Pumilio家族蛋白是一类高度保守的RNA结合蛋白，在哺乳动物中存在 Pumilio1（Pum1）和 Pum⁃ ilio2（Pum2）两种Pumilio蛋白，它们在结构上高度相似，并且在靶标及功能上存在冗余^[1]。Pum1、Pum2蛋白参与胚胎发育^[2]、生殖细胞发育^[3]、细胞周期进展^[4]、神经反应^[5] 和记忆形成^[6] 等生理过程，尤其与神经退行性疾病、癌症等人类疾病的发生发展有着重要的联系。目前研究报道，Pumlilio通过不同途径调控多种肿瘤的发生发展^[7]，Pum1 在卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和结肠癌中高表达，通过多种调控轴来影响肿瘤的增殖、转移和侵袭等^[8-12]；Pum2在子宫颈癌、乳腺癌和膀胱癌中的高表达预示着更短的生存期^[13-15]， Pum1和/或Pum2在肿瘤细胞中的降低，可影响相应的肿瘤抑制因子，进而影响肿瘤的生长^[16-17]。因此， Pumilio是否可以作为肿瘤治疗靶标蛋白的关键，是其缺失对生命机体的影响大小。由于Pumilio对于细胞的早期分化以及原肠胚形成过程至关重要，Pumilio 双敲小鼠在胚胎期8.5 d死亡^[3]，出生后Pumilio对个体影响及功能研究显得尤为重要。

本研究利用 R26 ⁃ CreER^T2 小鼠与 Pum1^flox/flox Pum^2-/-小鼠进行交配获得基因型为 R26⁃ER^T2 Cre/+ Pum1^flox/flox Pum^2-/-的雄鼠，注射他莫昔芬建立了诱导性全身Pumilio基因敲除小鼠模型，通过PCR、West⁃ ern blot和RT⁃PCR技术表征各组织敲除效果，以及对重要器官重量、睾丸病理改变、生殖细胞增殖和凋亡等结果进行分析，探索他莫昔芬诱导的小鼠各器官中 Pum1 敲除情况和雄性生殖系统受到的影响，为深入研究Pumilio在出生后的功能和肿瘤治疗提供了重要依据及关键的研究工具。

1 材料和方法

1.1 材料

R26⁃CreER^T2 小鼠购自美国麻省理工大学的Tyler Jack实验室。Pum1诱导性敲除小鼠是在Pum1基因的第9和第10号外显子的两端插入loxp序列，Pum2敲除小鼠是在第10和第11外显子之间插入β⁃geo基因造成基因缺陷。小鼠饲养于南京医科大学医药动物实验中心生殖医学国家重点实验室模式动物研究基地SPF级动物房，室温控制在20~22℃，湿度 50％~70％，光照周期 12 h/12 h。饲养过程中保持充足食物和水，垫料每周更换 1 次。繁殖采用 1 只雄鼠和2只雌鼠同笼的方式进行。实验动物使用获得南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会同意（IACUC⁃1903052⁃1）。

1.2 方法

1.2.1 基因型鉴定

收取各组织后，剪下少量器官组织溶于50 mmol/L NaOH 溶液，沸水浴 30 min。冷却后加入 20 μL 1 mol/L的Tris⁃HCl（pH8.0）于涡旋仪混匀，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液进行 PCR 扩增。目的片段的扩增序列和凝胶成像的产物大小见表1。

1.2.2 BrdU实验

将切片按以下顺序和时间处理：①切片脱蜡和水化；②去除内源性过氧化氢酶，3% H₂O₂ 浸泡 10 min。ddH₂O洗3次，每次5 min；③胰蛋白酶消化液37℃ 8 min，ddH₂O 2 min×3次，37℃ ddH₂O 5 min； ④2N HCl37℃ 30 min；⑤0.1 mol/L Borax 10 min， ddH₂O 2 min×3；⑥50 mmol/L Tris⁃HCl（pH=7.6） 5 min×2，ddH₂O 2 min×3；⑦封闭、抗体孵育、显色、苏木素染色、脱水、封片。

