胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人最常见的颅内原发恶性肿瘤，疾病进展迅速，侵袭性强，预后较差^[1]。经手术、放疗和化疗综合治疗后患者中位生存时间仍不足15个月，5年生存率低于3%^[2]。在现有检查手段中，核磁共振仅能协助诊断^[3]，病理学检查虽能确诊但不适合术前诊断和长期动态检测^[4]。液体活检技术是具有解决上述问题潜力的新型检验手段，它取材便捷、创伤较小，可早期确诊、动态监测疾病进展和治疗反应来优化治疗方案^[5]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）指从肿瘤原发灶或转移灶处脱落进入血液循环的肿瘤细胞^[6-7]，是液体活检的有效取材对象。在乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌及前列腺癌等肿瘤中，CTC 检测已有临床应用^[8-11]，且CTC升高均与不良预后相关。但目前胶质瘤领域内 CTC 相关研究较少，其临床意义及应用尚处于起步阶段。为此，本研究回顾分析 2018年10月—2022年9月南京医科大学第一附属医院神经外科收治的胶质瘤患者术前术后外周血 CTC 水平，总结GBM 患者CTC 的变化特征，并探究基于CTC计数的GBM术前诊断与预后预测应用。

1 对象和方法

1.1 对象

患者纳入和排除标准：①2018年10月—2022年 9月在南京医科大学第一附属医院神经外科入院、年龄18岁及以上的患者；②行手术治疗并经术后病理学检验确诊胶质瘤；③行术前术后 CTC 检测；④ 排除合并其他肿瘤性疾病、术前术后存在急性感染、颅内出血、脑疝、血液系统疾病、风湿免疫疾病等严重并发症、合并症及使用影响免疫系统药物治疗的患者。最终纳入患者共 47 例，其中男 29 例 （61.7%），女 18 例（38.3%），年龄 24~81 岁；根据 2016 版WHO 中枢神经系统肿瘤分类，患者病理类型分别为GBM（WHO Ⅳ级）患者26例；非GBM患者 21 例，其中毛细胞星形细胞瘤（WHO Ⅰ级）2 例， WHO Ⅱ级星形细胞瘤4例，WHO Ⅲ级星形细胞瘤 1例，少突胶质细胞瘤（WHO Ⅱ级）7例，间变少突胶质细胞瘤（WHO Ⅲ级）7 例。在异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变情况方面，47例患者中共检测到IDH突变19例（40.4%），其中GBM 患者2例（10.5%），非GBM患者17例（89.5%）。

1.2 方法

1.2.1 CTC分离与计数

患者入院后次日与术后7 d内采集外周静脉血样本5 mL。血液标本使用15 mL含8%多聚甲醛溶液（Electron Microscopy Sciences 公司，美国）375 μL 的生理盐水稀释并静置 10 min。CTC 使用 8 μm 孔径的 CTCBIOPSY^® A⁃10分离装置（武汉YZYMED 公司）进行分离。留存于微孔过滤膜上的被捕获细胞使用迪夫快速染色液（武汉 YZYMED 公司）进行染色。计数5 mL外周血中CTC的数量。评估自外周血分离的细胞是否为胶质瘤 CTC 主要依据以下 6 项指标：①核异型性，即结节状、分叶状等不规则核型；②核质比＞0.8；③细胞长径＞15 μm；④细胞核深染，且染色不均；⑤核膜增厚、凹陷或皱褶；⑥细胞核异常增大或可见异常核分裂像。经上述处理捕获的细胞需至少满足以上 4 项指标，或同时满足第 6 项及任意两项其他指标则被识别为CTC。

1.2.2 血液学和影像学检查

患者术前及术后 6 d 行血常规检验，记录中性粒细胞、淋巴细胞、血小板计数，计算血小板与淋巴细胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）、中性粒细胞与淋巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio， NLR）。胶质瘤的诊断依照2016版WHO 中枢神经系统肿瘤分类标准进行，其中IDH突变情况经分子病理检测证实。获取患者原始DICOM格式核磁影像数据并导入 3D Slicer4.13.0（Harvard 大学，美国） 计算肿瘤体积、水肿体积等。主要方法：使用轴位的T1增强序列与T2⁃磁共振液体衰减反转恢复序列分别手动勾画病灶边界并行三维重建。使用软件的统计定量功能自动计算重建体积，其中瘤体体积使用T1增强序列所得结果直接计算获得，水肿体积由T2⁃磁共振液体衰减反转恢复序列异常信号总体积减去瘤体体积获得^[12]。

