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糖尿病是一种高患病率的代谢性疾病，以胰岛损伤和胰岛功能障碍为特征[1]。胰岛由β细胞、α细胞、δ细胞、PP细胞和ε细胞组成，分别分泌胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等物质维持机体糖稳态。其中，胰岛β细胞占胰岛细胞的50%~80%[2]，分泌具有强烈降血糖的胰岛素。因此，如何增加胰岛β细胞数量和保护胰岛β细胞功能是糖尿病治疗的重要研究方向。精氨酸代琥珀酸合成酶⁃1（argininosucci⁃ nate synthetase1，ASS1）是尿素循环中的限制酶，可催化瓜氨酸和天冬氨酸缩合形成精氨酸的直接前体——精氨酸代琥珀酸，后者可转化为精氨酸并生成 NO 和 L⁃瓜氨酸，是 NO 合成的潜在限速步骤[3]。本课题组前期研究发现模拟 2 型糖尿病（diabetes mellitus type2，T2DM）发病过程的高脂喂养鼠胰岛 ASS1 mRNA平均表达量较正常对照组降低[4]，与其他团队发现的高脂喂养鼠胰岛ASS1蛋白表达量较对照组降低一致[5]。研究发现在促炎因子干扰素 （interferon，IFN）⁃γ、白介素（interleukin，IL）⁃1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）⁃α干预下，增加丙酮酸羧化酶活性可促进三羧酸循环生成更多的天冬氨酸，天冬氨酸在ASS1催化下与瓜氨酸反应生成精氨基琥珀酸，促进精氨酸生成尿素，减少NO生成，减轻IFN⁃γ、IL⁃1β和TNF⁃α对胰岛β细胞的损伤[6]。亦有研究发现高表达ASS1可减少棕榈酸诱导的胰岛β 细胞凋亡和减轻β细胞功能障碍[7]。目前有关ASS1 的研究主要在炎症、脂毒性等病理环境下进行，有关 ASS1在生理条件下对胰岛β细胞的研究尚需完善，故本研究旨在评估ASS1生理条件下表达量的高低对胰岛β细胞增殖、凋亡的影响，并探索其潜在的机制。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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小鼠胰岛素瘤β⁃TC6细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。胎牛血清、0.25% EDTA⁃胰酶（Gibco公司，美国）；DMEM高糖培养基、青链霉素混合液、RIPA 裂解液、嘌呤霉素、Alexa Fluor647/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Lipofectamine3000（Invitrogen 公司，美国）；ASS1⁃siRNA（广州锐博生物科技有限公司），慢病毒载体（上海汉恒生物科技有限公司）；Trizol（Thermo Fisher公司，美国）；增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒、羊抗兔IgG⁃HRP抗体、羊抗鼠IgG⁃HRP抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix、SYBR Green Realtime PCR Master Mix （TaKaRa 公司，日本）；Caspase⁃3 抗体、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）抗体、β⁃actin 抗体 （CST 公司，美国）；Bcl⁃2相关X蛋白（Bcl⁃2 associated X protein，Bax）抗体、B细胞淋巴瘤⁃2（B⁃cell leukae⁃ mia⁃2，Bcl⁃2）蛋白抗体、ASS1抗体、细胞核增殖抗原 （Ki67）抗体和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammali⁃ an rapamycin target protein，mTOR）抗体（Abcam 公司，美国）；TUNEL凋亡检测试剂盒（苏州宇恒生物科技有限公司），EdU细胞增殖检测试剂盒（广州锐博生物科技有限公司），CCK⁃8试剂盒（MCE公司，美国）； 荧光定量 PCR 仪（Roche 公司，美国），流式细胞仪 （BD公司，美国），酶标仪（Thermo Fisher公司，美国），荧光显微镜（ZEISS公司，德国）。
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1.2 方法
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1.2.1 细胞培养
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β⁃TC6细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的高糖DMEM完全培养基，在含5% CO2的37℃ 恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行实验。
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1.2.2 siRNA敲低ASS1
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ASS1 的 siRNA 序列为 5′⁃CTACAAAAGTGGT⁃ CATCCA⁃3′。采用Lipofectamine3000并根据说明书转染β⁃TC6 细胞，实验分为 Blank 组、si⁃NC 组、si⁃ ASS1 组。细胞提前 1 d 种于 6 孔板中，待细胞生长融合度达40%时进行转染。用Opti⁃MEM培养基稀释Lipofectamine3000，与含siRNA的Opti⁃MEM培养基混匀后室温静置 15 min，用 Opti⁃MEM 培养基和 β⁃TC6完全培养基按9∶1比例补足反应体系后加入 6孔板中，24 h后更换培养基，48 h后收集细胞进行相关实验。
