蛋白酶激活受体（protease ⁃ activated receptor， PAR）属 G 蛋白偶联受体，包括 4 个亚型。其中， PAR2作为唯一胰酶受体，功能最为特殊，可被胰蛋白酶、类胰蛋白酶等活化，在平滑肌、上皮和内皮等多种结构细胞上均有表达^[1]。研究表明，多种血管疾病进展与PAR2的激活有关，如肺动脉高压、动脉粥样硬化、糖尿病血管并发症等，提示 PAR2 在调节内皮完整性和血管稳态方面起重要作用^[2-3]。有研究显示，PAR2活化可参与内皮细胞的多种功能，如细胞增殖、血管生成及促炎介质释放等^[4-5]。Ras 同源家族成员 A（Ras homolog family member A， RhoA）作为重要的 PAR2 下游信号^[6]，被证实参与内皮功能调控^[7-8]。在研究中发现作为调节内皮完整性和血管稳态的重要来源，内皮祖细胞（endo⁃ thelial progenitor cell，EPC）存在 PAR2 表达，然其是否参与调控 EPC 功能及其相关机制目前仍知之甚少。

EPC起源于骨髓，可从外周血单个核细胞中分离提取^[9]，体内外均具有高增殖和促血管生成潜能。机体受损时，损伤部位释放趋化细胞因子可使 EPC从骨髓动员至外周血，继而迁至受损处分化为成熟内皮细胞，嵌入并修复血管^[10]。有证据证实，肺动脉高压患者循环EPC数量显著减少并伴功能障碍，提示EPC可能是血管功能异常的重要原因^[11]。近年来在一些血管相关疾病如肺动脉高压^[12]、糖尿病血管并发症^[13] 和冠心病^[14] 中，EPC作为细胞治疗的有力候选成员之一，其功能改善已成为治疗此类疾病的重要策略。

EPC表达PAR2，而PAR2激活能否调节EPC功能有待进一步研究。本研究通过体外培养EPC，观察 PAR2 活化对 EPC 增殖、迁移功能的影响及其相关因子、受体的水平变化，阐明RhoA信号在该过程中的重要作用。

1 材料和方法

1.1 材料

类胰蛋白酶（Tr，T7063，Sigma⁃Aldrich 公司，美国）；PAR2激动剂SLIGKV⁃NH2（AP，RP20334，南京金斯瑞公司），PAR2 抑制剂 FSLLRY ⁃ NH2（FS， C7865BL120⁃1，南京金斯瑞公司），RhoA 抑制剂 Y⁃ 27632（B1293，Apexbio公司，美国）；EdU细胞增殖检测试剂盒（C10310，广州锐博生物科技有限公司），人血管内皮生长因子 A（vascular endothelial growth factor⁃A，VEGF⁃A）酶联免疫吸附实验（enzyme⁃linked immuno sorbent assay，ELISA）检测试剂盒 （DVE00，R&D公司，美国），人基质细胞衍生因子1 （stromal cell⁃derived factor⁃1，SDF⁃1）ELISA 检测试剂盒（DSA00，R&D 公司，美国）；抗 PAR2 特异性抗体（ab180953，Abcam公司，英国），抗RhoA特异性抗体（ab187027，Abcam公司，英国），抗甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（glyceraldehyde ⁃3⁃phosphate dehydrogenase， GAPDH）特异性抗体（2118，CST 公司，美国），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（sc⁃2004，San⁃ ta Cruz 公司，美国）；EGM ⁃ 2 BulletKit 培养基 （CC3162，Lonza公司，美国）。

本研究方案经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理号：2019⁃SR⁃184），并获得所有患者的书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人外周血分离EPC，培养于EGM⁃2完全培养基中，置 37℃、5% CO₂条件的细胞培养箱孵育，每隔 2~3 d更换培养基，直至细胞密度达80%后，胰酶消化、传代。选择第4~6代细胞进行实验。

