肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是常见的小儿肾脏疾病，指蛋白尿过多，伴有低白蛋白血症、水肿和高脂血症^[1]。儿童NS的病程反复，可并发感染、静脉血栓栓塞和急性肾损伤。由于病因异质性，目前儿童NS没有一种万全的治疗方法。虽然特发性NS患儿通过治疗病情可获得高度缓解，但接受肾活检的激素抵抗型肾病综合征（steroid⁃resistant ne⁃ phrotic syndrome，SRNS）患儿中有 12%~15%对免疫抑制治疗无反应，其中约50%将进展为终末期肾病 （end stage renal disease，ESRD）^[2]。因此，非常需要阐明NS进展的潜在分子机制，并为NS的治疗开辟新的道路。

生长抑制特异性基因6（growth arrest specific 6， Gas6）编码一种维生素K依赖的分泌型蛋白。Gas6 蛋白是一种与受体酪氨酸激酶Tyro3、Axl和Mer 结合的细胞因子。大量研究表明Gas6与Axl相互作用可促进癌症进展^[3]。Gas6还可促进毛囊干细胞生长^[4]，增强非小细胞肺癌的增殖^[5]。通过与 TAM（Tyro3⁃ Axl ⁃ Mer）受体相互作用激活下游信号通路（如 PLCγ、PI3K、ERK和NF⁃κB）来调节细胞存活、增殖、迁移、分化、黏附和凋亡^[6]。Gas6在IgA肾病和狼疮性肾炎患者的肾脏中的表达比在健康者中明显增多，且Gas6激活Axl受体可促进肾小球损伤^[7-9]，而肾小球损伤可以导致NS。

目前对Gas6的研究主要集中在其与下游信号通路的相互作用上，对于Gas6自身的转录调控机制研究较少。本研究通过构建阿霉素肾病细胞模型来探究Gas6与NS的相关关系，通过Gas6细胞因子直接作用于HEK⁃293T细胞来探究Gas6对HEK⁃293T细胞凋亡的影响，通过构建人Gas6启动子萤光素酶报告质粒，并将其转染至HEK⁃293T细胞，分析Gas6启动子的萤光素酶活性，同时敲低和过表达转录因子 AP⁃2a（transcription factor AP⁃2 alpha，TFAP2A），应用双萤光素酶基因报告系统、qRT⁃PCR和蛋白质免疫印迹实验分别检测Gas6启动子活性、mRNA表达量、蛋白表达量是否改变。本研究首次探索Gas6对NS的影响，为阐明NS的分子机制奠定了一定基础，同时为进一步研究人Gas6基因的转录调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人肧肾细胞（HEK ⁃ 293T）、小鼠肾足细胞 （MPC5）、pRL⁃TK（海肾萤光素酶报告质粒）、pGL3⁃ basic质粒为本实验室保存；Gas6基因启动子萤光素酶报告质粒pGas6⁃1450、结合位点突变质粒pGas6⁃ 1450 mut、TFAP2A小干扰RNA siTFAP2A及其阴性对照siNC、TFAP2A过表达质粒pENTER⁃TFAP2A及空载体pENTER、引物合成（南京擎科生物科技有限公司）；DMEM培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清、 LB 肉汤（Sigma 公司，美国）；青链霉素双抗、SDS⁃ PAGE 凝胶配制试剂盒、Western blot 一抗稀释液、 Western blot二抗稀释液、染色质免疫沉淀检测试剂盒（ChIP Assay Kit）（上海碧云天）；去内毒素小量质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒（Omega公司，美国）； 逆转录酶、SYBR Green qPCR Master Mix（TaKaRa公司，日本）；质粒转染试剂Lipofectamine3000脂质体 （Invitrogen 公司，美国）；双萤光素酶报告基因检测试剂盒（Promega 公司，美国）；琼脂糖粉（Biowest 公司，西班牙）；总蛋白提取试剂盒（南京凯基）； TFAP2A一抗（Abcam公司，美国）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗、 Gas6、NPHS2、NPHS1、GAPDH 一抗（Proteintech 公司，中国）；Bax、BCL⁃2 一抗（上海 Abmart 公司）； DNA Marker（TaKaRa 公司，日本）；蛋白 Marker （Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；全 DNA 提取试剂盒（北京天根生化）；GelRed 核酸染料（南京诺唯赞）；LB 培养板粉（Boykyo 公司，日本）；Gas6 细胞因子（MCE 公司，美国）；流式细胞仪（BD Biosciences 公司，美国）；紫外光栅分光光度计 （Eppendorf 公司，德国）；TD 20/20n single tube luminometer（武汉盖尔德纳科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生信分析

