载玻片用二甲苯脱蜡，然后在乙醇中连续脱水，蒸馏水浸洗。在0.1 mol/L柠檬酸修复液 （pH6）中，中高火加热玻片 30 min 进行抗原修复。在 3% H₂O₂中室温避光孵育 10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，PBS（pH7.4）浸洗 3 次，每次 5 min。将载玻片封闭在 3% BSA 溶液中，置于湿盒中室温孵育30 min。而后甩掉封闭液，滴加一抗工作液均匀覆盖组织，使载玻片在一抗中4℃孵育过夜。第2 天取出切片室温复温30 min，润洗后，滴加与一抗对应的即用型快捷免疫组化 MaxVision^TMHRP 二抗覆盖组织，在室温下持续 30 min。再次润洗，用 DAB 过氧化物酶底物试剂盒进行显色，苏木素复染。连续脱水待干后，中性树脂封片。

1.2.2 基因敲除小鼠模型建立及表型鉴定

CRISPR/Cas9 技术构建QPRT基因敲除小鼠模型：由南京大学模式动物研究所订购QPRT Cas9⁃KO 斑点鼠（-4 321 bp/wt，E2-E4 完全删除，KO 阳性， 5.43周龄），得到嵌合体F0代小鼠。

QPRT基因敲除小鼠的饲养和繁殖：将F0代中所有小鼠饲养于SPF级环境中，提供充足的食物与可饮用水。通过 PCR 及 TA 克隆测序分析，从所有的F0代小鼠中挑选出QPRT基因缺失的小鼠，然后将性成熟的阳性 F0 代小鼠（满 8 周）分别与同龄的 C57BL/6J小鼠交配，培育后成功获得F1代小鼠，继续将F1代小鼠在SPF环境中饲养，再将性成熟的F1 代雌雄小鼠相互杂交，杂交后的每只F1代孕鼠单独饲养、培育，得到F2代小鼠。

基因型鉴定：同一父母产生的后代小鼠中包含野生型（WT）、杂合型（HT）和基因敲除型（KO）3种基因型。采用剪脚趾法标记小鼠，并剪取鼠尾组织经酚氯仿法提取DNA，依据表格1中在靶区域设计的引物进行扩增，于 1.5%琼脂糖凝胶上加入 PCR 扩增产物 5 μL，DNA Marker 3 μL，电泳30 min后通过凝胶成像仪获取条带，凝胶分析系统进行分析。基因型鉴定后筛选出WT型和KO型小鼠。

Western blot 检测 QPRT 蛋白表达：处死小鼠后取肾脏组织，加入蛋白裂解液提取蛋白。蛋白定量后，加入5×上样缓冲液配成样品，90℃水浴10 min 使蛋白变性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜至 PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，加入相应的一抗，4℃过夜孵育，加入对应的二抗，室温孵2 h， ECL发光显色，成像分析。

称重法、肾功能检测、HE染色实验方法：初步分析已获得的QPRT敲除小鼠的表型，以出生后第8周 QPRT^-/-（KO 组）小鼠为实验组，同周龄 QPRT^+/+（WT 组）小鼠作为对照组，处死小鼠后取出肾脏组织。称重法检测各组小鼠的体重与肾脏重量，评估肾脏系数 （肾重/体重比）结果是否具有统计学差异。使用全自动生化分析仪测量小鼠血清肌酐、尿素氮、尿总蛋白，计算内生肌酐清除率。分离E11.5 WT型胎鼠和KO 型胎鼠的肾脏、脾脏、肺部、心脏及肝脏，4％多聚甲醛固定后进行常规石蜡包埋、切片，通过苏木精⁃伊红 （hematoxylin⁃eosin，HE）染色评估组织病理学变化。

1.3 统计学方法

计量资料采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用t检验。所有分析均采用SPSS 22.0软件，双侧检验，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QPRT在胎鼠肾脏组织的表达

显微镜拍照如下图。发现QPRT在E13天胎鼠肾脏组织的输尿管芽（ureteric bud，UB）表达（图1）。

2.2 QPRT基因敲除小鼠基因型鉴定

对 F2 代小鼠提取鼠尾 DNA 进行 PCR 扩增，电泳结果如图2 示，出现 1 条 256 bp 左右条带的为 QPRT^-/-（KO组）小鼠；只出现1条408 bp左右的条带的为QPRT^+/+（WT组）小鼠。

