黑色素瘤（melanoma，MM）是一种侵袭性皮肤恶性肿瘤，约占全球皮肤恶性肿瘤相关死亡人数的 80%，发病率呈上升趋势^[1]。因此，鉴定MM的新诊断标志物和治疗靶点势在必行。研究表明，长链非编码 RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）可以通过调节靶基因表达调控大多数恶性肿瘤的形成和发展，包括 MM^[2]。据报道，lncRNA⁃核富集转录本 1 （nuclear enriched abundant transcript 1，lnc⁃NEAT1） 在MM中过度表达，可促进MM细胞的增殖、迁移和侵袭^[3-4]。然而，lnc⁃NEAT1在MM中作用机制仍未完全阐明。

lncRNA可以作为微小RNA（microRNA，miRNA） 海绵或竞争性内源性 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）介导信使RNA（messenger RNA，mRNA） 表达以实现其生物学功能。miR⁃29c⁃3p 是 miR⁃29 家族成员，通过调控基因表达参与MM进展，对评估患者预后具有重要价值^[5-6]。硫酸软骨素蛋白多糖4 （chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）是一种在人 MM 细胞中发现的跨膜蛋白多糖，参与 MM 的迁移和侵袭，与MM的形成和预后不良有关，是MM中的关键癌基因^[7-8]。生物信息学分析显示lnc⁃NEAT1 和miR⁃29c⁃3p之间可能存在靶向调控作用，且miR⁃ 29c ⁃3p 可与 CSPG4 的 3′⁃ 非翻译区（untranslated region，UTR）结合。因此，本研究试图探究lnc⁃NEAT1、 miR⁃29c⁃3p 和 CSPG4 之间的关系，并进一步分析 lnc⁃NEAT1/miR⁃29c⁃3p/CSPG4调节轴在MM进展中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人MM细胞系（A375、A875、M14）和小鼠黑色素瘤细胞系（B16）购自武汉普诺赛生命科技有限公司 （货号：CL⁃0014、CL⁃0255、CL⁃0287、CL⁃0029），在含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM 培养基中生长。人表皮黑色素细胞（HE⁃ Ma ⁃LP）购自上海北诺生物科技有限公司（货号： C0245C），培养于含有人黑素细胞生长添加剂⁃2 （HMGS⁃2）的 M254 培养基中。以上这些细胞系置于37℃的5% CO₂加湿培养箱中培养。

1.1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清（Gibco公司，美国）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；lnc⁃NEAT1干扰质粒（si⁃NEAT1）和对照干扰质粒（si⁃NC）、miR⁃29c⁃3p 模拟物（miR⁃29c⁃3p mimic） 和对照（miR⁃NC）、miR⁃29c⁃3p 抑制剂（miR⁃29c⁃3p inhibitor）和对照（inhibitor ⁃NC）由上海 GenePharma 公司构建；Lipofectamine3000 转染试剂（Sigma ⁃ Aldrich公司，美国）；Transwell小室（Corning公司，美国）；兔源一抗CSPG4、Ki⁃67、E⁃钙黏蛋白（E⁃cadherin）、 N⁃钙黏蛋白（N⁃cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Abcam 公司，英国）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega 公司，美国）。HERAcell240i CO₂ 细胞培养箱、Nano ⁃Drop ND⁃2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；ABI Prism^® 7500 型荧光定量 PCR 仪（应用生物系统公司，美国）；iMark680 多功能酶标仪 （Bio ⁃Rad 公司，美国）；Ts2 ⁃ FC 倒置荧光显微镜 （Nikon公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR（quantitative real⁃time PCR， RT⁃qPCR）检测mRNA表达

使用 TRIzol 试剂从 HEMa⁃LP 细胞和 MM 细胞中提取总 RNA，Nano⁃Drop ND⁃2000 分光光度计测量其在 260 nm 与 280 nm 处的吸光度比值，确认总 RNA 的纯度及浓度。使用 PrimeScriptTM RT 试剂盒将总 RNA（1 μg）逆转录为 cDNA。使用该 cDNA 作为模板，在荧光定量 PCR 系统上进行 RT ⁃qP⁃ CR。热循环条件如下：95℃预变性 10 min；然后 95℃变性 15 s和60℃退火1 min，40个循环。采用 2^-ΔΔCt方法进行相对定量分析，lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 的相对表达标准化为 GAPDH，U6 作为 miR⁃29c⁃3p 的内部对照。

