慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo⁃ nary disease，COPD）是以持续的气流受限为特征，气道、肺实质和肺血管等的慢性炎症为主要发病过程的呼吸系统疾病^[1-2]。目前我国有近 1 亿 COPD 患者，COPD 的发病率和病死率高，早期症状少，病程迁延，从慢性炎症、损伤、修复和呼吸道结构重塑，到可检测到的肺功能异常之间往往要经历一段很长的时间，导致 COPD 漏诊漏治^[3]。研究表明在肺功能变化可检测之前及时对 COPD 进行诊断并干预，将显著减缓疾病进展、提高生活质量并降低医疗费用^[4-5]。

微小 RNA（microRNA）是一组广泛存在于人体中的内源性单链非编码RNA分子，广泛参与机体发育、细胞分化、细胞增殖和凋亡等生物学过程^[6-7]。

本课题组前期研究发现COPD患者血清和肺组织中 microRNA let⁃7 表达量异常，但 let⁃7 在正常人群、吸烟人群及不同慢性阻塞性肺疾病全球倡议 （global initiative for chronic obstructive lung disease， GOLD）分级的COPD患者血清中是否存在表达异常目前尚不清楚。本研究拟通过对正常不吸烟对照组、吸烟对照组及不同 GOLD 分级的 COPD 患者血清let⁃7水平进行检测，探索血清let⁃7对COPD早期诊断的可能性及其对COPD严重程度评估的价值，为COPD的临床诊疗提供更广阔的视角。

1 对象和方法

1.1 对象

从无锡市人民医院呼吸与危重症学科慢病临床数据库中选取2019年10月—2022年6月于本科就诊的 COPD 稳定期男性患者 160 例。纳入标准： ①符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（GOLD2019 年）》的诊断标准：有呼吸困难、慢性咳嗽咳痰；危险因素暴露史，如香烟烟雾等；且吸入支气管舒张剂后患者第 1 秒用力呼气容积（forced expiratory vol⁃ ume in one second，FEV₁）/用力肺活量（forced vital capacity，FVC）<70％，确定存在持续气流受限，并排除其他肺部疾病的影响；②精神状态正常，无沟通障碍。排除标准：①合并其他呼吸系统疾病、气胸、肋骨骨折、严重的心脑血管疾病危及生命、感染、自身免疫性疾病、肝肾功能不全、恶性肿瘤；②近3个月有COPD急性发作史；③临床资料不完整。根据 GOLD将COPD依次分为GOLDⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。

此外，另选取本院同期进行体检的健康志愿者 100例，其性别和年龄与COPD组患者相匹配，肺功能均正常，无高血压、糖尿病、自身免疫性疾病等。根据有无吸烟史，将健康体检者分为不吸烟对照组 50例，吸烟对照组50例。本研究经过南京医科大学附属无锡人民医院伦理委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器

提取总RNA的试剂RNAiso Blood（9112/9113）、逆转录试剂盒 PrimeScript^TM RT reagent kit with gDNA eraser（RR047A）、荧光定量试剂盒TB Green^TM⁃ Premix Ex Taq^TMⅡ（RR820A）（TaKaRa 公司，日本），待检测内参引物U6及microRNA let⁃7a、let⁃7c、let⁃7d 的引物由上海Sangon Biotech 公司合成。引物序列见表1。实时定量荧光PCR仪（ABI公司，美国）。

1.2.2 血浆采集及血清提取

空腹采集5 mL肘静脉血于含枸橼酸钠抗凝剂的真空离心管中，室温静置0.5 h，4℃ 3 000 r/min离心10 min收集血清，分装于无RNA酶的EP管中，冻存于-80℃冰箱备用。血清提取后于3 d内完成检测。

1.2.3 血清RNA提取和let⁃7表达检测

取 200 μL 血清，按照血清 RNA 提取试剂盒 RNAiso Blood 操作流程提取包含 miRNA 的总 RNA。逆转录试剂盒 PrimeScript^TM RT reagent kit with gDNA eraser逆转录成cDNA，RT⁃PCR分析采用 TB Green^TMPremix Ex Taq^TMⅡ和 ABI 9600 实时 PCR 检测系统（Applied Biosystems）进行。反应条件： 95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。U6用作 microRNA的内参。使用式2^{-（△△CT）} 计算每个基因表达的变化。

