内皮细胞（endothelial cell，EC）是位于血管壁表面一层连续的扁平细胞，充当着血流与血管壁之间的结构屏障，在血管稳态的维持上起着重要作用。由于所处位置的特殊性，EC经常受到一些危险因素的刺激，如肿瘤坏死因子（TNF⁃α）、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）等炎症因子或血流应切力，均可打破EC 增殖与死亡动态平衡，导致EC功能失调。EC过度死亡后，内皮完整性不复存在，血管壁结构和通透性显著改变，血流动力学改变，可促进oxLDL以及单核细胞黏附并浸润到血管壁，导致动脉粥样硬化（ath⁃ erosclerosis，AS）斑块及其他血管性疾病^[1-2]。

穹窿体是一种在真核生物体内高度保守的核糖核蛋白复合物，许多研究表明穹窿体参与广泛的细胞功能，包括核质运输、药物耐受、感染免疫、细胞信号传导、mRNA定位和核孔装配等^[3-4]。穹窿主体蛋白（major vault protein，MVP）是细胞内构成穹窿体的主要成分之一。MVP 因最早在肺耐药相关研究中被鉴定，因此又称为肺耐药相关蛋白（lung resistant associated protein，LRP）。后续研究发现 MVP 与肿瘤细胞的增殖凋亡密切相关，通过 PI3K⁃ AKT、Ras/Raf/MEK信号通路调控细胞活性^[5]。近年来发现，MVP 可调控血管平滑肌细胞增殖活性^[6]，巨噬细胞中的MVP对动脉粥样硬化、肥胖有抑制作用^[7]，而 EC 中的 MVP 相关研究仍未见报道。血管壁稳态在 AS 等心血管疾病进展中至关重要，探究 MVP 在人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cell，HAEC）中发挥的作用及机制，可为心血管疾病的防治提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

HAEC（Catalog No. PCS ⁃ 100 ⁃ 011，Lot No.63233442，Manassas，VA）购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。EC 培养基EGM⁃2（Lonza公司，瑞士），胎牛血清FBS、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），青/链霉素混合液（双抗） （Thermo 公司，美国），rh ⁃TNF ⁃α（R&D Systems，美国），脂质体转染试剂盒（Invitrogen 公司，美国）， TRIzol 试剂（TaKaRa 公司，日本），CCK⁃8 试剂检测盒、Z ⁃VAD ⁃ FMK（Z ⁃VAD）、Necrostatin ⁃ 1（Nec ⁃ 1） （Med Chem Express 公司，美国），PCR 逆转录试剂盒、PCR 荧光定量试剂盒（上海翊圣生物技术公司），Annexin V⁃FITC/propidium iodide（PI）检测试剂盒（南京Fcmacs公司），Caspase3、8活性检测试剂盒（BioVision公司，美国），凋亡抑制蛋白1（cellular in⁃ hibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）siRNA、IRF2 siRNA （Santa Cruz Biotechnology，美国），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京碧云天生物技术有限公司），Lipo⁃ factamine2000、Protein Marker（Thermo公司，美国）， MVP抗体（Santa Cruz Biotechnology，美国），cIAP1抗体、cIAP2 抗体、cleaved Caspase3 抗体（Cell Signal⁃ ing Technology，美国），GAPDH 抗体、α⁃Tubulin抗体 （Proteintech 公司，中国），β⁃actin 抗体（上海 Abmart 公司）。MVP敲降和过表达慢病毒（shRNA⁃MVP和 Lenti⁃MVP）以及空载体病毒由南京医科大学陈琪教授课题组赠送。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理

HAEC 使用含 10%FBS 的 EC 培养基 EGM⁃2 重悬，铺到以明胶包被的培养板内，置于37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。待细胞生长到培养板表面约 80% 时，以Z⁃VAD⁃FMK（50 μmol/L）或Nec⁃1（50 μmol/L） 预处理4 h，加入人TNF⁃α（10 ng/mL）共孵育8 h后，收集细胞进行下一步分析。

1.2.2 慢病毒感染及细胞转染

待HAEC 生长到培养板表面约80%时，直接加入慢病毒感染细胞以敲降或过表达MVP。siRNA则以 Lipofactamine2000 转染 HAEC：按照说明书配制转染液和 siRNA 稀释液，两者混匀后室温下静置 20 min，加入到已换液的细胞培养板中。培养72 h 后，进行下一步处理与分析。