1.2.2 细胞转染

B16 细胞接种于 6 孔板中（5×10⁴ 个/孔），当细胞融合 80%以上时，进行转染。实验分为（control 对照组，不进行任何转染）、si⁃NC组（转染si⁃NEAT1 阴性对照 si⁃NC）、si⁃NEAT1 组（转染 si⁃NEAT1）、 si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组（共转染si⁃NEAT1和miR⁃ 29c⁃3p inhibitor 阴性对照 inhibitor⁃NC）、si⁃NEAT1+ miR⁃29c⁃3p inhibitor组（共转染si⁃NEAT1和miR⁃29c⁃ 3p inhibitor）。使用Lipofectamine3000将si⁃NEAT1、 miR⁃29c⁃3p inhibitor及其阴性对照转染相应孔中的细胞。si⁃NEAT1的转染浓度为50 nmol/L，miR⁃29c⁃ 3p inhibitor的转染浓度为100 nmol/L。转染6 h后更换培养液，然后在37℃、5% CO₂下常规培养48 h，用 RT⁃qPCR检测转染效率，收集转染细胞用于下一步分析。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖活力

将细胞以 2×10³ 个/孔的密度接种到 96 孔板中，转染 6 h 换液后于 37℃下孵育 0、24、48、72 h。在设定的时间点向每个孔中加入 20 μL MTT 溶液（5 μg/mL），在 37℃下孵育 4 h。然后每孔加入200 μL 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），使用酶标仪记录490 nm处的光密度值。

1.2.4 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力

通过Transwell24孔室检查细胞迁移和侵袭能力。对于迁移能力测定，细胞转染 48 h 后，制备无血清细胞悬液，然后将200 μL无血清细胞悬液（2× 10⁴ 个/孔）接种到Transwell小室（8 μm孔径）的上室中，同时将500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培养基添加到下室。随后，在37℃下孵育48 h。将迁移到膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定5 min，再用 0.1%结晶紫染色10 min，随机选择5个视野在倒置显微镜下计数细胞并拍摄图像。对于侵袭能力测定，Matrigel胶预先涂在Transwell小室的上室中，并在37℃的培养箱中固化1 h，其余步骤与迁移能力测定的步骤相同。

1.2.5 蛋白质印迹（Western blot）法检测蛋白表达

用 RIPA 裂解缓冲液从 MM 细胞中提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。然后将蛋白质经 10%， SDS⁃PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。膜用5%脱脂牛奶封闭后，在4℃下与一抗孵育过夜。使用的一抗如下：CSPG4 （1∶1 000）、Ki⁃67（1∶1 000）、E⁃cadherin（1∶1 000）、 N⁃cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和GAPDH （1∶3 000）。然后在室温下，将膜与辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）孵育1 h。最后，通过增强化学发光试剂进行显色反应，使用Image J软件观察并量化蛋白质条带。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测

使用生物信息学 StarBase v2.0 数据库（https：// starbase.sysu.edu.cn/index.php）和 TargetScan Humam 7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）分析预测miR ⁃29c⁃3p 与 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 的结合位点。将野生型（WT）和突变型（MUT）lnc⁃NEAT1 的序列克隆到pGL3载体中，构建NEAT1⁃WT和NEAT1⁃MUT质粒。类似地，构建了 CSPG4⁃WT 和 CSPG4⁃MUT 质粒。将 B16 细胞接种在 24 孔板中，培养至 80%汇合时，使用 Lipofectamine3000 转染试剂将这些重组荧光素酶报告质粒分别与 miR⁃29c⁃3p mimic 或 miR⁃NC共转染到B16细胞中。转染48 h后，用PLB 细胞裂解缓冲液裂解细胞。然后，通过双荧光素酶报告基因系统检测B16细胞裂解物中萤火虫和海肾的荧光素酶活性。将细胞裂解物的相对双荧光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。