1.2.3 Western blot检测小鼠主要脏器的敲除效率

取小鼠脑、胸腺、心、肝、脾、睾丸各约10 mg，分别加入约200 μL RIPA强裂解液，匀浆后冰上裂解，每 10 min 漩涡震 1 次，共 3 次，冰上静置 20 min， 4℃，20 000 g 离心 30 min 后取上清液即总蛋白。浓度为10%的单一胶分离蛋白，湿转到硝酸纤维素膜 （nitrocellulose filter membrane，NC）上，用含6%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，然后加入抗PUM1（1∶500）抗体在 4℃孵育过夜。次日用TBST液洗3次，每次10 min，加入二抗后室温孵育1 h，ECL化学发光仪曝光。

1.2.4 Real⁃time PCR法测定

采用 TRIzol 方法抽提 RNA，用 TaKaRa 逆转录试剂盒进行单链 cDNA 的合成（20 μL 体系； 37℃ 15 min；95℃ 5 s），在 Real⁃time PCR仪器系统上（条件95℃ 3min；95℃ 15 s；65℃ 30 s；95℃ 15 s； 40个循环）进行扩增，检测Pum1基因的表达水平，把GAPDH作为内参，利用2^-ΔΔCt值进行分析。

1.2.5 诱导敲除小鼠构建

将成年雄性 Pum1^flox/flox Pum2^-/-小鼠与雌性 R26⁃ CreER^T2 小鼠交配获得杂合子小鼠，进一步用雄性杂合子与Pum1^flox/flox Pum2^-/-雌鼠交配得到R26⁃CreER^T2 Pum1^flox/flox Pum2^-/-小鼠，本研究选择此基因型的小鼠作为对象（图1A）。实验前将 10 mg 他莫昔芬在无菌环境下溶于1 mL花生油，将同批出生的多只3周和 8 周龄 R26⁃CreER^T2 Pum1^flox/flox Pum2^-/-小鼠，采用单纯随机法分为对照组和实验组，实验组注射 100 mg/kg 体重的他莫昔芬，对照组注射等量的花生油，3 周小鼠持续注射5 d，8 周小鼠持续注射7 d （图1B）。

1.3 统计学方法

所有实验数据均采用GraphPad Prism软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）进行描述，指标间的比较采用成组 Student’s t 检验分析， P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3周小鼠诱导敲除Pumilio后睾丸重量减小，无长形精子产生

3 周 R26⁃CreER^T2 Pum1^flox/flox Pum2^-/-实验组小鼠每天注射100 mg/kg他莫昔芬花生油溶液，对照组小鼠注射等量的花生油，连续注射5 d，在注射结束的第 3 天和第 21 天收取小鼠各组织。PCR 琼脂糖凝胶电泳如图所示（图2A），下方的条带（453 bp）代表含有2个loxp位点的等位基因，其上方为敲除条带 （557 bp）。对比左侧的对照组小鼠条带，右侧两泳道为两只不同敲除组的结果，在他莫昔芬注射后，敲除组出现了敲除条带。Western blot 结果显示胸腺、心脏、肝脏和睾丸组织的Pum1蛋白水平分别下降了48%、62%、24%和46%（图2B）；Real⁃time PCR 显示小脑、胸腺、肝脏和睾丸的Pum1表达量分别下降了62%、89%、76%和54%（图2C）。结合睾丸组织的Pum1免疫组化，能够看到注射他莫昔芬后，小鼠睾丸组织Pum1蛋白含量明显下降（图3A）。在他莫昔芬注射结束的第3天对小鼠体重称量和取材后发现，实验组的小鼠大脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏的器官重量和对照组差别无统计学意义（P >0.05），而胸腺、脾脏和睾丸的重量明显下降（P <0.05，图2D），并且小鼠睾丸体重比也明显下降（图2E）。