1.2.2 EdU掺入实验

EdU掺入实验检测 EPC 增殖功能。细胞铺至孔板并饥饿 6~8 h 后，以不同浓度类胰蛋白酶、 SLIGKV⁃NH2 分别刺激 EPC 24 h，抑制剂联合组在 PAR2 激动剂给药前 30 min 予 FS 或 Y ⁃27632；50 μmol/L EdU 孵育 4 h 后，固定、破膜、Apollo 及 Hoechst 染色。通过计算 Apollo、Hoechst 双染的细胞核数目以评估细胞增殖率。随机选取 5 个不同视野进行拍照计数，重复 3 次后进行统计学分析。

1.2.3 Transwell小室实验

Transwell 小室实验检测 EPC 迁移功能。细胞铺板并饥饿 6~8 h，低血清培养基调整细胞密度后以 150 μL 细胞悬液接种于 Transwell 上室，置于 24 孔板中，加入含不同刺激物的完全培养基于下室；细胞培养箱孵育 24 h，弃培养基、PBS 清洗，多聚甲醛固定 30 min 后棉签擦拭移除小室上层细胞，结晶紫染色后 PBS 清洗、晾干，显微镜拍照。随机选取 4 个不同视野进行拍照计数并统计学分析。

1.2.4 实时定量PCR

实时定量PCR（real⁃time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测 EPC 中 VEGF⁃A、血管内皮生长因子受体 2（vascular endothelial growth factor receptor⁃2，VEGFR⁃2）、SDF⁃1、趋化性细胞因子受体 4（C⁃X⁃C chemokine receptor type4，CXCR⁃4）mRNA 表达量。100 pmol/L Tr或100 μmol/L SLIGKV⁃NH2刺激EPC 24 h，PBS清洗2遍，使用TRIzol提取细胞总 RNA，逆转录试剂盒逆转录后加入 SYBR 进行实时定量PCR实验。扩增条件为下：预变性95℃30 s → 变性95℃ 5 s → 退火60℃ 30 s → 延伸72℃ 10 min，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，计算 2^-∆∆CT值，最后比较目的基因相对表达量。所用引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成：人 GAPDH 上游引物5′⁃AGAAGGCTGGGGCTCATTTG⁃3′，下游引物5′⁃ AGGGGCCATCCACAGTCTTC⁃3′；人VEGF⁃A上游引物 5′⁃AGGGCAGAATCATCACGAAGT⁃3′，下游引物 5′⁃AGGGTCTCGATTGGATGGCA⁃3′；人VEGFR⁃2上游引物 5′⁃GGCCCAATAATCAGAGTGGCA⁃3′，下游引物5′⁃CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT⁃3′；人SDF⁃1 上游引物 5′ ⁃ATTCTCAACACTCCAAACTGTGC ⁃3′，下游引物 5′ ⁃ACTTTAGCTTCGGGTCAATGC ⁃3′；人 CXCR ⁃ 4 上游引物 5′ ⁃ ACTACACCGAGGAAAT⁃ GGGCT ⁃ 3′，下游引物 5′ ⁃ CCCACAATGCCAGTTA⁃ AGAAGA⁃3′。

1.2.5 ELISA

ELISA检测EPC上清中VEGF⁃A 及SDF⁃1的蛋白表达量。100 pmol/L 类胰蛋白酶或 100 μmol/L SLIGKV⁃NH2刺激EPCs 24 h后收集细胞上清，采用人VEGF⁃A、SDF⁃1 ELISA 检测试剂盒，根据说明书进行检测。

1.2.6 蛋白质免疫印迹实验

蛋白质免疫印迹实验检测 EPC 中 PAR2、RhoA 蛋白水平。不同药物作用 EPC 24 h 后收集细胞， 200 μL RIPA 冰上裂解 15 min；收集裂解物， 12 000 r/min 离心 20 min 后吸取上清，十二烷基硫酸钠蛋白变性；制胶上样，80~120 V 恒压电泳， 300 mA 恒流PVDF转膜；含Tween 20的Tris洗涤缓冲液（tris buffered saline tween，TBST）配制 5%脱脂奶粉溶液，室温封闭 1 h；加入抗 PAR2（1∶1 000）、 RhoA（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体 4℃孵育过夜；TBST洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 抗体孵育；ECL 化学发光液曝光，并用 Bio⁃ Rad成像系统及Image J软件进行分析。