1.2.7 裸鼠移植瘤实验

20 只雄性 BALB/c 裸鼠（7 周龄，体重 20~22 g） 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。si⁃NC、 si⁃NEAT1和si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC、si⁃NEAT1+miR⁃ 29c⁃3p inhibitor 分别通过慢病毒载体（上海吉玛公司构建）转染B16细胞获得稳定表达。将所有裸鼠随机分成 4 组（每组 5 只）：si⁃NC 组、si⁃NEAT1 组和 si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组、si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor 组，将转染的 B16 细胞悬液（浓度为 2× 10⁷ 个/mL）皮下注射到每只裸鼠的右下腹。每周测量并通过公式计算肿瘤体积（V）：V=（长×宽²）/2。 4周后，通过颈椎脱位法处死裸鼠，切除肿瘤。将肿瘤组织称重，一部分用 4%多聚甲醛固定用于免疫组织化学（IHC）染色，另一部分用于提取总RNA和蛋白质，通过 RT ⁃ qPCR 和 Western blot 检测 lnc ⁃ NEAT1、miR⁃29c⁃3p和CSPG4水平。

1.2.8 IHC法检测肿瘤组织中Ki⁃67阳性表达

将4%多聚甲醛固定的肿瘤组织包埋在石蜡中并切成 4 μm 厚的切片。经脱蜡、水化后，用 0.3% H₂O₂消除内源性过氧化物酶。5%正常山羊血清封闭后，将切片与 Ki⁃67 抗体（1∶100）孵育过夜，然后在室温下用二抗（1∶200）孵育30 min。DAB显色后，用苏木精复染30 s。在光学显微镜下观察组织切，并用Image⁃Pro Plus 6.0软件计算Ki⁃67阳性表达的积分光密度（integral optical density，IOD）。

1.3 统计学方法

采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量数据均符合正态分布，以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$± s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较用SNK⁃q检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MM 细胞中 lnc⁃NEAT1、miR⁃29c⁃3p 和 CSPG4 mRNA水平比较

与HEMa⁃LP相比，MM细胞系（A375、A875、M14、 B16）中 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 mRNA 水平显著升高 （P <0.05），miR⁃29c⁃3p水平显著降低（P <0.05），其中，B16 细胞中 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 mRNA 水平均高于其他MM细胞（P <0.05，表2）。因此，选择B16 细胞用于后续实验。

与HEMa⁃LP细胞相比，^* P <0.05；与B16细胞相比，^# P <0.05；与 A875细胞相比，&P <0.05；与M14细胞相比，^∆ P <0.05。

2.2 转染后各组细胞中lnc⁃NEAT1、miR⁃29c⁃3p和 CSPG4水平比较

与control组、si⁃NC组相比，si⁃NEAT1组细胞中 lnc⁃NEAT1、CSPG4 的 mRNA 和蛋白水平显著降低 （P <0.05），miR⁃29c⁃3p 水平显著升高（P <0.05）； 与 si⁃NEAT1 组、si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组相比， si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor 组细胞中 CSPG4 的 mRNA和蛋白水平显著升高（P <0.05），miR⁃29c⁃3p 水平显著降低（P <0.05，图1，表3）。

2.3 敲低NEAT1对B16细胞增殖活性的影响

在转染后常规培养 48、72 h 时，与 control 组、 si⁃NC 组相比，si⁃NEAT1 组细胞增殖活性显著降低（P <0.05）；与 si⁃NEAT1 组、si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组相比，si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor组增殖活性显著升高（P <0.05，表4）。

A：control组；B：si⁃NC组；C：si⁃NEAT1组；D：si⁃NEAT1+inhibitor⁃ NC组；E：si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor组。

2.4 敲低NEAT1对B16细胞迁移、侵袭能力的影响

Transwell 迁移与侵袭实验结果显示，与 control 组、si⁃NC组相比，si⁃NEAT1组迁移与侵袭细胞数显著降低（P <0.05）；与si⁃NEAT1组、si⁃NEAT1+inhibitor⁃ NC 组相比，si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor 组迁移与侵袭细胞数显著增多（P <0.05，图2，表5）。

2.5 敲低 NEAT1 对 B16 细胞中 Ki⁃67、E⁃cadherin、 N⁃cadherin、Vimentin蛋白表达的影响

与control组、si⁃NC组相比，si⁃NEAT1组Ki⁃67、 N⁃cadherin 与 Vimentin 蛋白水平显著降低，E⁃cad⁃herin蛋白水平显著升高（P <0.05）；与si⁃NEAT1组、 si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3 p inhibitor组Ki⁃67、N⁃cadherin与Vimentin蛋白水平显著升高，E⁃cadherin蛋白水平显著降低（P<0.05，图3）。

与control组相比，^* P <0.05；与si⁃NC组相比，^# P <0.05；与si⁃NEAT1组相比，^&P <0.05；与si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，^∆ P <0.05。