为了探究他莫昔芬诱导敲除 Pum1 对个体生殖器官的影响，对他莫昔芬注射结束第21天的小鼠 （6 周）睾丸进行固定组织切片，HE染色发现实验组小鼠精子形成发生障碍，睾丸中无长形精子，部分生殖细胞丢失（图3B）。为了进一步探究精子发生障碍的原因，从对照组和实验组小鼠的睾丸中分别取3个不连续截面，通过BrdU和TUNEL实验对睾丸内的生精细胞进行了增殖和凋亡检测，同时对每个截面中的 BrdU/TUNEL 阳性细胞数目计数发现，实验组 BrdU 阳性细胞比例与对照组相比显著降低，实验组睾丸生殖细胞凋亡数量与对照组相比显著增加（图3C、D）。

2.2 成年小鼠Pumilio诱导敲除后未见明显异常

成年R26⁃CreER^T2 Pum1^flox/flox Pum2^-/-小鼠实验组进行每天注射他莫昔芬（100 mg/kg）花生油，对照组注射等量的花生油，连续注射 7 d，注射结束第 35 天小鼠各组织器官取材，PCR琼脂糖凝胶电泳和 Western blot结果显示，胸腺、心脏、肝脏、脾脏、睾丸的 Pum1 敲除效率约为 50%，脑组织敲除率依旧较低（图4A、B）。对睾丸的病理组织切片免疫组化和 HE染色没有发现明显的精子发生异常（图4C、D）。

3 讨论

哺乳动物中 Pumilio 蛋白 Pum1 和 Pum2 在功能上存在着冗余，Pum2^-/-小鼠除了体积和器官减小，并无其他明显表型^[5]，因此本研究利用R26⁃CreER^T2 诱导敲除模型对出生后Pum2^-/-小鼠进行Pum1诱导性敲除，直接探究Pumilio缺失对出生后小鼠体型及功能的影响。实验组3周龄小鼠大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏的器官重量无明显异常，而胸腺、脾脏和睾丸的重量明显下降。睾丸中的Pum1敲除效率约为50 %，睾丸病理切片显示实验组小鼠精子形成障碍，无长形精子形成，且睾丸生精细胞凋亡增多、增殖减慢。在实验组成年小鼠中，Pumilio仍然得到了有效敲除，但小鼠及小鼠的精子发生未见明显异常。说明成年小鼠 Pum1 和 Pum2 的双敲未引起个体明显异常，为Pumilio作为肿瘤治疗靶蛋白的研究奠定了实验基础。

Pumilio 通过不同途径调控多种肿瘤的发生发展，Pum1 和/或 Pum2 在肿瘤细胞中的降低，可影响肿瘤的生长，因此降低体内Pumilio表达水平来治疗肿瘤疾病是一种理论可行的手段。然而，Pumilio 在哺乳动物多组织器官中表达，降低 Pumilio表达是否影响个体的重要功能仍不清楚。本研究建立了一个出生后他莫昔芬诱导敲除Pumilio的小鼠模型，为Pumilio作为肿瘤治疗靶蛋白的研究提供了研究模型和理论基础。

本研究还有很多不足之处，比如敲除效率很难继续提高，他莫昔芬诱导性基因敲除系统是一种依赖雌激素受体的基因敲除系统，不同脏器中雌激素受体的表达丰度、血流量和敏感程度等存在差异，因此各脏器呈现出不同程度的基因敲除。但是本系统中大脑、小脑敲除效率如此低，甚至蛋白反常上升的现象还是出乎预料的，其他研究发现 R26⁃CreER^T2 敲除系统能够顺利敲除大脑中的相关基因^[18]，这提示Pum1在大脑中可能具有特殊性，靠腹腔注射难以得到大脑中稳定且高效的敲除。

参考文献