1.2.3 随访

患者出院后每3个月定期行电话随访。总生存期（overall survival，OS）定义为自患者术前采集CTC 血样入组至患者死亡或失访结束的时间。

1.3 统计学方法

数据比较前行 Shapiro⁃Wilk 正态性检验明确数据是否符合正态分布以便选择恰当的检验方法。符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$） 方法描述，非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）[M（P₂₅，P₇₅）]方式描述。t检验用于比较符合正态分布的不同组数据的差异，Man⁃Whitney U检验用于比较不符合正态分布的不同亚组数据的差异，Spearman相关性分析用于探究非正态分布数据的相关性，率的比较使用卡方检验和Fisher精确概率法。对于配对设计的非正态分布计量资料，使用相关样本的Wilcoxon符号秩和检验进行分析。对于 GBM诊断相关危险因素的筛查使用Logistic回归分析，并绘制受试者工作特性（receiver operating charac⁃ teristics，ROC）曲线以计算曲线下面积（area under curve，AUC）、灵敏度和特异度，以此评估相关指标对 GBM 的预测效力。使用 Kaplan⁃Meier 生存曲线分析GBM患者的生存时间同CTC计数的关系，使用 Log⁃Rank 检验行生存分析的组间比较。采用 SPSS 26.0依据前述检验方法对输入数据执行统计运算； 采用 GraphPad Prism 9.0 绘制配对设计计量资料、 ROC 曲线以及生存曲线图。对于所有检验，以 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBM患者术前CTC计数高于非GBM患者

CTCBIOPSY^®分离装置可有效分离CTC（图1）。在入组患者中，CTC总阳性率为87.2%（41/47）。其中 GBM 患者的术前 CTC 计数高于非 GBM 患者，差异有统计学意义（P=0.020）。进一步分析血液学指标发现，GBM患者的术前白细胞计数（P=0.048）、中性粒细胞计数（P=0.022）和NLR（P=0.037）均高于非 GBM 患者，而淋巴细胞比例（P=0.012）低于非 GBM 患者。在血小板计数（P=0.762）、淋巴细胞计数（P= 0.769）和PLR（P=0.528）方面，两组差异无统计学意义意义。除此以外，两组间中性粒细胞比例的差异虽未达到具有统计学意义标准（P=0.051），但亦可见 GBM患者中性粒细胞比例高于非GBM患者的趋势。GBM患者与非GBM患者在IDH突变情况方面差异存在统计学意义（P <0.001，表1）。IDH突变情况对胶质瘤患者诊断与预后意义较大，故比较了IDH突变型与野生型患者术前CTC计数水平的差异，U检验提示两类患者间差异无统计学意义（z=-1.470，P= 0.142）。

根据以上结果绘制 ROC 曲线探究 CTC 相关指标术前预测 GBM 的诊断效力。结果显示 CTC 计数单独预测 GBM 的 AUC 为 0.699（95%CI：0.548~0.849，P=0.010），灵敏度0.462，特异度0.952；NLR单独预测 GBM 的 AUC 为 0.679（95%CI：0.523~0.834， P=0.037），灵敏度1.000，特异度0.333；CTC联合NLR 的AUC为0.789（95CI：0.660~0.919，P <0.001），灵敏度0.692，特异度0.875，诊断效力最高（图2）。

2.2 GBM患者术前与术后CTC计数存在差异

考虑CTC起源同原发灶情况密切相关，对原发灶的治疗可能对CTC水平产生影响，比较了GBM与非GBM患者术前与术后的CTC计数改变情况。在术后，61.7%的患者（29/47）可见CTC下降或不变，其中GBM患者为65.5%（19/29），非GBM患者为34.5% （10/29）（图3）。定量对比显示术后GBM与非GBM 患者 CTC 水平相近（z=-0.529，P=0.597），但由于两组术前水平存在差异，故CTC改变幅度亦不同。其中GBM患者手术前后改变幅度为每5 mL外周血中 3.500（0.000，10.000）个，非GBM患者为每5 mL外周血中-1.000（-2.000，1.500）个，两组间改变幅度差异具有统计学意义（z=-2.899，P=0.004）。在明确术后 CTC改变趋势与幅度后，采用相关样本Wilcoxon秩和检验比较同一患者术后 CTC 数量是否同术前存在差异。结果显示GBM患者术后CTC数量由术前的每 5 mL 外周血中 6.000（1.750，19.250）个变为每 5 mL 外周血中 2.000（0.000，8.500）个，手术前后差异显著（z=-2.761，P=0.006）。非GBM患者术前术后 CTC水平差异无统计学意义（z=0.395，P=0.693）。

2.3 GBM患者中高CTC计数提示预后不良

以术前每 5 mL 外周血 CTC≥11 个为阈值将GBM患者分为高CTC组和低CTC组，并分析两组术前 CTC 计数和血液学指标的关系。结果显示两组白细胞计数（P=0.017）、中性粒细胞计数（P=0.031） 以及淋巴细胞计数（P=0.018）差异具有统计学意义，血小板（P=0.188）、NLR（P=0.938）与PLR（P=0.116） 差异无统计学意义。为明确 CTC 同肿瘤的体积和结构是否相关，进一步比较了两组术前CTC计数和影像学指标的关系。在 26 例 GBM 患者中，排除了 9 例术前于外院行MR而缺少原始DICOM数据的患者，剩余17例患者影像学数据分析结果显示肿瘤体积（P=0.137）、水肿体积（P=0.659）与水肿/肿瘤比值 （P=0.670）在两组间差异无统计学意义（表2）。

a：t检验，b：U检验，c：皮尔逊卡方检验。

两组比较，^* P＜0.05。

26 例 GBM 患者随访过程中 13 例患者失访，12 例患者出现疾病进展并最终死亡，1 例患者生存。行Kaplan⁃Meier生存分析显示低CTC组患者平均生存时间（23.333±5.404）个月，高 CTC 组平均生存时间（8.643±2.516）个月，差异有统计学意义（P= 0.017，图4）。