与control组相比，^*P <0.05；与si⁃NC组相比，^# P <0.05；与si⁃NEAT1组相比，^&P <0.05；与si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，^∆ P <0.05。

与control组相比，^* P <0.05；与si⁃NC组相比，^# P <0.05；与si⁃NEAT1组相比，^& P <0.05；与si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，^∆ P <0.05。

A：control组；B：si⁃NC组；C：si⁃NEAT1组；D：si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组；E：si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor组。与control组相比，^* P <0.05；与 si⁃NC组相比，^# P <0.05；与si⁃NEAT1组相比，^&P <0.05；与si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，^∆ P <0.05；n=6。

2.6 双荧光素酶报告基因检测结果

使用生物信息学工具预测到 miR⁃29c⁃3p 包含 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 的结合位点（图4A、C）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与转染 miR⁃NC 相比，转染miR⁃29c⁃3p mimic后，细胞中NEAT1⁃WT和 CSPG4⁃WT的荧光素酶活性显著降低（P <0.05），而 NEAT1⁃MUT和CSPG4⁃MUT的荧光素酶活性未受显著影响（P >0.05，图4B、D）。

2.7 敲低NEAT1对裸鼠移植瘤生长的影响

裸鼠体内致瘤性实验结果显示，在第2、3、4周时，与si⁃NC组相比，si⁃NEAT1组肿瘤体积和重量显著降低（P <0.05）；与si⁃NEAT1组、si⁃NEAT1+inhibi⁃ tor⁃NC组相比，si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor组肿瘤体积和重量显著升高（P <0.05，图5）。

2.8 敲低NEAT1对裸鼠移植瘤中lnc⁃NEAT1、miR⁃ 29c⁃3p、CSPG4表达水平的影响

与 si⁃NC 组相比，si⁃NEAT1 组肿瘤组织中 lnc⁃ NEAT1、CSPG4 mRNA 和蛋白水平显著降低，miR⁃ 29c⁃3p水平显著升高（P <0.05）；与si⁃NEAT1组、si⁃ NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor组肿瘤组织中CSPG4 mRNA和蛋白水平显著升高，miR⁃29c⁃3p水平显著降低（P <0.05，图6）。

A：miR⁃29c⁃3p与lnc⁃NEAT的靶向预测结果；B：miR⁃29c⁃3p与lnc⁃NEAT的双荧光素酶报告基因检测结果；C：miR⁃29c⁃3p与CSPG4的靶向预测结果；D：miR⁃29c⁃3p与CSPG4的双荧光素酶报告基因检测结果；与miR⁃NC相比，^* P <0.05；n=6。

A：裸鼠肿瘤图像；B：肿瘤体积；C：肿瘤重量；与 si⁃NC 组相比，^* P <0.05；与 si⁃NEAT1 组相比，^&P <0.05；与 si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组相比，^∆ P <0.05；n=5。

2.9 敲低 NEAT1 对裸鼠移植瘤中 Ki⁃67 阳性表达的影响

与si⁃NC组相比，si⁃NEAT1组肿瘤组织中Ki⁃67 阳性表达显著降低（P <0.05）；与 si⁃NEAT1 组、 si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃ 3p inhibitor组肿瘤组织中Ki⁃67阳性表达显著升高 （P <0.05，图7）。

3 讨论

MM 是最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤类型，其转移能力和病死率高，严重影响人类健康。阐明复杂的分子机制对寻找治疗MM的新型生物靶点至关重要。lncRNA通过调节肿瘤相关基因或通路充当癌基因或肿瘤抑制基因^[9]。本研究阐明了lnc⁃NEAT1在 MM 细胞系中上调，lnc⁃NEAT1 的敲低可能通过 miR⁃29c⁃3p/CSPG4 轴对细胞增殖、迁移、侵袭产生抑制作用；同时，lnc⁃NEAT1 敲低干扰了体内肿瘤的生长，且下调 miR⁃29c⁃3p 可明显减弱 lnc⁃NEAT1 敲低对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。以上研究表明，lnc⁃NEAT1 在 MM 进展中充当肿瘤启动子，为 lnc⁃NEAT1促进MM中肿瘤生长的分子机制研究提供了有力的证据。

A：si⁃NC；B：si⁃NEAT1；C：si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC；D：si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor；与 si⁃NC 组相比，^*P <0.05；与 si⁃NEAT1 组相比， ^&P <0.05；与si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，^∆ P <0.05；n=5。