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1.2.3 慢病毒过表达ASS1
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采用慢病毒载体构建ASS1过表达稳转细胞株，实验分为Blank组、OE⁃NC组、OE⁃ASS1组。细胞提前1 d种于25 cm2 细胞培养瓶中，24 h后更换培养基为2.5 mL含病毒的β⁃TC6完全培养基，4 h后补足培养基至 5 mL。转染 24 h 后，每 24 h 更换新鲜培养基。细胞生长至70%融合度时进行传代。传代后用含4 μg/mL嘌呤霉素的β⁃TC6完全培养基筛选稳转株。
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1.2.4 qRT⁃PCR检测
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用 Trizol 提取细胞总 RNA，测量浓度后取 500 ng RNA 逆转录合成 cDNA。cDNA 用 DEPC 水 1∶5 稀释后，根据 SYBR Green Realtime PCR Master Mix qPCR说明书冰上制备PCR反应液，在StepOne⁃ Plus 实时荧光定量 PCR 仪器上进行实时荧光定量 PCR 反应，95℃10 s 预变性；95℃ 5 s、60℃ 1 min， 40个循环；95℃ 15 s、60℃ 1 min、15℃ 1 s。以空白对照组为内参，目的基因相对表达量以ΔCT表达。
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1.2.5 Western blot检测
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RIPA 裂解液冰上提取细胞蛋白，用增强型 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性后，取30 μg样品进行10% SDS⁃PAGE凝胶电泳2 h，湿转法将蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，加入一抗4℃孵育过夜。TBST洗涤后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤后 ECL发光液显影，凝胶成像仪曝光蛋白条带。
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1.2.6 CCK⁃8实验
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将β⁃TC6细胞按3×104 个/孔接种于96孔板中，给予处理后更换新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK⁃8 检测液，于培养箱中孵育1.5 h，用酶标仪在450 nm 波长测每孔吸光度，计算细胞增殖活力。细胞活力= （A 干预-A 空白）/（A 对照-A 空白）×100%（A 干预：含细胞、 CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度值；A 空白：含培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度值；A 对照：含细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度值）。
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1.2.7 5⁃乙炔基⁃2′⁃脱氧尿嘧啶核苷（5⁃ethynyl⁃2′⁃ deoxyuridine，EdU）法检测细胞增殖
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β⁃TC6细胞按3×104 个/孔接种于96孔板中，给予处理后更换为含 50 μmol/L EdU 的完全培养基，于培养箱中孵育 2 h，PBS 洗涤后，用 4%多聚甲醛室温固定30 min，0.5%的Tritonx⁃100于摇床上孵育 10 min，PBS洗涤后，加入Apollo染色反应液室温避光孵育30 min，0.5%的Tritonx⁃100清洗后，甲醇清洗 1次，PBS洗涤后用荧光显微镜拍照观察。
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1.2.8 AV/PI检测
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收集干预后的全部细胞至离心管中，PBS清洗后，加入195 μL Annexin V⁃Alexa Fluor 647结合液重悬细胞并转移至流式管中，每管加入 5 μL AnnexinV⁃Alexa Fluor 647，混匀后4℃孵育15 min。避光每管加入 5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液后，立即用流式细胞仪检测。
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1.2.9 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal dUTP nick⁃end labeling assay，TUNEL）检测细胞凋亡
