系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）是人类发病率较高的肾小球疾病（如IgA型肾病），其病理特征是肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）的异常增生及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度分泌，患者可因肾功能衰竭而死亡^[1-2]。大鼠Thy⁃1肾炎（Thy⁃1 nephritis，Thy⁃1N）是研究MsPGN的公认模型，其肾脏病变与MsPGN极为相似^[3]。已有研究发现，不论是人的 MsPGN，还是大鼠的 Thy ⁃ 1N，其 GMC表面均有补体C5b⁃9复合物的沉积，且此C5b⁃9 多为亚溶解（sublytic）型^[3-5]。已有文献报道，sublytic C5b⁃9是诱发Thy⁃1N大鼠GMC病变的始动原，体外用sublytic C5b⁃9刺激GMC后能导致细胞的增生和 ECM的分泌等^[6-7]。

众所周知，细胞受到刺激后能开启多条信号通路，激活或上调某些信号分子、转录因子和蛋白酶类等，调控相应靶基因的转录与表达，最终促使细胞生物学行为发生改变^[7-8]。就 Thy⁃1N 而言，本课题组以往的研究已证实，在Thy⁃1N大鼠发病的肾组织（体内）和受sublytic C5b⁃9刺激的GMC（体外）中，众多信号分子、转录因子和促增生分子显著上调^[5-8]，其中肿瘤坏死因子受体相关因子 6（tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6，TRAF6）^[9] 和Krüppel 样因子 5（Krüppel⁃like factor 5，KLF5）^[8] 升高明显，且具有一定的促炎和促增生效应。

TRAF6是一个兼有E3泛素连接酶活性的多功能分子，能泛素化修饰多种因子进而调控疾病的过程^[10]，其机制涉及TRAF6作用底物的方式，如泛素分子K63或K48连接的多聚泛素化修饰，前者能提高底物的活性，而后者则可降解底物蛋白^[10-11]。 KLF5 属于含锌指结构的转录因子，其表达升高可诱导靶基因的转录与表达^[12]。本课题前期验证性实验已确定，Thy⁃1N 大鼠发病 3 h 的肾组织和用 sublytic C5b⁃9刺激3 h的GMC中，TRAF6和KLF5的表达均显著升高（达到峰值）。该结果提示，同步上调的TRAF6和KLF5之间或许有着某种联系。

为了明确 TRAF6 与 KLF5 是否存在相互结合，以及TRAF6能否通过其相应的修饰方式（K63/K48） 多聚泛素化修饰 KLF5，本研究体外利用工具细胞 HEK 293T（即 293T）观察了 TRAF6 与 KLF5 的结合及 KLF5 被 TRAF6 多聚泛素化修饰的情况，并对 TRAF6 多聚泛素化修饰 KLF5 的位点进行了鉴定。本研究为今后进一步深入探讨TRAF6与KLF5的关系及TRAF6多聚泛素化修饰调控Thy⁃1N的作用和机制奠定了重要的的实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T（HEK 293T，简称293T）细胞由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。Lipofectamine2000 来源于美国赛默飞世尔科技公司；抗⁃HA tag 抗体由武汉三鹰生物技术有限公司提供；抗⁃Ub （linkage⁃specific K63）抗体购于美国 Abcam 公司； 抗⁃DDDDK tag（Binds to FLAG^® tag sequence）抗体和抗⁃Ub（linkage⁃specific K48）抗体由武汉爱博泰克生物有限公司提供；小鼠β⁃actin单克隆抗体及免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）和 IP 细胞裂解液来源于上海碧云天生物公司；羊抗兔、鼠 IgG⁃HRP 二抗购于合肥 Biosharp 公司；MG ⁃132 购自美国 MedChemExpress公司；NheⅠ酶、EcoRⅠ酶、SalⅠ酶和BamHⅠ酶由日本TaKaRa公司供应。HA⁃KLF5、 Flag⁃TRAF6和HA⁃KLF5的所有赖氨酸位点突变质粒由安徽通用公司构建；shTRAF6、TRAF6 C70A和泛素（ubiquitin，Ub）质粒均由南京医科大学免疫学系邱文教授提供。

1.2 方法

1.2.1 293T细胞的培养

将293T细胞接种于DMEM 完全培养液（含10% 胎牛血清）中，置37℃、5% CO₂孵箱中培养48 h。当细胞融合度达到80%以上时，按1∶4比例进行传代培养。