1.2.3 CCK⁃8试验

在96孔板中每孔加入100 μL的HAEC 细胞悬液，密度约5 000个细胞/孔。37℃培养箱中培养24 h 后，感染慢病毒。72 h后，以TNF⁃α（10 ng/mL）处理 8 h。贴壁加入 10 μL CCK⁃8 溶液，在 37℃孵育 1 h 后，用酶标仪（ELx800）检测 450 nm 与 600 nm 的吸光度值，计算两者的差值。以已知数量细胞绘制细胞活性曲线，计算细胞增殖活力。

1.2.4 流式细胞术

Annexin V 结合实验和 Caspase3、Caspase8 活性实验均按试剂盒说明书要求操作。使用不含 EDTA 的胰酶消化 HAEC，以培养液终止消化后， 400 g离心5 min，收集细胞。PBS洗涤细胞后，加入 FITC⁃Annexin V/PI 染料，或 Caspase3、Caspase8 底物荧光染料避光染色后，以 FACSCalibur 流式细胞仪（BD Biosciences，美国）进行检测，以 FlowJo 软件进行数据分析。

1.2.5 RNA提取和荧光定量PCR

使用 TRIzol 试剂分离提取总 RNA。使用逆转录试剂盒将1 μg总核糖核酸逆转录成cDNA。逆转录温度参数如下：25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。使用荧光定量试剂盒进行实时聚合酶链反应，热循环参数如下：在 95℃下初始变性 5 min； 40 个扩增循环：95℃ 10 s，60℃ 20 s；最后在72℃延伸20 s。使用2^-△△Ct方法（其中Ct是循环阈值）将相关基因表达量与GAPDH mRNA水平做标准化计算，每个处理组做3个复孔。MVP、IRF2引物由南京擎科公司合成，其他引物均由上海生工公司合成（表1）。

1.2.6 蛋白质免疫印迹（Western blot）

在冰上以蛋白裂解液裂解HAEC细胞，提取总蛋白。经 BCA 试剂盒测量蛋白浓度后，取含等量 （20~30 μg）蛋白质的裂解液，于 95℃加热 5 min。以SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）分离样品中的蛋白质，转到0.22 μm聚偏氟乙烯（PVDF）膜。将膜置于室温下以5%脱脂奶粉溶液封闭2 h后，加入相应的一抗于 4℃孵育过夜。第 2 天，用 TBST（含 0.1%吐温20）洗涤后，在室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育2 h。使用增强型化学发光试剂（ECL）和数字凝胶图像分析系统检测结果。使用Image J软件定量蛋白质表达水平。本研究展示了至少3个独立实验的代表性图像。

1.3 统计学方法

所得数据采用 GraphPad Prism 软件作图，数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示。两组数据的差异通过t 检验进行分析，多组之间的比较采用单因素方差分析。所有实验至少独立重复3次，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MVP促进HAEC增殖，抑制HAEC死亡

为探究MVP对HAEC增殖活性的影响，使用慢病毒在 HAEC 中敲降 MVP。荧光定量 PCR 和蛋白 Western blot 均验证敲降效率（P <0.01，图1A、B）。 CCK⁃8 法检测 MVP 对 HAEC 增殖的影响，结果显示，与对照组相比，敲降 MVP 显著降低 HAEC 基底增殖活性（P <0.01，图1C）。TNF⁃α是促细胞死亡的炎性细胞因子，10 ng/mL的TNF⁃α处理8 h后，降低了HAEC增殖水平。在MVP被敲降的HAEC中，其增殖进一步降低。与该结果相一致，流式细胞术检测 PI阳性细胞，结果显示，敲降MVP显著增加基底以及 TNF⁃α诱导的细胞死亡（P <0.05，图1D、E）。

在 HAEC 中过表达 MVP，荧光定量 PCR 和 Western blot 均验证过表达效率（P <0.01，图1F、 G）。在基底或 TNF⁃α处理时，MVP 过表达均促进 HAEC 增殖（图1H）、抑制HAEC 死亡（图1I、J）。以上结果证实，MVP对HAEC具有保护作用。