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β⁃TC6细胞按3×104 个/孔接种于96孔板中，给予处理后，PBS洗涤2次，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛于4℃固定30 min，PBS洗涤后，0.2%TritonX⁃100 室温孵育20 min，PBS洗涤后，TUNEL平衡缓冲液孵育5 min，弃去缓冲液，加50 μL TUNEL反应混合液 37℃避光反应1 h，PBS洗涤后，每孔加入30 μL DAPI 室温孵育10 min，PBS洗涤后加入甘油封片，避光用倒置荧光显微镜拍照。
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1.3 统计学方法
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所有样本均独立重复3次。采用SPSS 26.0软件分析统计所得数据，用均数±标准差（ ± s）表示。独立样本t检验用于两组数据间比较，多组比较采用单因素方差分析，P <0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 β⁃TC6细胞中ASS1敲低和过表达体系的构建及验证
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将 si⁃ASS1 和 si⁃NC 转染到β⁃TC6 细胞 48 h 后 （转染效率约80%），收集细胞检测ASS1 mRNA和蛋白表达水平。结果显示，转染 si⁃ASS1 的细胞中， ASS1 mRNA和蛋白水平明显降低（图1A~C）。
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采用慢病毒载体构建ASS1过表达稳转株后，收集细胞检测ASS1 mRNA和蛋白表达水平。结果显示，ASS1过表达细胞中，ASS1 mRNA和蛋白水平显著升高（图1D~F）。
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2.2 ASS1低表达和高表达对β⁃TC6细胞增殖的影响
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与 si⁃NC 组比较，敲低 ASS1 后β⁃TC6 细胞 EdU 阳性细胞率减少（P＜0.05，图2A、B），细胞增殖活力下降（P <0.05，图2C）。与 OE⁃NC 组比较，过表达 ASS1 后β⁃TC6 细胞 EdU 阳性细胞率和细胞增殖活力无明显差异（图3）。
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2.3 ASS1低表达和高表达对β⁃TC6细胞凋亡的影响
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与si⁃NC组比较，敲低ASS1后β⁃TC6细胞TUNEL 阳性细胞率和凋亡细胞比例明显增加（P <0.05，图4）。与 OE⁃NC 比较，过表达 ASS1 后β⁃TC6 细胞 TUNEL阳性细胞率和凋亡细胞比例下降（P <0.01，图5）。上调ASS1可抑制β⁃TC6细胞凋亡。
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2.4 ASS1低表达对β⁃TC6细胞中AIF信号通路影响
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为了探究 ASS1 对β⁃TC6 细胞增殖和凋亡作用的具体靶点，进一步研究发现，与 si⁃NC 组比较，敲低 ASS1 后 β ⁃ TC6 细胞 Bax/Bcl ⁃ 2 比值降低（P <0.001，图6A、B），cleaved Caspase⁃3/Caspase⁃3比值也降低（P <0.01，图6C、D）。同时，与si⁃NC组比较，si⁃ ASS1组AIF 的mRNA 和蛋白水平增加（P＜0.01，图6E~G）。下调 ASS1 增加β⁃TC6 细胞凋亡且不依赖Caspase途径，可能与AIF途径有关。
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A：qRT⁃PCR检测siRNA转染β⁃TC6细胞后ASS1 mRNA水平，与si⁃NC组比较，***P <0.001（n=3）；B、C：Western blot 检测siRNA转染β⁃TC6 细胞后ASS1蛋白表达水平（B）及半定量分析（C），与si⁃NC组比较，*P＜0.05（n=3）；D：qRT⁃PCR检测慢病毒感染β⁃TC6细胞后ASS1 mRNA水平，与OE⁃NC组比较，***P <0.001（n=3）；E、F：Western blot 检测慢病毒感染β⁃TC6细胞后ASS1蛋白表达水平（E）及半定量分析（F），与OE⁃NC 组比较，*P＜0.05（n=3）。
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图1 β⁃TC6细胞中ASS1敲低和过表达体系的构建及验证
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Figure1 Verification of ASS1 expression in β⁃TC6 cells after knockdown and overexpression of ASS1