1.2.2 质粒测序鉴定与细胞转染

首先，将安徽通用公司构建的所有带有GFP标签的质粒进行酶切、琼脂糖电泳和DNA测序，测序结果行BLAST比对鉴定。在明确质粒构建成功后，先将培养的293T细胞接种到6孔板，待其融合度达 80%以上时进行质粒的细胞转染，即用DMEM稀释 Lipofectamine2000 和待转染的质粒，静置 5 min 后将两者混合，再静置 15 min 后加入 293T 细胞，置 37℃、5% CO₂条件下继续培养48 h。用荧光显微镜观察质粒的转染效率。

1.2.3 IP实验

将 HA ⁃KLF5 和 Flag ⁃TRAF6 共转染 293T 细胞 48 h 后，加入 IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解细胞30 min，12 000 r/min离心30 min后吸取上清，同时取少量全细胞裂解液作为Input，剩余裂解液中加入 1 μg 抗⁃Flag tag 抗体或抗⁃HA tag 抗体和80 μL protein A/G⁃beads（IgG为阴性对照），4℃摇晃孵育过夜。之后，4℃，3 000 r/min离心5 min，弃去上清，将管底的protein A/G⁃beads 用1 mL裂解缓冲液洗3~4次。最后加50 μL的蛋白Loading buffer，沸水煮7 min，12 000 r/min离心5 min，保存于-20℃ 用于后续免疫印迹（immunoblotting，IB）实验。

1.2.4 IB实验

取等量（30 μg/泳道）IP得到的蛋白裂解物分别进行SDS⁃PAGE 凝胶电泳2 h。用湿转法将蛋白转印到PVDF 膜上（0.3 A，120 min）。之后，用5％脱脂牛奶室温封闭 2 h，再加入相应的一抗，4℃孵育过夜。TBST 液漂洗3次（每次10 min）后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，用ECL化学发光检测。最后对比内参β⁃actin，行半定量分析。

1.2.5 多聚泛素化水平的检测

将Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5与Ub质粒或与shTRAF6 或TRAF6 C70A质粒共转染293T细胞36 h后，再用 10 μmol/L MG132 处理 12 h。用含蛋白酶抑制剂的 IP 裂解缓冲液处理细胞，裂解细胞后 30 min 行 12 000 r/min 离心 30 min，其余 IP 和 IB 操作步骤同上 1.2.3 和 1.2.4 所述。最后以 HA tag 定量目的蛋白，检测其多聚泛素化的修饰水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0进行统计统计学分析，所有实验均独立重复3次，所得定量数据以均数±标准误（$\stackrel{-}{x}$± s，$\stackrel{-}{x}$）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonfferoni法。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 293T细胞中TRAF6与KLF5存在作用

2.1.1 Flag⁃TRAF6和HA⁃KLF5质粒测序正确

将公司构建的Flag⁃TRAF6和HA⁃KLF5质粒进行酶切电泳和DNA测序，经BLAST比对后证实，目的DNA片段已正确插入pIRES⁃EGFP载体中。表明Flag ⁃TRAF6 和 HA ⁃KLF5 质粒均构建成功（图1）。之后，将 Flag ⁃ TRAF6 和 HA ⁃KLF5 质粒共转染至 293T细胞48 h，观察表达GFP的细胞占总293T细胞的百分比。结果显示，质粒转染GMC 48 h后，转染效率可达到70%以上。

HA⁃KLF5或Flag⁃TRAF6质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳的条带。

2.1.2 293T细胞中TRAF6可与KLF5结合

为了检查 TRAF6 与 KLF5 能否结合，我们将 Flag⁃TRAF6与HA⁃KLF5表达质粒共转染至293T细胞后48 h，分别用抗 HA 抗体和抗Flag抗体进行IP，之后再行相应的 IB 实验。结果发现，TRAF6 与 KLF5存在相互结合（图2）。