2.2 MVP抑制TNF⁃α诱导的HAEC凋亡

使用两种抑制剂评估 MVP 对 HAEC 死亡的调控：①Z⁃VAD⁃FMK（简写Z⁃VAD），一种广谱的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）抑制剂，阻断凋亡通路；② Necrostatin⁃1（简写 Nec⁃1），是受体相互作用蛋白 1 （receptor⁃interacting protein 1，RIP1）的激酶抑制剂，被认为是坏死性凋亡的阻断剂。结果显示，Z⁃VAD 可以显著逆转 MVP 敲降引起的 HAEC 死亡（P <0.01，图2A、B），而使用 Nec⁃1 对敲降 MVP 引起的 HAEC死亡无明显影响（图2C、D），提示细胞凋亡参与了MVP缺失导致的HAEC死亡。

以流式细胞术检测Annexin V结合与Caspase3 活性，以Western blot检测Caspase3剪切体，均证实敲降MVP增加TNF⁃α诱导的HAEC凋亡（P <0.01，图2E~G），过表达 MVP 则完全相反（P <0.05，图2 H~J）。这些结果表明 MVP 抑制 TNF ⁃α诱导的 HAEC凋亡。

2.3 MVP促进凋亡抑制蛋白cIAP1的转录表达

本研究探究MVP 与外源性凋亡之间的调控关系。流式细胞术结果显示，TNF⁃α可诱导外源性凋亡关键分子 Caspase8 的活性增高（P <0.01），敲降 MVP 增加 TNF⁃α诱导的 Caspase8 活性（P <0.001，图3A），而过表达 MVP 抑制 TNF⁃α诱导的 Caspase8 活性（P <0.05，图3B）。结果提示外源性凋亡通路参与了MVP敲降引起的HAEC凋亡。

为了进一步探究机制，检测了Caspase8通路相关分子（包括 FADD、FLIP、RIP1、cIAP1/2、CYLD、 TRADD、TNFR1 和 TRAF2）mRNA 表达水平。结果显示，凋亡抑制蛋白 cIAP1/2 的 mRNA 水平在敲降MVP时显著降低（P <0.05，图3C）。Western blot 检测其蛋白水平变化，发现敲降 MVP 降低 cIAP1 的蛋白表达，过表达 MVP 升高 cIAP1 的蛋白表达，而 MVP 的缺失或过表达对 cIAP2 的蛋白表达水平都无明显的影响（图3D、E）。定量 PCR 结果显示，在基底以及 TNF⁃α处理条件下，过表达 MVP 均增加 cIAP1的mRNA表达水平（P <0.05，图3F）。

2.4 cIAP1敲降逆转MVP过表达导致的凋亡抑制

为了探究 MVP 是否通过 cIAP1 调控 HAEC 凋亡，使用 cIAP1 siRNA 降低 cIAP1 的表达（图4A）。流式细胞术结果显示，与对照组相比，敲降cIAP1恢复了过表达 MVP 导致的 Caspase3 活性、Caspase3 剪切体蛋白表达以及 Anneexin V 阳性率降低（P <0.01，图4B~E）。这些结果表明 MVP 通过增加cIAP1的转录表达进而抑制HAEC凋亡。

2.5 MVP通过上调IRF2介导cIAP1表达升高，实现对凋亡的抑制

为了进一步探究MVP对cIAP1的作用机制，通过JASPAR网站预测转录因子干扰素调节因子2（in⁃ terferon regulatory factor 2，IRF2）可与 BIRC2 启动子结合，因此将IRF2作为下一步探究靶标。免疫印迹结果显示，过表达MVP上调IRF2蛋白表达水平（图5 A、B）。IRF2 siRNA显著下调cIAP1的mRNA 和蛋白表达水平（图5C~E）。

流式检测IRF2对HAEC凋亡的影响。结果显示， IRF2敲降后HAEC凋亡大量升高，表现为Annexin V 结合细胞数增多和Caspase3活性的升高（P <0.05，图5F、G）。

进一步研究显示，敲降 IRF2 明显逆转过表达 MVP 导致的 cIAP1 表达升高（P <0.05，图5H、I）和 HAEC凋亡抑制（P <0.001，图5J）。