1.3 统计学方法

应用 Graphpad 6.0 进行分析处理，计量资料以均数±标准误（$\stackrel{-}{x}\pm S_{\stackrel{-}{x}}$）表示，单因素方差分析比较多组间差异。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 类胰蛋白酶、SLIGKV⁃NH2抑制EPC增殖与迁移

Tr 是 PAR2 的天然激动剂。免疫印迹结果显示，EPC存在PAR2表达，给予Tr100 pmol/L处理24 h 后，PAR2表达上调（P <0.05），PAR2抑制剂FS可取消此效应（图1A），提示类胰蛋白酶可通过PAR2引起自身反馈性表达增高。细胞增殖、迁移是血管生成的重要事件。本研究结果显示，不同浓度（1、10、 50、100、1 000 pmol/L）Tr处理24 h可导致细胞增殖、迁移功能明显减弱（P <0.05，图1B、C）。AP作为激活 PAR2 的模拟合成肽，亦可剂量依赖性（1、10、 50、100、200 μmol/L）抑制 EPC 增殖与迁移（P <0.05，图1D、E），浓度≥100 μmol/L 时差异具有显著性。据上述结果，后续实验选择 100 pmol/L Tr 和 100 μmol/L AP进行。

2.2 PAR2激活下调EPC增殖、迁移相关细胞因子及受体表达

EPC释放的生长、趋化因子及其受体参与缺血组织处细胞的增殖与迁移。实时定量 PCR 结果显示，Tr、SLIGKV⁃NH2下调VEGF⁃A、VEGFR⁃2、SDF⁃1、 CXCR⁃4的mRNA水平（P <0.05，图2A）。ELISA结果亦显示，PAR2激活后EPC上清中VEGF⁃A及SDF⁃1 的蛋白表达量显著下降（P <0.05，图2B）。

2.3 PAR2抑制剂FS取消PAR2活化引起的EPC功能改变

为了探讨PAR2激动剂引起的EPC功能改变是否直接经由PAR2受体实现，本研究选用PAR2抑制剂 FS 以阻断 PAR2 受体功能。200 μmol/L FS 可取消2种激动剂诱导的EPC细胞增殖、迁移功能下调效应（P <0.05，图3）。

2.4 RhoA参与介导PAR2活化引起的EPC增殖、迁移抑制过程

作为 PAR2 下游的重要信号分子，RhoA 参与调节细胞的骨架重塑、黏附运动等功能。免疫印迹结果显示，Tr、AP 处理 EPC 24 h 后，RhoA 表达显著上调（P <0.05），PAR2 抑制剂 FS 可取消此上调效应（图4A）。同时，予以特异性 RhoA 抑制剂 Y⁃27632（图4B，C），PAR2 激动剂引起的 EPC 增殖、迁移抑制被逆转（P <0.05）。

3 讨论

本研究通过分离、培养人外周血来源的EPC，发现选择性激活 PAR2 可经由 RhoA 信号抑制 EPC 增殖、迁移功能。PAR2 激动剂 Tr、PAR2 合成激动剂 AP 可下调增殖、迁移相关细胞因子及受体表达、上调RhoA信号，该效应分别被PAR2及RhoA抑制剂取消，提示PAR2⁃RhoA信号轴可能是EPC参与血管修复、再生的重要机制之一。

1997年，Asahara等^[9] 通过免疫磁珠法首次从人外周血单核细胞层分离出EPC，其在心血管系统疾病^[14]、呼吸系统疾病^[12] 等多种病理生理过程中的重要作用均被证实。研究显示，野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠接受骨髓来源的EPC后，右心衰表现明显减轻，存活率也显著提高^[12]，提示 EPC 是肺动脉高压等血管相关疾病治疗的有效手段。

PAR2 参与血管功能调控过程，研究表明动脉粥样硬化斑块中PAR2表达上调^[3]；PAR2激活可引起内皮屏障破坏、血管通透性增加、炎症介质上调，导致血脑屏障结构与功能紊乱^[4]，提示内皮细胞调控中PAR2至关重要。然而，PAR2在EPC中的作用尚不清楚。鉴于EPC是内皮细胞的干性前体细胞，本研究通过原代培养EPC以探究PAR2激活对其功能的影响，阐明血管稳态调控的EPC机制及其作为潜在治疗靶标的可能性。