2.3 基因敲除小鼠肾脏组织中QPRT蛋白表达情况

Western blot结果表明，QPRT^-/-小鼠肾脏组织中 QPRT蛋白基本不表达，而QPRT^+/+小鼠肾脏组织中的QPRT 表达水平较高，杂合子的表达水平介于两者之间（图3），GAPDH为内参蛋白。

2.4 QPRT基因敲除小鼠表型鉴定

2.4.1 QPRT^-/-与QPRT^+/+小鼠的体重、肾脏重量及肾脏系数分析

以出生后第8周QPRT^-/-小鼠为实验组，同周龄QPRT^+/+小鼠作为对照组。

雌性组（KO组n=8，WT组n=8）：在小鼠体重上， KO组平均值19.32 g小于WT组平均值19.95 g（P＜0.05，图4A）；在肾脏重量上，KO组平均值0.12 g小于 WT 组平均值 0.21 g（P＜0.05，图4B）；在肾脏系数上，KO组平均值0.006小于WT组平均值0.010（P＜ 0.05，图4C）。雄性组（KO 组 n=10，WT 组n=12）：在小鼠体重上，KO组平均值28.56 g小于WT组平均值 29.15 g（P＜0.05，图4D）；在肾脏重量上，KO组平均值0.34 g小于WT组平均值0.41 g（P＜0.05，图4E）； 在肾脏系数上，KO 组平均值 0.012 小于 WT 组平均值0.014（P＜0.05，图4F）。

2.4.2 QPRT^-/-与QPRT^+/+小鼠的肾功能分析

对各组小鼠进行肾功能检测发现，KO组与WT 组相比，KO 组 URE、CRE⁃S、Glu、URIC 和β2⁃MG 的含量均显著升高（P <0.05，图5），KO 小鼠的血清检测中尿素氮、血肌酐、尿酸水平高于WT组（秩和检验：尿素氮Z=-2.562，P <0.05；肌酐Z=-2.402，P <0.05；尿酸Z=-1.992，P <0.05）。

2.4.3 QPRT^-/-仔鼠病理组织学分析

雌性QPRT^+/-小鼠与QPRT^+/⁃雄性交配，因小鼠肾脏在出生2周后发育结束，所以在此时处死仔鼠，收集肾脏、脾脏、肺部、心脏及肝脏，进行HE染色。肾脏组织HE染色显示QPRT^-/-仔鼠的肾脏实质部位局部呈现蜂窝状囊性扩张（图6A、B）。QPRT^+/-仔鼠病变较轻，见肾脏皮质间质局灶性疏松水肿（图6C），肾脏部分区域近曲小管上皮细胞胞质空泡样变性 （图6D）；QPRT^+/+仔鼠肾脏未见明显病理组织学变化 （图6E、F）。QPRT^-/-与 QPRT^+/-仔鼠的其余脏器（脾脏、肺部、心脏及肝脏）未见明显病理组织学变化。

3 讨论

QPRT 基因位于 16p11.2（NC_000016.10）区域，主要在人和小鼠的肾脏和肝脏中特异性表达。在成熟肾脏中，QPRT 蛋白主要分布在新陈代谢最活跃的近端小管上皮细胞中。研究提示，QPRT 基因纯合缺失是自闭症发病原因之一^[8]，QPRT也是急性髓性白血病的直接靶基因，亦可以加重神经胶质瘤的恶化程度^[8]。但是目前尚无报道QPRT与胚胎肾脏发育的关系。

前期研究发现 QPRT 在胎鼠早期发育中的 UB 中明显表达，该定位提示了QPRT 基因可能在胚胎肾脏发育中发挥功能。哺乳动物的肾脏起源于后肾，形成于人类胚胎第 5 周，相当于小鼠胚胎第 11 天。后肾的发育依赖于 UB 和后肾间充质（meta⁃ nephric mesenchyme，MM）之间的一系列相互诱导、相互作用^[9]。UB入侵MM并分枝，最终分化成为集合管、肾盂和输尿管。UB又向MM传递信息，使其发育成为肾单位和肾间质^[10]。研究表明这些复杂发育过程通过大量基因及信号传导通路进行调控。如已知的 GDNF/Ret 通路、Wnt 以及 NOTCH 途径等；原癌基因 RET、WNT11 在 UB 特异性表达， GDNF、WT1 和 EYA1 在 MM 表达，这些关键步骤中的基因和转录因子的变异可导致 RHD 的发生^[11]。基于前期研究提示 QPRT 在 UB 表达，本研究推测 QPRT功能缺失可能干扰UB与MM相互作用从而导致肾脏畸形的发生。

