GC（gastric cancer，GC）是全球第5大癌症，死亡率居全球第4位^[1-2]。目前，GC的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但术后局部复发或远处转移的发生率超过40%^[3]。此外，放疗和化疗后会出现明显的不良反应，导致晚期GC患者的5年生存率仅约 20%^[4-5]。因此，寻找GC新的治疗和预后靶点以提高患者的生存率，已成为一项迫切的公共卫生问题。

为筛选出与 GC 预后相关的基因，本研究采用多种分析方法发现，在GC中丁酰胆碱酯酶（bcylcho⁃ linesterase，BCHE）具有良好的预后价值。BCHE是一种由肝脏合成并分泌到血液中的血浆酶，主要表达于外泌体和内质网^[6]，其半衰期约为 12 d，参考值为5 900~13 200 U/L^[7-8]。研究表明，口腔癌和乳腺癌患者血清中BCHE 的表达水平明显升高^[9-10]。然而，BCHE 基因在GC中的表达水平、调控机制，以及与临床治疗和预后的相关性仍不清楚。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究的GC患者临床病理信息和基因转录组数据都来源于UCSC Xena数据库的肿瘤基因组图谱 （TCGA）^[11]。

人GC细胞系HGC27、MKN1和人正常胃上皮细胞系GES⁃1（武汉普诺赛生命科技有限公司）。qRT⁃ PCR试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）（上海吉玛制药技术有限公司）；Lipo6000、CCK⁃8试剂（上海碧云天生物公司）；基质凝胶（厦门模基生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 生信数据处理

首先使用 Lasso 回归筛选预后基因^[12]，并采用 Kaplan⁃Meier生存曲线和单因素、多因素Cox回归分析BCHE基因表达在GC中的预后价值；其次采用卡方检验验证BCHE mRNA与临床病理参数之间的关系，使用TIMER2.0数据库（https：//cistrome.shinyapps. io/timer/）^[13]和 CIBERSORT 算法研究 BCHE 和免疫细胞浸润之间相关性，此外，利用 WGCNA 算法和DAVID Bioinformatics Resources数据库（https：// david.ncifcrf.gov/）^[14] 对BCHE基因进行Gene Ontology （GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）分析。

1.2.2 qRT⁃PCR

使用细胞 RNA 提取试剂盒提取人 GC 细胞 HGC27、MKN1和人正常胃上皮细胞GES⁃1的RNA，再用逆转录试剂将RNA逆转录成cDNA，以GAPDH 作为内参对BCHE进行qRT⁃PCR扩增。BCHE R：5′⁃ TGTTGCAGAGAATCGGAAATCAA⁃3′，F：5′⁃CCCA⁃ ATAAGCATGCAGAGCA⁃3′。GAPDH R：5′⁃GAAG⁃ GTGAAGGTCGGAGTC ⁃3′，F：5′ ⁃GGCTGTTGTCAT ⁃ ACTTCTCATGG⁃3′。采用2^-ΔΔCt计算相对表达量。

1.2.3 细胞转染

利用siRNA靶向敲减BCHE基因。将细胞分为对照组、空载组（si⁃NC）和实验组（si⁃BCHE），收集处理后的HGC27和MKN1细胞，并配制成2×10⁵ 个/mL 的细胞悬液，铺入 6 孔板中，每孔 2 mL。培养 24 h 后，每孔滴加7.5 μL Lipo6000和7.5 μL siRNA，在培养箱中培养48 h后进行下一步实验。

1.2.4 CCK⁃8和克隆形成实验

CCK⁃8 实验：收集处理后的 HGC27 和 MKN1 细胞，并配制成2×10⁴ 个/mL的细胞悬液，铺入96孔板中，每孔 100 μL，分别在 24、48、72、96 h 后加入 10 μL CCK⁃8试剂，在37℃下孵育2 h后检测450 nm 的吸光度值。克隆形成实验：收集处理后的HGC27 和 MKN1 细胞，并配制成 1×10³ 个/mL 的细胞悬液，铺入6孔板中，每孔1 mL，观察到克隆体的外观后使用甲醛固定细胞，再用1%结晶紫对细胞进行染色，最后PBS洗涤3次并拍照。

1.2.5 细胞黏附实验

96 孔板每孔加入100 μL的1∶4基质凝胶，凝胶凝固后，收集处理过的 HGC27 和 MKN1 细胞，并配制成1×10⁵ 个/mL的细胞悬液，铺入96孔板中，每孔 100 μL，随后置于细胞培养箱中孵育2、4和8 h，PBS 洗涤3次后，更换新的培养基后进行CCK⁃8检测。