用 GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gds/和 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/）预测 NS病理表型之一的肾小球硬化的高表达及低表达基因聚类分析结果；用 JASPAR 数据库（https：//jas⁃ par.genereg.net/）和 PROMO 数据库（http：//alggen.lsi. upc.es/cgi ⁃ bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB= TF_8.3/）预测Gas6启动子的转录因子结合位点；用 GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer ⁃ pku.cn/）预测 Gas6 和 TFAP2A 在肾皮质中的相关关系。

1.2.2 细胞培养

HEK⁃293T 细胞和 MPC5 细胞在含有 10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基中培养，并置于37℃、5%CO₂培养箱，2~3 d传代1次。实验操作均采用对数期生长细胞。

1.2.3 流式细胞术

流式细胞术检测经Gas6细胞因子刺激24 h后的HEK⁃293T细胞的凋亡百分率。分别用等体积生理盐水、10 ng/mL Gas6细胞因子、100 ng/mL Gas6细胞因子刺激 HEK⁃293T 细胞 24 h，用 PBS 洗涤细胞 2 次，收集细胞，用100 μL 1×Binding Buffer重悬，加入 Annexin V⁃FITC 和 PI staining solution 各 2.5 μL，混匀，室温避光孵育10 min，加入300 μL 1×Binding Buffer，混匀，使用流式细胞仪检测。

1.2.4 染色质免疫沉淀（ChIP）

使用ChIP Assay Kit试剂盒，根据其说明书进行实验及分析。将 HEK⁃293T 细胞在 1%甲醛中固定 10 min，沉淀细胞并充分裂解，超声剪切基因组DNA 使其断裂成 200~1 000 bp 大小（去除交联，纯化 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳观察超声处理效果）。样品特异性免疫沉淀后去除交联并纯化，选择引物进行PCR或qRT⁃PCR并进行琼脂糖凝胶电泳（目的 PCR 产物碱基编号：-418~-283，上游引物：5′ ⁃ AAACCGTCGCATTTCACTCG ⁃ 3′，下游引物：5′ ⁃ CCCCGAATCTACTGCATCCT⁃3′；Control Primers：上游引物：5′⁃TACTAGCGGTTTTACGGGCG⁃3′，下游引物：5′⁃TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA⁃3′）。

1.2.5 人Gas6启动子及转录因子结合位点突变的启动子的萤光素酶报告基因重组质粒的构建与鉴定

人 Gas6 基因（GenBank 编号：NC_000013.11）序列从美国国立生物技术中心数据库 NCBI（https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）找到起始密码子上游 1 400 bp片段、下游50 bp片段序列。将人Gas6启动子的转录起始位点（TSS）设置为+1。将人Gas6启动子片段-1 400~+50 nt 的序列插入 pGL3⁃Basic 载体中，命名为 pGas6⁃1450 并测序，使用 NCBI 的 blast （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）功能鉴定该质粒的正确性。以pGas6⁃1450为模板构建TFAP2A 结合位点突变的启动子质粒，分别命名为 pGas6⁃ 1450 mut1、pGas6 ⁃ 1450 mut2、pGas6 ⁃ 1450 mut1+2 （下文合称为pGas6⁃1450 mut）并测序核对。具体突变点见图1。

1.2.6 双萤光素酶报告基因实验

将HEK⁃293T细胞接种到96孔板中（1×10⁴ 个/孔）。 24 h 后，将 100 ng pGas6⁃1450 或 pGas6⁃1450 mut 或pGL3⁃basic 质粒与4 ng pRL⁃TK 质粒共同转染到细胞中，24 h后检测pGas6⁃1450或pGas6⁃1450 mut 的启动子活性；将 100 ng pGas6⁃1450 或 pGas6⁃1450 mut 和 siTFAP2A（50 nmol/L）或 siNC（50 nmol/L）与 4 ng pRL⁃TK质粒共同转染到细胞中，24 h后检测敲低TFAP2A对pGas6⁃1450或pGas6⁃1450 mut启动子活性的影响；同时，将 100 ng pGas6⁃1450 或 pGas6⁃ 1450 mut 和 100 ng pENTER⁃TFAP2A 或 pENTER 与 4 ng pRL⁃TK质粒共同转染到细胞中，24 h后检测过表达TFAP2A对pGas6⁃1450或pGas6⁃1450 mut启动子活性的影响。检测方法采用双萤光素酶报告基因系统，使用 TD 20/20 荧光光度计，按照双萤光素酶检测试剂盒步骤分别检测 pGL3⁃ basic、pGas6⁃ 1450、pGas6⁃1450 mut 以及敲低和过表达 TFAP2A 后pGas6⁃1450和pGas6⁃1450 mut的启动子活性，并将其标准化为pRL⁃TK的活性。结果至少重复3次。具体小干扰RNA序列见表1。