RT：逆转录引物；F：前引物；R：后引物。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0统计软件。计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用直线相关分析法，诊断价值采用 ROC 曲线分析法。 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD患者与对照组临床资料比较

COPD患者共160例，平均年龄（69.76±9.37）岁，均有吸烟史，其中GOLDⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者分别为 25、25、55、55 例；健康对照组共 100 例，平均年龄 （69.06±13.86）岁，按有无吸烟史分为吸烟对照组和不吸烟对照组，各50例。各组间年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组具体临床资料见表2。

2.2 血清let⁃7在不同组别中的相对表达量

COPD组血清let⁃7a、let⁃7c、let⁃7d表达量与不吸烟对照组和吸烟对照组相比均明显下降，且差异有统计学意义（P＜0.05），但 GOLDⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级患者血清let⁃7a、let⁃7c、let⁃7d表达量相互之间无明显统计学差异（P＞0.05）。吸烟对照组血清let⁃7a、let⁃ 7c、let⁃7d的表达量均低于不吸烟对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05，图1，表3）。

2.3 血清let⁃7表达水平与肺通气功能的相关性分析

为探究血清let⁃7表达水平与肺通气功能之间的相关性，将 let ⁃7 与肺功能指标 FEV₁/FVC、MEF₇₅% pred、MEF₅₀%pred、MEF₂₅%pred、MMEF_75/25%pred进行了Pearson相关性分析。结果显示，let⁃7a、let⁃7c、let⁃ 7d 与 FEV₁/FVC、MEF₇₅% pred、MEF₅₀% pred、MEF₂₅% pred、MMEF_75/25%pred均呈正相关（P＜0.05），其中与 MMEF_75/25%pred的相关性最强（表4）。

MEF₇₅%pred：75%肺活量时的最大呼气流速占预计值百分比；MEF₅₀%pred：50%肺活量时的最大呼气流速占预计值百分比；MEF₂₅%pred： 25%肺活量时的最大呼气流速占预计值百分比；MMEF_75/25%pred：用力呼气中期流速占预计值百分比；FEV₁%pred：第1秒用力呼气容积占预计值百分比。

与吸烟组比较，^* P <0.05。

2.4 血清 let⁃7 表达水平与 COPD 严重程度的相关性分析

为探究COPD患者血清let⁃7表达水平与疾病严重程度之间的相关性，将let⁃7与FEV₁%pred进行了 Pearson 相关性分析。结果显示，let ⁃7a、let ⁃7d 与 FEV₁% pred 无明显相关性（P＞0.05），let ⁃ 7c 与 FEV₁%pred呈正相关（P＜0.05，表5）。

2.5 血清let⁃7对COPD的诊断价值

以 FEV₁/FVC＜0.7 为诊断慢阻肺的诊断标准，将不吸烟对照组和吸烟对照组设为阴性组，GOLDⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级组设为阳性组，绘制 let⁃7a、let⁃7c、 let⁃7d 诊断 COPD 的 ROC 曲线，结果显示 let⁃7a、 let ⁃ 7c、let ⁃ 7d 的 ROC 曲线下面积（AUC）分别为 0.808、0.708、0.761。应用 SPSS 软件的 logistic 回归分析模型，构建各指标联合诊断COPD的ROC曲线，结果显示联合指标的 AUC 为 0.828；联合指标的诊断灵敏度高于let⁃7a、let⁃7c，诊断特异度高于let⁃7c、 let⁃7d（图2，表6）。

r≤0.3表示弱相关；0.3<r≤0.6表示中等相关；0.6<r≤0.8表示强相关；r>0.8表示显著相关。

3 讨论

COPD 与高血压、糖尿病已成为中国三大慢性疾病，其患病率和病死率呈逐年上升趋势^[3]。COPD 的防治已成为我国公共卫生的重要目标，但对 COPD的认识不足导致针对COPD的防治仍落后，目前仅依靠肺功能监测及影像学检查尚不能完全明了COPD的病程具体从何时开始。已有研究者提出了“早期慢阻肺（pre ⁃ COPD）”这一概念，旨在为 COPD 提供更好的防治策略。“早期慢阻肺”这一术语是用来表示COPD的初始阶段，属于时间概念，指正处于或接近病程开始的阶段^[8]。目前对COPD的诊断简单地依赖于肺功能检测，但FEV₁和FVC会随年龄的增长而降低，以 FEV₁/FVC＜0.7 作为标准易对年轻人群诊断不足而老年人群过度诊断。因此，如何诊断“早期慢阻肺”，实现对COPD疾病进程的早期干预，对减缓肺功能的下降和改善患者的远期预后具有重要意义。