CRISPR/Cas9技术是目前发展迅速并广泛应用的基因编辑技术^[12]，本研究使用CRISPR/Cas9技术构建了QPRT缺陷型小鼠，发现QPRT基因敲除后小鼠的肌酐、尿素氮等肾功能指标升高，提示小鼠肾功能受损。QPRT是NAD⁺ 从头合成途径的限速酶，来自实验模型和临床研究的数据揭示NAD⁺ 稳态是肾脏健康和肾小管抵抗各种应激源能力的决定因素^[13]。有研究通过小鼠局部肾损伤模型结合代谢组学分析筛选出了与急性肾损伤（acute kidney injury， AKI）相关的代谢变化，发现此时肾脏的NAD⁺ 下降，喹啉酸上升，QPRT 下降。随后研究者又采用了基因编辑的办法获得了QPRT^+/-小鼠，以模仿QPRT下降这一获得性缺陷，发现QPRT 的下降导致了肾脏中NAD⁺ 的下降，并且升高了尿中的喹啉酸盐，加剧了小鼠对AKI的敏感性^[13]。此外，亦有研究表明中成药健脾益肾方能够通过上调 QPRT/NAD⁺ /SIRT3 通路的蛋白表达，有效缓解慢性肾脏疾病进展^[14]。以上结果表明QPRT可以保护肾脏的NAD⁺，并介导机体对AKI的抵抗力。

已有大量关于基因剂量改变引起复杂的涉及肾脏和肾外表型的研究，如由 PAX2 突变引起的肾发育不全的肾缺损综合征。动物模型显示，PAX2 纯合子突变模型小鼠双侧肾缺如；杂合子突变小鼠肾脏表型为发育不全；PAX2 过量表达时则形成多囊肾^[15]。MAZ 基因亦是调控生殖泌尿系统发育的剂量敏感性基因。MAZ 的纯合缺失导致 65.5%的 CAKUT 发病率，野生型及杂合型的 CAKUT 外显率低于 6%^[16]。本研究结果显示野生型、杂合型和纯合型小鼠的QPRT基因表达呈递减趋势；KO小鼠的肾脏系数（肾重/体重比）显著降低，这提示QPRT敲除后小鼠的肾单位数量减少，其子代QPRT 纯合子突变模型小鼠呈双侧肾脏多囊性发育不良，杂合子突变小鼠肾脏轻度多囊性改变，这有力地证明了 QPRT基因对小鼠肾脏发育的影响具有基因剂量效应。最近的研究表明，NAD⁺ 合成途径关键基因的突变可导致先天性畸形，包括编码色氨酸转运蛋白的基因、编码Kynurenine通路酶的基因（NMNAT1⁃3和 NADSYN1）^[17]。另外亦有研究表明QPRT拷贝数缺失并外源性烟酸缺乏的小鼠血液NAD⁺ 浓度明显降低^[18]。基于QPRT参与NAD⁺ 合成，推测小鼠模型表现的肾脏病理组织学表型可能与其过低的NAD⁺ 浓度相关，这亦为我们研究QPRT 影响肾脏发育的机制提供了方向。

综上所述，本研究从 QPRT 基因敲除的成年小鼠与胎鼠的肾脏等组织水平研究QPRT基因对胚胎肾脏发育的致病作用，预测QPRT 基因可能为RHD 的潜在致病基因。本研究的不足之处在于未能探索 QPRT 在肾脏发育中的具体调控机制。但是 QPRT 基因是 NAD⁺ 合成途径的关键酶基因，这亦为从代谢角度深入研究RHD的致病机制提供了依据，并有望为后续的临床诊断及靶向治疗提供新线索。

参考文献