2.2 293T 细胞中过表达或沉默 TRAF6 对 KLF5 多聚泛素化修饰的影响

为了确定TRAF6是否对KLF5进行多聚泛素化修饰并明确其泛素化修饰的方式，我们将HA⁃KLF5 和Ub质粒与Flag⁃TRAF6质粒共转染293T细胞48 h 进行检测。结果表明，过表达 TRAF6 增加了 KLF5 K63连接的泛素化水平，但其对KLF5 K48连接的泛素化修饰无明显影响（图3）。此外，将HA⁃KLF5、Ub和Flag⁃TRAF6质粒与shTRAF6质粒共转染293T细胞 48 h 时发现，沉默 TRAF6 基因可明显降低 KLF5K63连接的泛素化水平，且对KLF5 K48连接的泛素化修饰无明显影响（图3）。

A：用HA标签抗体行IP/IB检测显示，HA⁃KLF5与 Flag⁃TRAF6存在结合；B：用Flag标签抗体行IP/IB检测发现，Flag⁃TRAF6与HA⁃KLF5也存在结合。

将Flag⁃TRAF6、shTRAF6、HA⁃KLF5及Ub质粒共转染293T细胞48 h，IP/IB检测KLF5 K63和K48连接的泛素化水平。A：IB条带；B：半定量分析，两组比较，^**P <0.01（n=3）。

2.3 TRAF6 的 E3 泛素连接酶活性缺失可影响 KLF5 K63位多聚泛素化修饰

为了确定KLF5 K63连接的多聚泛素化是否依赖于TRAF6 E3泛素连接酶活性，我们将HA⁃KLF5、 Ub 质粒与 Flag⁃TRAF6 野生型（WT）质粒或 TRAF6C70A突变体（即第70位半胱氨酸突变为丙氨酸）质粒共转染 293T 细胞 48 h。IP/IB 结果显示，TRAF6 WT可增加KLF5 K63连接的多聚泛素化，而酶催化活性缺失的 TRAF6 C70A 突变体对 KLF5 K63 连接的多聚泛素化修饰无明显影响（图4）。

将Flag⁃TRAF6、Flag⁃TRAF6 C70A、HA⁃KLF5及Ub质粒共转染293T细胞48 h，然后进行IP/IB检测。A：IB条带；B：半定量分析，两组比较， ^**P <0.01（n=3）。

2.4 TRAF6经K63连接的多聚泛素化修饰KLF5相应的赖氨酸

为了鉴定 TRAF6 经 K63 连接的多聚泛素化修饰KLF5的相应赖氨酸位点，将KLF5赖氨酸位点突变质粒分别与 TRAF6 和 Ub 质粒共转染至 293T 细胞48 h。IP/IB实验发现，只有KLF5 K99和K100赖氨酸位点突变后，KLF5 K63 连接的多聚泛素化水平显著降低（图5A~C）。此外，保守性分析结果显示，不同物种的KLF5氨基酸序列在K99和K100位点均呈高度保守状态（图5D）。以上结果提示， KLF5 K99 和 K100 赖氨酸为 KLF5 的多聚泛素化修饰位点。

A~C：将Flag⁃TRAF6质粒和Ub质粒分别与不同KLF5赖氨酸位点突变质粒（A：KLF5赖氨酸位点K31~K151的突变；B：KLF5 赖氨酸位点 K199~K417 的突变；C：KLF5 赖氨酸位点 K439 的突变）共转染 293T 细胞 48 h，然后进行 IP/IB 检测；D：不同物种 KLF5 氨基酸序列在 K99 和 K100处高度保守。

2.5 KLF5 K99 或 K100 及 K99/K100 联合突变可下调KLF5 K63位多聚泛素化修饰

为了确证 KLF5 的 K99 或 K100 单个位点突变以及K99与K100联合突变能对KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰产生影响，我们分别将 KLF5 WT 或 K99、K100、K99/K100 联合突变的质粒与 TRAF6 和 Ub 质粒共转染至 293T 细胞并进行 IP/IB 检测。结果发现，KLF5 K63 连接的多聚泛素化水平均显著下降，但以转染KLF5 的K99/K100联合突变质粒的细胞下降更为明显（图6）。

3 讨论

泛素化是蛋白质翻译后修饰（post⁃translationalmodification，PTM）的一种形式，是由E1、E2和E3泛素酶活化、结合和连接三步级联反应将Ub分子连接到底物上的过程^[10]，其中E3泛素连接酶能催化Ub，通过其C端甘氨酸与底物蛋白的赖氨酸残基之间形成异肽键和共价结合，并借此调控靶蛋白的功能或命运^[11]。

