近年来肺癌的发病率日益增加，根据 WHO 国际癌症研究机构统计，2018年新增肺癌患者209万例（占癌症病例11.6％）和1 769万例肺癌死亡病例 （占全部肿瘤死亡患者18.4％），肺癌也是全球癌症致死的首位原因^[1]。据统计，2020年，中国肺癌新发病例总数约82万，肺癌成为最常见的恶性肿瘤，占中国癌症死亡率的23.8%^[2]。肺癌类型中，约90%是非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC），生存率低且预后较差。在过去20年里，针对NSCLC 的分子靶向疗法和免疫疗法显著提高了NSCLC 的治疗效果，但是耐药性的出现影响了NSCLC的治愈率和生存率^[3]。因此，进一步探究与NSCLC发生、发展相关的功能基因，探索新的发病机制和治疗靶点具有重要意义。

棕榈酰化修饰是指长链脂肪酸（通常是指16个碳的棕榈酸）通过硫酯键共价修饰到蛋白质半胱氨酸残基上，是一种广泛存在于生物体内动态、可逆的翻译后修饰形式，在调控蛋白质的转运、细胞定位和稳定性等方面都具有非常重要的作用，参与诸多生物学过程^[4]。催化棕榈酰化的酶属于蛋白质酰基转移酶（protein acyltransferase，PAT）家族，含有 DHHC（Asp ⁃His ⁃His ⁃Cys）序列，所以称为 DHHC ⁃ PAT。由于DHHC 基序形成锌指结构域，因此编码这些酶的基因称为锌指 DHHC（ZDHHC）。现已发现24种人类ZDHHC基因，命名为ZDHHC1~24。棕榈酰化通过两步机制进行。第一步是 DHHC 基序中的半胱氨酸残基被来自棕榈酰⁃CoA的棕榈酸酰化，形成酰基酶中间体，这一步通常称为自棕榈酰化。第二步是将棕榈酰基部分转移到蛋白质底物中的半胱氨酸巯基上^[5]。

越来越多的研究表明多种疾病与蛋白质棕榈酰化有关，如病毒感染、神经系统疾病、免疫疾病及肿瘤的发生发展^[6-9]。ZDHHC酶在肿瘤中的作用十分复杂，按照目前的研究结果，可将其分为肿瘤抑制因子、癌蛋白和预后标志物。胃腺癌中发现ZDHHC2 低表达，并与淋巴结转移相关，在高转移性小鼠结直肠腺癌模型中也发现 ZDHHC2 表达较低，因此 ZDHHC2可以作为肿瘤抑制因子^[10]。ZDHHC酶也可以被视为一种癌蛋白，如ZDHHC11在非小细胞肺癌和高级别膀胱癌的5号染色体上发生了扩增^[11]。在神经胶质瘤细胞中，高水平的ZDHHC5提示较差的预后，而ZDHHC5的过表达由肿瘤抑制蛋白p53的致癌突变驱动^[12]。ZDHHC9是ZDHHC家族中的一员，研究表明其通过发挥棕榈酰化酶的作用与乳腺癌、肾癌和白血病等癌症的进展相关^[13-15]。但ZDHHC9在肺癌，特别是NSCLC 发生发展中的作用尚不清楚。本研究探索了ZDHHC9蛋白对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其可能的机制，为 NSCLC 的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

正常支气管上皮细胞系16HBE 和NSCLC 细胞系（A549、H1299、H1703）均购自上海中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，由本实验室保存。

DMEM培养基、胎牛血清（GIBCO公司，美国）； TRIzol Reagent总RNA提取剂、脂质体 Lipofectamine2000（Invitrogen 公司，美国）；HiScript Ⅲ RT Super⁃ Mix 逆转录试剂盒、AceQ qPCR SYBR Green Master （南京诺唯赞生物科技有限公司）；CCK8试剂盒（上海碧云天）；CALNEXIN 抗体（ENZO 公司，美国）； FASN 抗体（10624⁃2⁃AP，上海 Proteintech）；ACC 抗体（#3662，CST公司，美国）；ACLY抗体（sc⁃517267， Santa Cruz公司，美国）；HRP⁃羊抗鼠二抗（Jackson公司，美国）；ECL发光液（上海天能）；引物由上海捷瑞基因有限公司合成，干扰RNA（siRNA）由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和siRNA转染