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A：EdU检测胰岛β细胞增殖代表图片（×400）；B：EdU阳性细胞率比较，与si⁃NC组比较，*P＜0.05（n=3）；C：CCK⁃8检测β⁃TC6细胞增殖活力，与si⁃NC组比较，**P <0.01（n=3）。
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图2 si⁃ASS1转染β⁃TC6细胞后细胞增殖变化
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Figure2 Proliferation changes of β⁃TC6 cells after si⁃ASS1 transfection
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2.5 ASS1 高表达对β⁃TC6 细胞中 mTOR 信号通路影响
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与 OE⁃NC 组比较，过表达 ASS1 后β⁃TC6 细胞 Ki67 和 mTOR 的 mRNA 和蛋白水平均升高（P＜ 0.001，图7）。上调 ASS1 促进β⁃TC6 细胞存活可能与mTOR通路有关。
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A：EdU检测胰岛β细胞增殖代表图片（×200）；B：EdU阳性细胞率比较（n=3）；C：CCK⁃8检测胰岛β细胞增殖活力（n=3）。
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图3 ASS1过表达载体转染后β⁃TC6细胞增殖变化
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Figure3 Proliferation changes of β⁃TC6 cells transfected with ASS1 overexpression vector
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A：TUNEL检测β⁃TC6细胞凋亡代表图片（×200）；B：TUNEL阳性细胞率比较，与si⁃NC组比较，***P <0.001（n=3）；C：AV/PI流式细胞术测定 β⁃TC6细胞凋亡代表图片；D：AV/PI流式细胞术测定β⁃TC6细胞凋亡率比较，与si⁃NC组比较，*P <0.05（n=3）。
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图4 si⁃ASS1转染β⁃TC6细胞后细胞凋亡变化 Figure4 Changes of pancreatic β⁃TC6 cell apoptosis after si⁃ASS
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Figure4 Changes of pancreatic β⁃TC6 cell apoptosis after si⁃ASS1 transfection
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A：TUNEL检测β⁃TC6细胞凋亡代表图片（×200）；B：TUNEL阳性细胞率比较，与OE⁃NC组比较，*P <0.05（n=3）；C：AV/PI流式细胞术检测β⁃TC6细胞凋亡代表图片；D：AV/PI流式细胞术检测β⁃TC6细胞凋亡率比较，与OE⁃NC组比较，**P <0.01（n=3）。
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图5 ASS1过表达载体转染后β⁃TC6细胞凋亡变化
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Figure5 Changes of apoptosis of β⁃TC6 cells transfected with ASS1 overexpression vector
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3 讨论
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ASS1是尿素循环中的限制酶，在肝脏和肾脏组织中高表达。临床研究发现肥胖人群外周血单核细胞中ASS1表达较正常人降低，并且ASS1的表达与体重指数和脂肪重量呈负相关[8]，这与高脂喂养小鼠胰岛中ASS1的变化一致。既往研究结果显示 IL⁃1β、TNF⁃α及IFN⁃γ联合处理下，大鼠胰岛β细胞和人胰岛细胞团ASS1和iNOS表达水平升高，同时给予生理浓度的精氨酸或瓜氨酸时，胰岛细胞可以生成更多的 NO，后者进一步促进胰岛β细胞凋亡，损害胰岛β细胞[9]。除了ASS1，研究发现胰岛β细胞中也存在精氨基琥珀酸裂解酶、氨甲酰磷酸合成酶 1、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶⁃2、N⁃乙酰谷氨酸合酶，胰岛中β细胞存在完整的尿素循环。在 IL⁃1β、TNF⁃α和 IFN⁃γ联合处理胰岛β细胞模拟炎症环境时，促进精氨酸代谢生成尿素，减少精氨酸生成NO，可减轻胰岛β细胞凋亡[6]。本研究发现生理条件下敲低ASS1 后胰岛β细胞凋亡率增加，增殖水平下降，而高表达 ASS1后胰岛β细胞凋亡率减少，增殖水平增加。这提示ASS1对胰岛β细胞生存和功能发挥保护作用。