TRAF6是一种兼有E3连接酶活性的功能分子，能对多种蛋白进行不同类型的泛素化修饰，进而参与疾病的发生与发展^[11，13]。有文献报道，TRAF6可经 K48 或 K63 连接的方式多聚泛素化修饰转录因子，K48 连接的多聚泛素化能使蛋白被招募到 26S 蛋白酶体进行降解，而K63连接的多聚泛素化则不降解蛋白，但可激活转录因子的活性^[13-15]。已知KLF5 是一种转录因子，能通过其锌指结构上的 DNA 结合域与靶基因启动子上的 GC 框和 CACCC 元件结合，调控基因的转录^[12，16]。有资料显示， KLF5能被E3连接酶进行泛素化修饰，进而诱导出不同的生物学效应^[16]。

将TRAF6过表达与Ub质粒及KLF5（WT）或 K99（K99R）或K100（K100R）突变质粒或两者联合（K99/100R）突变质粒分别共转染293T细胞，然后进行IP/IB检测。A：IB条带；B：半定量分析，两组比较，^* P <0.05，^**P <0.01（n=3）。

本课题组多年来一直从事实验性 MsPGN—— 大鼠Thy⁃1N基因表达调控的研究^{[3，5，7，9-10]}。先前研究证实，无论是在 Thy ⁃1N 大鼠的肾组织，还是用 sublytic C5b⁃9 刺激的 GMC 中，TRAF6 和 KLF5 的表达均见升高^[8，10]。鉴于TRAF6能多聚泛素化修饰转录因子已被证实^[10]，因此，为了明确TRAF6和KLF5 的关系，利用具有高转染性和易于培养的293T工具细胞^[17]，检查了TRAF6与KLF5的结合及TRAF6多聚泛素化修饰 KLF5 的方式。结果发现，细胞转染 TRAF6 和 KLF5 表达质粒后，其表达的两种蛋白可相互结合，且 TRAF6 的表达与否还能相应增加或减少 KLF5 K63 连接的多聚泛素化，但对其 K48 相连的多聚泛素化修饰并无影响。此外，细胞共转染 TRAF6 活性位点突变（TRAF6 C70A）和 KLF5质粒后，也未测到KLF5 K63的多聚泛素化修饰。

已知TRAF6泛素化修饰蛋白质上的氨基酸（位点）是其赖氨酸残基^[11，13-14]，而KLF5蛋白含有19个赖氨酸^{[12，16，18]}。为了确定 KLF5 被 TRAF6 K63 多聚泛素化修饰的位点，本研究将 KLF5 的全部赖氨酸进行单个突变或几处相近赖氨酸联合突变以构建相应的突变质粒，在酶切电泳和测序鉴定成功后，分别与 TRAF6 及 Ub 质粒共转染 293T 细胞并检测 KLF5 K63 连接的多聚泛素化水平。结果显示， KLF5 K99R或K100R以及K99R/K100R联合突变均导致 KLF5 K63 连接的多聚泛素化明显下降，且以 K99R/K100R联合突变转染的细胞更为显著。这一结果表明，TRAF6 K63 多聚泛素化修饰 KLF5 的位点为K99和K100。

值得一提的是：293T 细胞是一种被广泛用于 PTM研究的工具细胞，其优点不仅在于其外源性质粒转染细胞效率高，而且在血清剥夺的情况下还能快速生长，并易于培养和进行体外实验以验证分子之间的相互作用等^[17]。鉴于本课题之前体内外研究 Thy⁃1N 时已经发现 TRAF6 和 KLF5 的表达均明显上调，加之有文献已报道了 TRAF6 与 KLF5 的作用及作用机制^{[9-10，12，16]}，因此为了深入探讨大鼠 Thy⁃1N发病过程中，升高的TRAF6与KLF5之间的关系和相关泛素化修饰的作用及其机制，先利用工具细胞 293T 观察了外源性 TRAF6 与 KLF5 之间的相互作用和TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其位点，并取得了上述研究结果。不过，由于我们要研究的是大鼠 Thy⁃1N，且体外培养的细胞是大鼠的 GMC，故在 293T 细胞中得到的这一结果仅仅是给了一种提示。考虑到组织细胞本身比较复杂，影响因素颇多，后续是否会出现与前述 293T 细胞一致的研究结果还有待于今后在大鼠GMC和 Thy⁃1N大鼠的肾组织中进一步的验证。

参考文献