A549、H1703 细胞用添加了 10%胎牛血清、抗生素⁃抗真菌素的高糖 DMEM 培养基在 37℃ 5% CO₂湿化空气中培养。收集处于对数生长期的细胞，使细胞浓度达到6×10⁴ 个/mL，按2 mL/孔将细胞铺于细胞培养板中，待次日细胞密度达到 80％~90％时使用 Lipofectamine2000 按照说明书进行转染。

靶向 ZDHHC9 的 siRNA 序列如下：siZDHHC9⁃ 1：5′⁃GGAACACCTTTTGCTGTGA⁃3′；siZDHHC9⁃2： 5′⁃CTACAGCCATGGCAATATT⁃3′；siZDHHC9⁃3：5′⁃ CGCCTCGTATCAAGAATTT⁃3′。

1.2.2 RNA提取和实时定量PCR

收取细胞或相关转染后的细胞，使用TRIzol试剂按产品说明书提取总RNA，-80℃保存备用。按照逆转录试剂盒 HiScript Ⅲ RT SuperMix 说明书进行cDNA 合成，用AceQ qPCR SYBR Green Master 试剂盒检测相关基因表达，以β⁃actin作为内参基因。

PCR条件：95℃预变性，10 min；95℃变性，15 s； 60℃退火延伸，60 s；循环 40 次。2^-ΔΔCt方法用于 RNA水平表达量分析。引物序列如下：ZDHHC9上游引物：5′⁃CCCAGGCAGGAACACCTTTT⁃3′；下游引物：5′⁃CCGAGGAATCACTCCAGGG⁃3′；β⁃actin上游引物：5′⁃TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC⁃3′；下游引物：5′⁃TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG⁃3′。

1.2.3 细胞蛋白提取及Western blot

细胞板中加入适量 RIPA 裂解液，用细胞刮将细胞充分刮下放入1.5 mL EP管中，4℃ 12 000 r/min 离心10 min，小心转移上清至另一套EP管中用BCA 法进行蛋白浓度测定；在蛋白原液中加入 5×上样缓冲液，混匀离心放入 95℃金属浴 10 min，储存于-80℃冰箱。

Western blot：用8% SDS⁃PAGE 胶进行分离，并转移到 PVDF 膜上，膜用 TBST buffer（10 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween⁃20，pH 7.2~7.6） 配制的5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，然后加入相应抗体 4℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入HRP标记二抗室温孵育1 h，最后用ECL 发光试剂盒显色。用Image J 对条带进行灰度分析，计算蛋白的相对表达量。

1.2.4 细胞CCK⁃8增殖实验

收集处理完毕的细胞悬液，再用牛鲍板进行细胞计数，经计算配制成 2 000 个/mL 细胞的细胞悬液，铺入 96 孔板中，每孔 100 μL，以 10 μL 体积的 CCK⁃8（Cell Counting Kit⁃8）试剂加入到每个孔中。 37℃避光反应 1 h，反应结束后把细胞板放入酶标仪中震荡10 s，分别在450 nm和690 nm处读值并计算细胞的增殖能力。

1.2.5 Transwell实验

收集处理好的细胞于1.5 mL EP管中，1 500 r/min 离心5 min，用高糖无血清培养基洗2~3次，用1 mL 高糖无血清培养基重悬细胞混匀；用牛鲍板进行计数，将细胞（5×10⁴ 个细胞用于迁移实验；1×10⁵ 个细胞用于侵袭实验）加在 Transwell 小室的正上方（进行侵袭实验要在 Transwell 小室上方中加基质胶），小室的底部刚好浸入 500 μL 20％的血清培养基中。培养 24 h 后，用药棉擦去上层膜上残留的细胞。先用多聚甲醛进行细胞固定30 min，再用结晶紫对小室底部的细胞进行 60 min 染色，最后用 ddH₂O清洗3遍，风干，用倒置显微镜对小室底部的细胞进行拍照并用软件对细胞数进行统计。