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mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可感知细胞外营养状态和细胞内 ATP 水平，对维持细胞生长和促进细胞增殖发挥重要作用[10]。Ki67 通常被认为是细胞增殖的标志物[11]。研究发现精氨酸可通过溶质载体（solute carrier，SLC）中溶酶体 SLC38A9 激活mTOR信号通路[12]。本研究中高表达ASS1后，胰岛β细胞存活数量增加，Ki67 和 mTOR 表达增加。因此，ASS1可能通过mTOR通路促进胰岛β细胞增殖，这与既往研究中降低胃癌细胞ASS1表达会抑制癌细胞增殖，而高表达ASS1可以通过激活mTOR信号通路促进肿瘤细胞存活具有一致性[13]。此外，研究报道L⁃精氨酸可改善糖尿病鼠胰岛β细胞功能障碍，促进胰岛β细胞恢复[14-15]。本研究仍需完善相关实验，明确精氨酸是否发挥作用。
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A、B：Western blot检测Bax和Bcl⁃2蛋白表达（A）及半定量分析（B）；与si⁃NC组比较，***P <0.001（n=3）；C、D：Western blot检测β⁃TC6细胞中Caspase⁃3和cleaved Caspase⁃3蛋白水平表达（C）及半定量分析（D），与si⁃NC组比较，**P <0.01（n=3）；E：各组AIF mRNA水平比较，与si⁃NC 组比较，***P <0.001（n=3）；F、G：Western blot检测各组AIF蛋白表达（F）及半定量分析（G），与si⁃NC组比较，**P <0.01（n=3）。
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图6 si⁃ASS1转染β⁃TC6细胞后Bax/Bcl⁃2、cleaved Caspase⁃3/Caspase⁃3和AIF的表达变化
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Figure6 Expression changes of Bax/Bcl⁃2，cleaved Caspase⁃3/Caspase⁃3 and AIF in β⁃TC6 cells after si⁃ASS1 transfection
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A：Ki67和mTOR mRNA水平比较，与OE⁃NC组比较，***P <0.001（n=3）；B、C：Western blot检测Ki67和mTOR蛋白水平（B）及半定量分析 （C），与OE⁃NC组比较，***P <0.001（n=3）。
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图7 ASS1过表达载体转染胰岛β细胞后Ki67和mTOR表达变化
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Figure7 Expression changes of Ki67 and mTOR in pancreatic islet β cells transfected with ASS1 overexpression vector
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细胞亲凋亡蛋白Bax和亲生存蛋白Bcl⁃2，这一对蛋白在线粒体介导的依赖Caspase凋亡通路中起重要作用[16]，通常用Bax/Bcl⁃2的比值反映细胞凋亡的趋势。Caspase⁃3是细胞凋亡经典信号通路的下游执行分子，凋亡早期Caspase⁃3活性增加，凋亡晚期 Caspase ⁃3 活性降低[17]。本研究使用 TUNEL 和AV/PI 法检测细胞凋亡情况，检测的是凋亡晚期细胞[18]。因此，敲低胰岛β细胞ASS1后，Caspase⁃3活性降低可能是细胞凋亡的伴随现象。正常生理状态下AIF在线粒体内参与细胞的氧化磷酸化，当细胞受到特定损伤时，AIF能够从线粒体转移到细胞核内直接诱导DNA降解而使细胞凋亡[19-20]。本研究发现敲低胰岛β细胞ASS1后，AIF在mRNA水平和蛋白水平的表达明显升高。因此，推测ASS1可能通过非经典Caspase途径介导了胰岛细胞凋亡的发生[21]，其中AIF可能发挥重要作用，但仍需要进一步研究进行验证。
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综上所述，本研究初步发现ASS1可促进胰岛β 细胞增殖，这可能与激活 mTOR 信号通路有关；而 ASS1表达抑制时，胰岛β细胞可能通过AIF途径启动细胞凋亡。但ASS1促进增殖、抑制凋亡的保护作用是否与精氨酸及其他通路相关尚未明确，仍需进一步深入研究。ASS1是否能够成为保护胰岛β细胞功能的候选调控靶点，也需要整体水平的研究进一步探索。
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摘要