1.2.7 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）

将MPC5细胞或HEK⁃293T细胞接种到12孔板中（1 × 10⁵ 个/孔）。24 h 后用阿霉素（adriamycin，ADR）（0.2 μg/mL）或等体积生理盐水（normal sa⁃ line，NS）刺激MPC5细胞，检测肾病相关指标mRNA 表达量的变化以确定阿霉素细胞模型构建成功与否，同时检测Gas6 mRNA表达量的变化；用Gas6细胞因子（100 ng/mL）或等体积NS刺激MPC5细胞后检测肾病相关指标表达量的变化；用Gas6细胞因子 （100 ng/mL）刺激HEK⁃293T细胞检测凋亡相关指标表达量的变化；将小干扰RNA或过表达质粒或相应的对照试剂转染到HEK⁃293T细胞中检测敲低或过表达TFAP2A对Gas6 mRNA表达量的影响。24 h后使用 Omega RNA 提取试剂盒从细胞系中提取总 RNA，并将其逆转录为第1链cDNA，进行qRT⁃PCR 实验。反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃30 s、72℃ 30 s（三步骤循环40次），95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。所有样品均以GAPDH作为内参进行3次以上qRT⁃PCR实验，并以2^-ΔΔCt计算mRNA的相对表达水平。相关指标的引物序列见表2。

1.2.8 蛋白免疫印迹（Western blot）

在 6 孔板（2×10⁵ 个/孔）中进行与上述提取总 RNA前相同的实验，48 h后使用总蛋白提取试剂盒从细胞系中提取总蛋白，加入5×上样缓冲液混匀并 100℃煮沸8~10 min。制备10% SDS⁃PAGE凝胶，进行电泳，电泳条件：90 V 30 min，120 V 40 min。电泳完成后用快速转膜液常温恒流400 mA，30 min将蛋白转至PVDF膜，室温封闭2 h后4℃孵育一抗过夜 （12~16 h），TBST洗膜3次（30 min/次），室温孵育二抗 2 h，再洗膜 3 次后曝光显影。以 GAPDH 作为内参，实验独立重复3次以上。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism6及SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验结果以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生信分析

用GEO数据库分析NS病理表型之一的肾小球硬化的高表达（红色）及低表达（绿色）基因，Gas6属于高表达基因（图2）；用 JASPAR 数据库和 PROMO 数据库预测 TFAP2A 在 Gas6 启动子上的结合位点并取交集，得到多个结合位点（以此设计突变位点）； 用GEPIA数据库分析Gas6和TFAP2A在肾皮质中的相关关系，发现两者呈正相关（P＜0.01，图3）。

2.2 Gas6与肾病综合征

为了进一步探究Gas6与NS的关系，用0.2 μg/mL 的ADR作用于MPC5细胞以构建研究NS的典型细胞模型，即阿霉素肾病细胞模型，NPHS1（Nephrin） 与 NPHS2（Podocin）表达下调为模型构建成功的标志。通过qRT⁃PCR和Western blot检测到在该模型中Gas6表达升高（P＜0.01和P＜0.05，图4）；并且用 Gas6 细胞因子直接作用于 MPC5 细胞，通过 qRT⁃ PCR 和 Western blot 检测到 NS 相关指标 Nephrin 与 Podocin表达下调（P＜0.05或P＜0.01，图5）。

2.3 Gas6与凋亡

为了探究 Gas6 与凋亡的关系，用 Gas6 细胞因子作用于HEK⁃293T细胞，通过qRT⁃PCR和Western blot观察到Gas6可使凋亡相关指标BCL⁃2表达增多 （P＜0.01 和 P＜0.05，图6）、Bax 表达减少（P＜0.05 和 P＜0.001，图6）；通过流式细胞术可检测到实验组凋亡细胞较对照组明显减少（P＜0.001，图6）。