1.2.6 划痕实验

在6孔板的底部平均划6条横线随后将细胞按照每孔2×10⁵ 个细胞数铺于6孔板中，贴壁后分别转染相应小干扰RNA。48 h后用10 μL的枪头在6孔板中划 3 条竖线（尽量保证竖线的宽度相等）。用PBS吸去漂浮的细胞，两组尽量选择相似的区域且宽度一样的地方作为起始点，观察24~48 h，用照相机记录伤口愈合的情况。

1.3 统计学方法

实验数据采用 Graphpad Prism 8.0 统计软件进行统计分析并制图。实验结果以均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示。对于两组间的比较，使用t检验来确定是否具有统计学意义，使用 ANOVA 单因素方差分析进行多组间的比较。每组实验均重复3次，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZDHHC9 在非小细胞肺癌组织和细胞系中表达水平升高

首先，通过生物信息技术在NCBI datasets GEO 数据库（GSE31210）中分析了肺癌临床样本和正常肺组织样本，结果显示与正常肺组织相比，ZDHHC9 在肺癌临床分期ⅠA、ⅠB、Ⅱ阶段中表达量升高 （P <0.000 1，图1A）。为了进一步确定ZDHHC9在正常的肺部组织细胞和 NSCLC 细胞中的表达水平是否存在同样差异，检测3种NSCLC细胞系（A549、 H1299、H1703）中ZDHHC9相对于支气管上皮细胞 （16HBE）的表达量，发现ZDHHC9在3种NSCLC 细胞系中均表达升高（P <0.001，图1B）。

2.2 ZDHHC9 表达水平升高与非小细胞肺癌预后不良相关

通过 GEPIA 网站（http：//gepia.cancer ⁃ pku.cn/） 分析评价ZDHHC9表达与NSCLC患者预后的关系，结果显示 ZDHHC9 表达量与 NSCLC 总生存期没有差异（图2A），但与 NSCLC 的无病生存期有显著差异，ZDHHC9 高表达组的预后显著低于低表达组 （HR=1.4，P=0.008 5，图2B）。以上结果表明ZDHHC9 在肺癌患者中表达明显上升且其表达水平与NSCLC 患者的预后不良密切相关。

2.3 敲降ZDHHC9抑制非小细胞肺癌细胞增殖

为了深入了解 ZDHHC9 在 NSCLC 发生发展中的作用，选用2种NSCLC细胞系H1703和A549，设计 3条干扰RNA（siZDHHC9）进行敲降，Real⁃time qPCR 验证敲降效率。发现干扰后，ZDHHC9的mRNA水平较对照组均明显降低（P <0.01，P <0.001，图3A、 B）。后续我们选择siZDHHC9⁃2开展相关实验。为确定ZDHHC9对细胞增殖的影响，利用CCK8法检测了ZDHHC9敲降后的细胞增殖活力，结果表明，敲降 ZDHHC9能显著抑制H1703细胞（图3C）和A549细胞（图3D）的增殖活力（P <0.05）。

2.4 敲降 ZDHHC9 抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭

为了研究 ZDHHC9 是否影响 NSCLC 细胞的迁移和侵袭，首先用划痕实验检测了ZDHHC9敲降后的 NSCLC 细胞。结果表明，在 H1703 细胞（图4A） 和A549细胞（图4B）中ZDHHC9的表达水平降低后划痕伤口愈合较为缓慢，表明敲降ZDHHC9后会抑制NSCLC细胞的迁移。接下来，采用Transwell实验做进一步检测。通过观察转移到 Transwell 小室底部的细胞数量，我们发现 ZDHHC9 表达降低后， H1703 细胞（图4C、E）和 A549 细胞（图4D、F）发生迁移和侵袭的数目明显减少，表明敲降ZDHHC9后可以抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭。

2.5 敲降ZDHHC9抑制脂肪酸合成关键酶的表达

为了进一步探究 ZDHHC9 促进 NSCLC 细胞增殖侵袭迁移的机制，利用TCGA数据集对患者进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA），结果显示ZDHHC9表达与脂肪酸代谢及脂肪酸合成呈正相关（图5A、B，P <0.01）。进一步在 H1703 细胞中敲降 ZDHHC9 后，检测 3 个脂肪酸合成关键酶脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、乙酰辅酶 A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、 ATP柠檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）的蛋白表达变化。结果显示，与对照组相比，ZDHHC9敲降后脂肪酸合成关键酶的表达水平均显著降低（图5C、D，P <0.05），提示 ZDHHC9 可能通过调控脂肪酸合成代谢促进NSCLC细胞增殖侵袭迁移。