A：免疫组化染色检测裸鼠肿瘤组织中 Ki⁃67 表达；B：Ki⁃67 阳性表达的定量分析；与 si⁃NC 组相比，^*P <0.05；与 si⁃NEAT1 组相比， ^&P <0.05；与si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC组相比，^∆ P <0.05；比例尺=50 μm；n=5。

本研究探讨了lnc⁃NEAT1在MM中的作用机制。 lncRNA可以在肿瘤的恶性进展中充当ceRNA^[10-11]。 ceRNA通过减少miRNA与靶基因的结合，调节特定基因的表达^[12-13]。Ding 等^[14] 和 Liu 等^[5] 已经发现在 MM中lnc⁃NEAT1上调和miR⁃29c⁃3p下调。在本研究中，与 HEMa⁃LP 相比，MM 细胞中 lnc⁃NEAT1 表达升高，miR⁃29c⁃3p 表达降低。当 lnc⁃NEAT1 下调时miR⁃29c⁃3p增加，这表明两者可能通过某些作用共同影响 MM 细胞。因此，本研究对 lnc⁃NEAT1、 miR⁃29c⁃3p和MM之间的关系进行了探究，结果显示，lnc⁃NEAT1和miR⁃29c⁃3p之间存在负调控作用，敲低 lnc⁃NEAT1 可上调 miR⁃29c⁃3p 表达，抑制 MM 细胞的增殖、侵袭和迁移。双荧光素酶分析表明 lnc⁃NEAT1 靶向并抑制 MM 细胞中的 miR⁃29c⁃3p。为了验证 lnc⁃NEAT1 通过抑制 miR⁃29c⁃3p 来调节 MM进展，本研究在敲低lnc⁃NEAT1的基础上，采用 miR⁃29c⁃3p inhibitor转染以下调miR⁃29c⁃3p。结果显示，下调 miR ⁃29c ⁃3p 可阻断 lnc⁃NEAT1 敲低对 MM细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。此外，体内实验进一步证实了lnc⁃NEAT1 siRNA对MM裸鼠移植瘤生长的抑制作用被 miR⁃29c⁃3p inhibitor 逆转。基于上述证据可以得出结论，lnc⁃NEAT1可能通过下调miR⁃29c⁃3p来促进MM进展。

miR⁃29c⁃3p在许多人类肿瘤的恶性进展中充当肿瘤抑制因子^[15-16]。特别是，miR⁃29c⁃3p 是 MM 患者生存的独立预测因子，其表达水平与MM患者区域淋巴结分期、远处转移、肿瘤直径和病理分化有关；miR⁃29c⁃3p 过表达可抑制 MM 细胞的增殖、迁移和侵袭^[5，17]。CSPG4是一种在MM上过度表达的神经嵴糖蛋白^[18]，是癌症治疗中一个有吸引力的靶点^[8，19]。生物信息学分析显示 miR⁃29c⁃3p 上存在 CSPG4 结合位点，并证明 CSPG4 是 miR⁃29c⁃3p 的潜在靶标。与之前的研究一致，本研究观察到在 MM细胞系中miR⁃29c⁃3p表达降低而CSPG4表达增加。在敲低lnc⁃NEAT1上调miR⁃29c⁃3p的同时，发现 CSPG4的基因和蛋白表达降低，而下调miR⁃29c⁃3p 可增加CSPG4表达。双荧光素酶结果证实，过表达 miR⁃29c⁃3p可降低CSPG4⁃WT的荧光素酶活性。因此，miR⁃29c⁃3p 与 CSPG4 之间存在靶向调控关系。提示，miR⁃29c⁃3p可能通过靶向MM中CSPG4发挥其抗增殖和抗转移作用。

综上所述，lnc⁃NEAT1可能通过调节miR⁃29c⁃3p/ CSPG4 轴促进 MM 的生长和转移。本研究揭示了 lnc⁃NEAT1/miR⁃29c⁃3p/CSPG4对MM生物学进展的影响，将有助于更好地了解 MM 的发病机制，并为 MM 的治疗提供参考。但本研究尚存在一定局限性，如未过表达CSPG4进一步验证lnc⁃NEAT1的调控机制，仅使用一种MM细胞系来探究lnc⁃NEAT1、 miR⁃29c⁃3p和CSPG4在MM中相互作用，在未来的研究中可通过上调 CSPG4 表达并结合更多典型的MM细胞系来验证这一结论。

参考文献