3 讨论

CTC作为从肿瘤病灶脱落并进入外周血液循环的肿瘤细胞，在肿瘤转移过程中发挥重要作用。CTC液体活检与侵入式组织活检相比，具有样本易获取易保存、可提供动态监测信息、反映肿瘤细胞基因组转录组等多组学信息的优势。胶质瘤被认为是局限于中枢神经系统内的肿瘤，仅有0.4%~2% 发生颅外转移^[13]，转移部位多位于肝、肺、淋巴结，提示胶质瘤亦存在经血液播散途径^[14]。Müller等^[15]从胶质瘤患者外周静脉血中分离出胶质纤维酸性蛋白阳性细胞，首次确认了胶质瘤同样存在 CTC。李铭孝等^[16]报道外周血中胶质瘤 CTC 阳性率可达 90.9%，且呈现数量随胶质瘤级别增高而逐渐增加的趋势。本研究中各级别胶质瘤患者术前外周血 CTC阳性率达87.2%，且GBM患者术前CTC计数显著高于非GBM患者。该结果与现有研究结论相符，提示生成CTC是胶质瘤的常见生物学行为。

a：t检验，b：校正t检验，c：U检验，d：Fisher精确概率法。e：排除了9例术前于外院行MR而缺少原始DICOM数据的患者资料。

既往研究提示多种肿瘤中 CTC 数量与肿瘤预后关系密切。Amato 等^[17]报道在前列腺癌患者中，每7.5 mL外周血CTC计数≥5个提示患者预后不良，且与患者无进展生存期与OS负相关。在转移性乳腺癌中，Cristofanilli等^[18]报道每7.5 mL外周血CTC≥ 5个可作为疾病的总体预后预测指标；Janni等^[19]报道在经新辅助化疗后的乳腺癌患者中，每7.5 mL外周血CTC≥1个可作为独立预后预测指标。在胶质瘤中 CTC 的预后预测报道较少。本研究发现术前高CTC 的GBM 患者OS较低CTC 患者显著缩短，提示术前 CTC 水平对 GBM 预后有预测价值，术前高 CTC 提示 GBM 患者预后不良。在术后 CTC 改变方面，GBM 患者经手术治疗后 CTC 多表现为下降。Zhang 等^{[2 0]}分析 79 例 WHO Ⅰ至Ⅳ级胶质瘤患者随访结果，报道术后端粒酶阳性CTC残留（每4 mL 外周血CTC＞1个）患者的OS较CTC阴性患者显著缩短，且在各级别胶质瘤中术后CTC残留均与无病生存期及OS缩短相关。该结论同本研究结论有差异，但由于CTC分离方法和判定标准不同，结论间的比较存在一定困难。

本研究还进一步探究了GBM患者CTC计数与血液学、影像学指标的关系。结果提示术前高CTC 的 GBM 患者和低 CTC 的 GBM 患者间白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数差异有统计学意义，而影像学指标差异无统计学意义。胶质瘤可分泌多种细胞因子，募集中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等多种非肿瘤细胞并构成独特的肿瘤微环境^[21]。瘤内中性粒细胞浸润程度同胶质瘤级别密切相关，高中性粒细胞浸润预示患者预后不佳^[22-23]。Wang等^[24] 发现术前外周中性粒细胞计数及淋巴细胞计数与胶质瘤级别及预后相关，NLR＞3.2提示预后不良。Zha等^[25]根据免疫组化所见瘤内中性粒细胞染色情况计算免疫组化评分并行半定量分析，发现外周中性粒细胞计数同瘤内浸润中性粒细胞评分呈显著正相关，同时亦提出中性粒细胞可经中性粒细胞胞外诱捕网激活HMGB1/RAGE/IL⁃8轴促进胶质瘤进展。以上研究均提示外周中性粒细胞计数可部分反映颅内胶质瘤病灶的炎症反应强度。本研究发现 GBM 患者的术前中性粒细胞与 NLR 水平均显著高于非 GBM 患者，CTC 与 NLR 联合行 GBM术前诊断较为准确，高于任一指标单独应用，结论与现有研究相符，提示 CTC 与炎症反应强度相关。

国内2021版《循环肿瘤细胞临床应用与实验室检测专家共识》的发布，标志着以 CTC 为代表的体液检测也正逐步进入临床应用阶段^[26]。共识中提及 CTC 计数可用于多种实体肿瘤的疗效评价和预后评估，应结合具体肿瘤类型和CTC检测方法选择合适的判断阈值，也说明CTC检测具有较好的应用前景，但也需要更多临床研究和指南规范来进一步拓实。本研究结果初步展示了 CTC 检测在协助 GBM患者临床诊断和预测预后中的应用价值，但也存在一定局限性，例如样本量较少，为单中心研究，目前缺少对胶质瘤CTC 的公认定义及检测手段导致研究结论推广存在难度。

参考文献