microRNA 是一类进化上高度保守的单链非编码小分子RNA，通过基因沉默和基因表达转录后调控的作用参与疾病的发生发展过程^[7]。血清 mi⁃ croRNA 检测作为一种新的技术手段，已逐步被证明可用于众多疾病的诊断。近来，研究者发现吸烟者和COPD患者血清中miR⁃21的水平较高，并且与FEV₁/FVC成反比，提示miR⁃21对诊断和治疗COPD 具有潜在价值^[9-10]。吸烟可诱导循环 microRNA 的差异表达；miR⁃149⁃3p可能通过调节TLR⁃4/NF⁃κB 信号通路来增加COPD患者的炎症反应^[11-12]。Li等^[13] 研究发现，miR⁃144⁃3p 可通过抑制肺单核细胞中 TLR2 的表达促进肺上皮细胞发生上皮间充质转化。综上，microRNA 在 COPD 炎症、气道重构过程中均有参与，但是上述研究均没有进一步做临床相关研究，目前对于microRNA在COPD中的诊断价值仍鲜有文献报道。

本课题组既往研究发现 let⁃7a、let⁃7c、let⁃7d 与 COPD 的气道炎症密切相关；暴露于香烟烟雾的小鼠，let⁃7a、let⁃7c、let⁃7d 表达量明显下降，并且 let⁃7 可能通过其靶标 IL⁃6 对 COPD 的气道重构产生重要作用^[14]。Let⁃7 作为最早发现的 microRNA 家族之一，在 2009 年就有研究提出 let⁃7 水平与异常炎症呈负相关^[15]。一项研究报告let⁃7家族与慢性黏液高分泌相关 mRNA 呈显著负相关，并且两者存在结合位点，因此 let⁃7 可能在慢性黏液分泌过多型 COPD 中起关键作用^[16]；COPD 患者诱导痰中 let⁃7c 表达亦显著下降，痰中可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNFR⁃Ⅱ）的浓度与 let⁃7c 呈负相关^[17]。上述研究均表明 let⁃7 与 COPD 的发生发展密切相关，对 COPD 的诊断存在潜在价值，这与本研究结果相吻合。

本研究发现，COPD 患者血清let⁃7表达量明显低于不吸烟对照组和吸烟对照组，但在不同分级之间没有显著性差异；同时，相关性分析结果表明，let⁃ 7 与 FEV₁/FVC、MEF₇₅% pred、MEF₅₀% pred、MEF₂₅% pred、MMEF_75/25%pred 均呈正相关，其中 MMEF_75/25% pred与let⁃7的相关性最强；let⁃7c与FEV₁%pred呈正相关，而let⁃7a、let⁃7d与FEV₁%pred无明显相关性。上述结果提示血清 let ⁃7 表达水平的低下可能与 COPD的发病相关，let⁃7可能是影响COPD发生发展的独立危险因素。let⁃7 可以有效反映患者的气流受限情况和小气道功能，特别在疾病早期，即可通过let⁃7与MMEF_75/25%pred的强相关性判断出小气道病变情况。因此，虽然血清let⁃7表达水平不能作为 COPD 严重程度的判断指标，但可为“早期慢阻肺” 的诊断提供线索。本研究以 FEV₁/FVC＜70%作为诊断COPD的金标准，利用ROC曲线进一步评价let⁃ 7作为COPD患者诊断标志物的价值，结果显示拟合曲线较好，特别是联合指标早期诊断COPD的AUC、灵敏度和特异度分别为 0.828、83.51%、70.51%，具有一定的临床应用价值。对于一些诊断不明确和无法配合肺功能检测的患者，血清let⁃7检测可能是一种更为便捷且快速的方法。

综上所述，血清let⁃7表达水平的降低与COPD 的发病有关，let⁃7对轻度COPD患者有诊断价值，可为临床及时诊断和规范治疗提供参考。

参考文献