目的：探讨精氨酸代琥珀酸合成酶-1（argininosuccinate synthetase 1，ASS1）对胰岛β细胞增殖与凋亡的影响及机制。方法：利用siRNA和慢病毒载体在胰岛β-TC6细胞中分别敲低和过表达ASS1；5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′- deoxyuridine，EdU）和CCK-8检测细胞增殖能力；Annexin V-PI流式细胞术和原位末端转移酶标记技术（terminal dUTP nick-end labeling assay，TUNEL）检测细胞凋亡水平；Western blot检测B细胞淋巴瘤-2（B-cell leukaemia-2，Bcl-2）蛋白、Bcl-2相关X蛋白 （Bcl-2 associated X protein，Bax）、半胱氨酸天冬氨酸酶3（Caspase3）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved Caspase- 3）、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）、细胞核增殖抗原（Ki67）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian rapamycin target protein，mTOR）的表达水平；RT-qPCR检测AIF、Ki67和mTOR mRNA水平。结果：①与对照相比，敲低ASS1后，胰岛β细胞EdU阳性率和CCK-8细胞增殖活力降低，TUNEL阳性细胞数和AV/PI检测的细胞凋亡率升高。胰岛β细胞内AIF表达量明显升高，Bax/Bcl-2比值下降，Caspase-3活性降低。②过表达ASS1后，TUNEL阳性细胞数和AV/PI检测的细胞凋亡率均较对照组降低，伴随胰岛β细胞内Ki67和mTOR表达量升高。但胰岛β细胞EdU阳性率和CCK-8细胞增殖活力无明显变化。结论： ASS1 过表达可能激活 mTOR 信号通路促进胰岛β细胞增殖；ASS1 表达降低时，胰岛β细胞可通过 AIF 途径启动细胞凋亡。 ASS1可能在胰岛β细胞的增殖和凋亡中发挥一定调控作用。
Abstract
Objective：The current study aims to investigate the effect of argininosuccinate synthetase 1（ASS1）on cell proliferation and apoptosis of pancreatic islet β cells. Methods：Small interference RNA was used to knockdown ASS1，and lentiviral vector to overexpress ASS1 in pancreatic islet β cells. The 5 - ethynyl - 2′- deoxyuridine（EdU）and CCK - 8 methods were used to detect proliferation ability，and Annexin V-PI flow cytometry and terminal dUTP nick-end labeling（TUNEL）were used to detect apoptosis. Western blot was used to examine protein expression of B -cell leukaemia -2（Bcl -2），Bcl -2 associated X protein（Bax），Caspase -3， cleaved Caspase - 3，apoptosis inducing factor（AIF），nuclear proliferation antigen Ki67 and mammalian rapamycin target protein （mTOR）. RT-qPCR was applied to detect mRNA expression of AIF，Ki67 and mTOR. Results：①Proliferation activity of pancreatic β cells detected by EdU and CCK-8 was lower when ASS1 was knockdown，and apoptosis of islet β cells examined by TUNEL method and flow cytometry was higher than that in the control group. Meanwhile，the increased AIF expression and the decreased ratio of Bax/ Bcl - 2 and the activity of Caspase - 3 were observed. ②After overexpression of ASS1, the number of TUNEL positive cells and the apoptosis rate detected by AV/PI decreased compared to the control group, accompanied by expression levels of Ki67 and mTOR increased in pancreatic islets β cells. But there was no significant change in the positive rate of EdU and proliferative activity of cells by CCK -8 detected. Conclusion：Overexpressing ASS1 in pancreatic islet β cells may activate mTOR signaling pathway to promote cell proliferation. Pancreatic islet β cells with decreased ASS1 expression may initiate apoptosis through AIF pathway. In summary，ASS1 may play a role in proliferation and apoptosis of pancreatic islet β-cells.
关键词
精氨酸代琥珀酸合成酶 ； 胰岛β细胞 ； 增殖 ； 凋亡