3 讨论

蛋白质的翻译后修饰是调控蛋白功能的关键步骤，在癌细胞中，通过调节增殖相关的蛋白质翻译后修饰持续提供增殖信号，导致癌细胞的异常增殖。蛋白质翻译后修饰包括乙酰化、过硫化、甲基化、泛素化和脂质化^[16]。肉豆蔻酰化、异戊烯化和棕榈酰化是最常见的脂质修饰^[17]。近年来，研究发现蛋白棕榈酰化在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、RAS基因（ratsarcoma， RAS）、细胞程序性死亡⁃配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PD⁃L1）等多种肿瘤相关信号通路中起重要作用，影响肿瘤的发生发展和治疗效果。越来越多的证据表明 ZDHHC 家族成员影响肿瘤的发生和发展，如：ZDHHC2 的表达量减少与胃腺癌预后不良相关；ZDHHC7 和 ZDHHC22 介导的棕榈酰化可激活细胞外信号调节激酶1/2（extra⁃ cellularregulatedkinase1/2，ERK1/2）从而促进垂体瘤细胞增殖^[10，18]。

ZDHHC9为棕榈酰基转移酶家族中的一员，已有报道称ZDHHC9与肿瘤发生进程密切相关，ZDHHC9 失活导致白血病关键致癌基因 RAS 棕榈酰化减少从而抑制白血病发展^[15]；通过特异性突变ZDHHC9 减弱PD⁃L1棕榈酰化，可使乳腺癌细胞对T细胞杀伤敏感，从而抑制肿瘤生长^[13]；ZDHHC9 介导的 GLUT1 棕榈酰化促进胶质母细胞瘤糖酵解和肿瘤发生^[19]。但 ZDHHC9 和 NSCLC 的关系鲜有报道。本研究通过GEO数据库发现ZDHHC9在NSCLC组织中表达量显著升高，并且经过GEPIA数据库分析发现其高表达与患者无病生存率负相关，提示ZDHHC9 可能参与 NSCLC 发生发展。本研究结果显示敲降 ZDHHC9，可以抑制 NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭，这些结论与之前ZDHHC9在其他肿瘤中起抑制肿瘤发生发展的结论相一致，提示 ZDHHC9 在NSCLC的发生发展中发挥作用。

代谢重编是肿瘤细胞的特征之一。近年来脂质合成分解、氧化磷酸化及氨基酸代谢异常变化引起的细胞能量失调成为肿瘤新特征^[20]。脂肪酸代谢作为脂质代谢中的重要组成部分，不仅对正常细胞的生长、发展具有重要意义，而且对肿瘤的发生、发展、转移具有重要作用。研究表明，2个棕榈酰基转移酶 ZDHHC4 和 ZDHHC5 分别在高尔基体和细胞质膜上对脂肪酸转位酶（fatty acid translocase， CD36）进行棕榈酰化修饰，从而维持CD36的质膜定位并促进其脂肪酸吸收的活性^[21]。脂肪酸合成已在多种肿瘤类型中被报道与肿瘤的增殖和转移相关，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等^[22]。脂肪酸合成是一个多步骤的过程，脂肪酸合成过程中的关键酶如FAS、ACC、ACLY等与肿瘤的发展可能有密切联系。肿瘤细胞在面对营养剥夺和缺氧条件时，会上调糖脂代谢相关基因面对应激进而保护细胞免于死亡^[20，23]。本研究结果发现，敲除ZDHHC9后脂肪酸合成关键酶表达显著下调，提示ZDHHC9可能通过参与调控脂肪酸合成，引起 NSCLC 细胞代谢重编，从而促进其增殖、迁移和侵袭，但具体机制还需进一步深入研究。

综上所述，本研究发现敲降 ZDHHC9 能抑制 NSCLC细胞系H1703和A549的增殖、迁移和侵袭， ZDHHC9可能是通过代谢重编程，改变脂肪酸合成代谢参与NSCLC的发生发展，为探究NSCLC的致病机制和靶向治疗提供了新的理论依据。

参考文献