2.4 TFAP2A是否与Gas6启动子结合

为了探究TFAP2A是否与Gas6启动子结合，用 HEK⁃293T细胞进行了ChIP实验，结果表明TFAP2A 抗体所沉淀蛋白可结合在Gas6的启动子区的扩增序列上，而对照抗体IgG不能沉淀结合该序列的蛋白，即 TFAP2A 在 Gas6 启动子区有结合位点（P＜ 0.05，图7）。

2.5 检测人 Gas6 启动子、突变启动子活性以及 TFAP2A对其活性的影响

将合成的pGas6⁃1450和pGas6⁃1450 mut重组质粒进行序列测定，结果提示与目标序列完全一致，说明人Gas6启动子及转录因子结合位点突变启动子的萤光素酶报告基因重组质粒构建成功。在 HEK⁃293T 细胞中进行双萤光素酶报告基因实验，检测到与pGL3⁃Basic组相比，pGas6⁃1450组的HEK⁃ 293T 细胞的相对萤光素酶活性明显增加（P＜ 0.001）；与pGas6⁃1450组相比，pGas6⁃1450 mut组的 HEK⁃293T细胞的相对萤光素酶活性有不同程度的降低（P＜0.05和P＜0.001）；在转染了pGas6⁃1450质粒的HEK⁃293T细胞中，与siNC组相比，siTFAP2A组的 HEK⁃293T 细胞的相对萤光素酶活性明显降低 （P＜0.01），与pENTER组相比，pENTER⁃TFAP2A组的 HEK⁃293T 细胞的相对萤光素酶活性明显增加 （P＜0.001）；在转染了pGas6⁃1450 mut质粒的HEK⁃ 293T 细胞中，与对照组相比，siTFAP2A 组的 HEK⁃ 293T细胞的相对萤光素酶活性略微降低（P＜0.05）或无明显变化，pENTER⁃TFAP2A组的HEK⁃293T细胞的相对萤光素酶活性略微升高（P＜0.01）或无明显变化（图8）。

2.6 TFAP2A对人Gas6 mRNA水平的调控

为在 mRNA 水平上探究 TFAP2A 对人 Gas6 的调控作用，在 HEK ⁃ 293T 细胞中敲低或过表达 TFAP2A，通过qRT⁃PCR检测TFAP2A的敲低或过表达效率，同时检测在敲低或过表达TFAP2A后Gas6 mRNA的表达有无变化。与siNC组相比，siTFAP2A 组 TFAP2A 与 Gas6 的 mRNA 表达水平明显降低 （P＜0.001，P＜0.01）；与 pENTER 组相比，pENTER⁃ TFAP2A组TFAP2A与Gas6的mRNA表达水平明显升高（P＜0.01，P＜0.05，图9）。

2.7 TFAP2A对人Gas6蛋白水平的调控

为更进一步研究 TFAP2A 对 Gas6 基因的表达调控，在 HEK⁃293T 细胞中敲低或过表达 TFAP2A，通过Western blot检测TFAP2A敲低或过表达效率，同时检测在敲低或过表达 TFAP2A 后 Gas6 蛋白的表达是否改变。与 siNC 组相比，siTFAP2A 组 TFAP2A 与 Gas6 的蛋白表达水平明显降低（P＜ 0.01 和 P＜0.05）；与 pENTER 组相比，pENTER ⁃ TFAP2A组TFAP2A与Gas6的蛋白表达水平明显升高（P＜0.01和P＜0.05，图10）。

3 讨论

真核生物基因的表达调控是十分复杂的，涉及许多具有调控功能的核酸序列和蛋白质调控因子。转录因子、辅因子、染色质调节因子、RNA 聚合酶Ⅱ（Pol Ⅱ）和其他反式作用因子直接或间接地与转录调控元件（包括启动子、增强子和超级增强子） 结合，从而调节靶标基因的表达^[10]。研究转录因子对启动子的调控作用对进一步认识转录调控机制和疾病小分子机制的研究以及疾病的预防、治疗等都具有重要意义。然而，目前对Gas6基因的研究主要集中在其下游蛋白水平，对Gas6基因的启动子调控方面的研究却很少。本研究通过建立肾病细胞模型、用 Gas6 细胞因子作用于 MPC5 细胞，证明 Gas6可促进NS的发展，并通过用Gas6细胞因子干预HEK⁃293T细胞证明Gas6在HEK⁃293T细胞中具有抗凋亡作用。本研究还通过ChIP实验证明转录因子AP2A可与Gas6启动子结合，同时构建人Gas6 启动子萤光素酶基因报告质粒 pGas6⁃1450 并证明其是有启动转录活性的启动子，并对其预测得到的关键转录结合位点进行定点突变，明确TFAP2A在 Gas6启动子上的关键性结合位点，同时通过敲低或过表达TFAP2A证明TFAP2A在启动子、mRNA和蛋白水平对Gas6基因均有正向转录调控。