3 讨论

EC生存与死亡动态平衡被危险因素打破造成内皮损伤，被认为是动脉粥样硬化等多种血管疾病发生的始动环节^[8]。近年来研究发现，MVP在血管平滑肌细胞增殖活性的调控中发挥着重要的保护作用，而巨噬细胞中的MVP可减弱IKK⁃NF⁃κB通路介导的炎症而抑制动脉粥样硬化与肥胖^[7]。本研究对HAEC 中MVP发挥的作用及潜在机制等进行了探索，揭示 MVP在HAEC细胞增殖与凋亡功能中发挥的作用，即 MVP 抑制 TNF ⁃α诱导的 HAEC 凋亡，促进其增殖。后续研究发现，MVP可通过上调IRF2、cIAP1表达而抑制 HAEC 凋亡。这些结果为阐明 MVP 保护内皮细胞的具体机制提供部分线索，给临床诊治相关疾病带来启发。

MVP 最初在肿瘤与肿瘤耐药中被广泛研究。研究发现，MVP 能抑制 PTEN，促进 PI3K/AKT 途径介导的细胞增殖；MVP也能通过增强ERK/MAPK磷酸化水平介导肝癌细胞增殖^[9-10]。MVP与细胞凋亡的调控关系也十分密切。研究表明，MVP能通过调控蛋白激酶p38抑制凋亡信号^[11]。最新一项研究表明MVP通过与IRF2互作破坏IRF2⁃HDM2复合物，释放的 HDM2 导致 p53 降解和转录失活，从而增加肝癌细胞增殖活性和凋亡耐受性^[12]。MVP 不仅参与细胞内信号转导、核质药物运输，在先天免疫、病毒感染中也具有重要作用^[13]。在临床研究中，MVP 被作为前列腺癌的预后指标^[14]。MVP和抗MVP的自身抗体也可作为类风湿关节炎诊断和预后的生物学标志^[15]。在不同的疾病模型中MVP也有着重要的调控作用，MVP可通过氧化修饰调控人气道平滑肌细胞的存活，在哮喘发生时发挥保护气道平滑肌的作用^[16]。

cIAP1/2分别由基因BIRC2和BIRC3转录，属于 IAP家族，IAP家族主要功能是抑制外源信号和内源信号刺激所诱发的细胞凋亡^[17]。研究发现cIAP1/2 可通过以下方式抑制TNF⁃α诱导的凋亡：①cIAP1/2 发挥E3泛素连接酶特性泛素化RIP1，激活NF⁃κB，进一步促进自身和其他抗凋亡蛋白，如 FLIP、Sur⁃ vivin 的转录表达，从而抑制凋亡^[18]。②cIAP1 通过直接结合 Caspase3、7、9 阻断凋亡^[19]。BIRC2 和 BIRC3基因串联在11号染色体上，由于它们的高度相似性，有学者认为 cIAP1 和 cIAP2 的产生可能是由基因复制引起的，然而一些研究表明，在某些相同环境中它们可能发挥不同的作用：①cIAP1是NF⁃κB 信号通路中一个关键调节因子，能减轻去神经引起的肌肉萎缩，而cIAP2并不能^[20]；②cIAP1在细胞中的表达更丰富、更广泛，其表达水平可以经由泛素化而得到负调控，cIAP1可能是TNF⁃α介导的NF⁃κB 激活的主要调节因子，而 cIAP2 可能是在 cIAP1 不足时的“备份”^[21]。这些差异或许是导致 cIAP1 和 cIAP2在同种情形下表现出不同功能的原因。

IRF2 属于 IRF 家族，该家族是一类转录因子，在先天和适应性免疫应答、肿瘤增殖中具有非常重要的调控作用^[22]。研究表明IRF2⁃INPP4B可诱导自噬并抑制白血病细胞的凋亡^[23]，而敲降IRF2可通过升高Caspase3/7活性促进前列腺癌细胞凋亡^[24]，但 IRF2 与 EC 凋亡的调控还未见报道。本研究发现 IRF2敲降促进HAEC凋亡，表明IRF2在HAEC凋亡调控中可发挥保护性作用。

综上所述，本研究显示，MVP通过促进IRF2表达上调cIAP1，保护HAEC免受TNF⁃α诱导的凋亡。本研究首次揭示MVP在动脉EC中具有保护作用，为防治AS等血管疾病提供新思路和理论基础。本研究也存在一些局限性，如未研究MVP的在体表达及作用，寻找到的靶分子可能需要体内模型的进一步验证等。

参考文献