EPC增殖作为细胞关键功能，对内皮再生及伤口愈合十分重要。本研究探究了PAR2激活对EPC 增殖的影响，同时选用Tr、AP^[15] 进行观察。结果显示两者效应相似，均剂量依赖性抑制 EPC 增殖功能，效应均被PAR2抑制剂取消，表明EPC增殖抑制确实通过活化 PAR2 实现。同时，EPC 迁移作为机体受损后细胞归巢至损伤部位的重要事件，对血管的精准修复颇为关键。本研究观察了PAR2活化对 EPC 迁移的影响，发现激活 PAR2 可显著抑制 EPC 迁移功能，抑制 PAR2 活性可取消该效应。上述结果均表明，PAR2 参与调控 EPC 功能，特异性活化 PAR2可直接抑制EPC增殖与迁移。

生理状态下EPC主要定居于骨髓干细胞池，损伤后接受相关信号、从骨髓动员至外周血，继而定位于受损组织、发挥生物学效应。该过程受多种信号调控，如 VEGF⁃A、SDF⁃1、VEGFR⁃2、CXCR⁃4 等。 VEGF⁃A作为多效生长因子，可与受体VEGFR⁃2结合，通过促进EPC增殖以促进血管生成^[16]；SDF⁃1作为关键干细胞归巢因子，SDF⁃1/CXCR⁃4 轴在调控 EPC迁移中发挥重要作用^[17]。本研究发现PAR2激活显著下调VEGF⁃A、SDF⁃1及相关受体表达，提示 PAR2抑制 EPC 功能可能与此相关。然而，有研究显示 PAR2 激活可促 EPC 迁移及成管而不影响增殖^[18]，与本研究结果存在差异。究其原因，可能由于该研究类胰蛋白酶组同时加入了肝素，改变了类胰蛋白酶结构（肝素参与类胰蛋白酶组装^[19]），造成细胞反应差异；此外研究中 EPC 来源不同，也可能是造成差异的重要因素。

RhoA作为PAR2的重要下游信号，参与细胞骨架重塑、运动黏附以及凋亡等过程^[20]。本研究显示，RhoA 是 PAR2 诱导 EPC 功能变化的重要通路。活化 PAR2 可上调 EPC 中 RhoA 表达，PAR2 抑制剂可取消该效应，特异性抑制RhoA活性可逆转PAR2 激活诱导的 EPC 功能下调。作为细胞运动调节相关的核心因子，Rho家族参与细胞事件中的诸多环节，RhoA通过其效应器Rho相关蛋白激酶，促肌动球蛋白收缩以参与细胞运动相关过程。研究表明，细胞增殖过程中 RhoA 表达下调，抑制肌动球蛋白形成与收缩，进而促进与干/祖细胞增殖、分化相关的 Yes 相关蛋白/含 PDZ 结合序列转录共激活子 （Yes ⁃ associated protein/transcriptional co ⁃ activator with PDZ binding motif，YAP/TAZ）核转位，细胞增殖能力增强^[21]；而细胞运动过程中，除细胞前端板状伪足提供动力外，下调的 RhoA 导致细胞后缘肌动球蛋白收缩力减弱，有利于松散细胞与细胞以及细胞与基质间的连接，使其易向不同方向延伸^[22-23]。本研究中RhoA表达受PAR2激活而上调，可能通过调控肌动球蛋白的形成并增强其收缩，在增殖迁移相关动力学事件中发挥作用。而另有研究发现， RhoA还可通过调节肌动蛋白的再分布及组装、参与 SDF⁃1诱导的细胞迁移^[24]；本研究发现PAR2活化诱导SDF⁃1下调，或可通过改变RhoA信号、参与EPC 迁移抑制过程。

综上所述，本研究表明 PAR2 可通过上调 EPC RhoA信号抑制细胞增殖、迁移功能，PAR2可能作为 EPC功能调控的重要靶标。鉴于EPC在内皮修复与再生中的重要作用，研究结果为血管相关疾病的治疗提供了新思路。然而本研究仅在体外进行了相关探索，仍存在不足，有待在体内进一步展开深入研究。

参考文献