生长抑制特异性基因（growth arrest ⁃ specific transcripts，GAS）在进化过程中结构和功能高度保守，其家族成员众多，它们的基因编码产物在微丝组装、细胞生长分化或凋亡、细胞周期调控等方面都具有重要功能。Gas6基因是GAS 基因家族中的重要一员，它编码一种含有γ⁃羧基谷氨酸（Gla）的蛋白质，被认为与刺激细胞增殖有关。该基因在多种癌症中过度表达，并被认为是一种不良预后的标志物。其蛋白水平升高还与多种疾病状态相关，包括静脉血栓栓塞性疾病、系统性红斑狼疮、慢性肾功能衰竭和先兆子痫。在肺、子宫内膜、肾脏和其他 24种组织中普遍表达。研究表明Axl抑制剂可显著改善尿白蛋白的排泄和血清肌酐的升高，还抑制肾小管间质纤维化和肾小管损伤，抑制由 TGFβ1 和 Gas6协同作用引起的上皮间质转化（EMT），在小鼠中也有这种抑制作用，这表明Axl 抑制剂可以通过抑制肾小管细胞中的EMT 来改善肾小球肾炎的肾功能障碍，同时也表明，Gas6/Axl促进肾小球肾炎的疾病进展^[9]。且有研究表明在急性肾损伤中下调 Gas6/Axl信号转导可以减轻肾纤维化并且可以延缓急性肾损伤进展为慢性肾脏病^[11]。有研究者证明 Axl 抑制剂治疗狼疮性肾炎可改善肾功能，显著降低血尿素氮和肾小球增殖，并显著降低磷酸激酶B （Akt）磷酸化和肾炎性细胞因子及趋化因子的表达^[12]。这些研究都表明Gas6/Axl对肾脏病甚至其他疾病有重要意义，而本研究Gas6自身的表达调控可直接影响到Gas6/Axl信号转导，这为后续研究提供了方向。

转录因子是一类能识别基因转录起始位点上游特定DNA序列并与之结合从而调控基因转录的蛋白分子^[13]。激活蛋白⁃2（AP⁃2）转录因子家族由 AP⁃2α、AP⁃2β、AP⁃2γ、AP⁃2δ 和 AP⁃2ε 组成，特定的 AP⁃2家族成员的表达模式和对不同启动子的亲和力不同，它们被认为在胚胎发育过程中刺激细胞增殖并抑制特定细胞类型的终末分化。TFAP2A是一种结合共有序列5′⁃GCCNNNGGC⁃3′的转录因子，可作为同源二聚体或作为具有相似家族成员的异源二聚体发挥作用，既可以作为转录激活因子，也可以作为阻遏因子。目前发现该基因有3个编码不同亚型的转录变体，在皮肤、胎盘、肾和其他4个组织中的表达较多。TFAP2A 的缺陷是鳃面综合征 （BOFS）的一个原因。目前针对 TFAP2A 的研究大多是关于各种癌症，有研究表明，肺腺癌中TFAP2A 普遍高表达^[14-15]，卵巢癌组织中 TFAP2A 表达也上调^[16]，头颈部鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织相比，TFAP2A 的表达也明显升高^[17]。也有研究证明 TFAP2A 可下调 miR ⁃126，从而上调 PLK2 并激活 IκBα⁃NF⁃κB 通路，从而增加脑缺血后的神经元损伤^[18]。近年有人提出TFAP2A是肾脏发育过程中肾单位分化的新看门人^[19]，但目前对于TFAP2A与肾脏疾病之间的研究依旧很少。

本研究首次证明 Gas6 可促进 NS 的发生，其次证明Gas6在HEK⁃293T细胞中有抗凋亡作用，同时成功构建了Gas6启动子萤光素酶基因报告重组质粒，测定其具有启动活性，并验证了TFAP2A在Gas6 启动子区的关键功能性结合位点，最后证明了 TFAP2A可通过与Gas6启动子结合从而在启动子、 mRNA、蛋白质水平正向调控Gas6的表达。

参考文献