1.2.6 迁移和侵袭实验

迁移实验：收集处理后的 HGC27 和 MKN1 细胞，并配制成 2×10⁵ 个/mL 的细胞悬液，铺入 6 孔板中，每孔2 mL，24 h后使用灭菌的200 μL枪头垂直于 6 孔板底部横线划线，更换无血清培养基，分别在0、12、24 h后使用荧光倒置显微镜拍照。侵袭实验：收集处理后的 HGC27 和 MKN1 细胞，并配制成 1×10⁶ 个/mL 的无血清细胞悬液，将细胞加入铺有 1∶8基质凝胶的Transwell上层小室中，每孔100 μL。小室的底部加入500 μL 20％的血清培养基。培养 48 h 后，使用甲醛固定细胞，再用 0.1%结晶紫对细胞进行染色，最后PBS洗涤3次并拍照。

1.3 统计学方法

所有统计分析都使用 R 软件（4.1.2 版本）和 GraphPad Prism 8进行，符合正态分布的数据资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD⁃t检验。根据中位数将BCHE mRNA在GC 组织中的表达水平分为高表达组和低表达组^[15-18]。生存分析采用 Kaplan ⁃Meier 法并进行 log ⁃ rank 检验。使用 R 包“forestplot”进行单因素和多因素 Cox回归分析，并将单因素分析中差异具有统计学意义 （P <0.05）的变量纳入多因素分析。BCHE 表达高低与临床病理参数的关系采用卡方检验。P <0.05 为差异有统计学意义，每组实验重复3次。

2 结果

2.1 BCHE与GC患者预后及临床病理参数的关联性分析

首先通过 Lasso 回归分析筛选出 15 个与 GC 患者总生存期（overall survival，OS）有关的基因： BCHE、GPX3、ADAMTS18、ASPA、CD36、SERPINE1、 CYP19A1、LRAT、CGB5、ANO3、SOX14、CYMP、 CFHR4、F13B和OTX2（图1A）；其次，根据生存曲线分析筛选出影响预后差异最显著的基因BCHE（P <0.001，图1B），且发现 BCHE mRNA 高表达的 GC 患者无进展生存期（P=0.001）、疾病特异性生存期 （P=0.002）和无病生存期（P=0.004）更短（图1C~E）。进一步分析发现，BCHE mRNA 在肿瘤组织中的表达水平高于癌旁组织（P <0.001），同时 BCHE mRNA在晚期GC（Ⅲ/Ⅳ期）患者中的表达水平高于早期 GC（Ⅰ/Ⅱ期）患者（P=0.020，图1F）。根据 BCHE mRNA 在 GC 组织中表达水平的中位数将患者分为高表达组和低表达组，分析BCHE mRNA 的表达与GC患者临床病理学参数之间的关系。结果表明，BCHE mRNA 的高表达与 T 分期（P=0.029）、TNM分期（P=0.035）、肿瘤类型（P <0.001）、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）（P <0.001）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）（P <0.001）等临床病理参数相关（表1）。此外，单因素分析结果显示 BCHE mRNA 的表达水平（P <0.001）、年龄（P=0.010）、T分期（P=0.002）、M分期（P=0.002）、 N分期（P=0.002）、TNM分期（P <0.001）和肿瘤类型 （P=0.030）与GC患者预后有关。将单因素分析中有统计学意义的临床因素和BCHE表达水平因素一并纳入多因素分析，结果表明BCHE mRNA 的表达水平（P=0.006）、年龄（P=0.025）和M分期（P=0.019）均是GC患者的独立预后因素（表2）。

2.2 BCHE表达和免疫细胞浸润的相关性分析

首先，使用CIBERSORT算法研究BCHE mRNA 与免疫细胞浸润之间的关系。结果表明，BCHE mRNA高表达与多种免疫细胞浸润相关，包括浆细胞、B 细胞、调节性 T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞等 （P <0.05，图2A）；进一步通过 TIMER2.0 数据库研究 BCHE mRNA 表达与免疫细胞浸润之间的具体相关性。结果表明，在 GC 中 BCHE mRNA 的表达与 B 细胞（r=0.192，P <0.001）、单核细胞（r=0.226， P <0.001）、巨噬细胞（r=0.169，P <0.001）、NK细胞 （r=0.137，P=0.008）、肥大细胞（r=0.432，P <0.001） 和癌症相关成纤维细胞（cancer fibroblast，CAF） （r=0.733，P <0.001）显著正相关；与 CD4 ⁺ T 细胞 （r=-0.256，P <0.001）和 CD8 ⁺ T 细胞（r=-0.104， P=0.043）显著负相关（图2B）。

2.3 BCHE基因的富集分析

为了解目的基因BCHE可能存在的生物学功能和信号通路，我们利用 WGCNA 算法和 ESTIMATE 算法筛选与BCHE基因相关的共表达基因，选择了与免疫细胞和基质细胞相关性最高的棕色模块（包含了 188 个与 BCHE 共表达的基因）（图3A），使用 DAVID数据库对这188个基因进行富集分析，GO分析结果表明BCHE的表达可能与细胞增殖、细胞黏附和细胞迁移等功能有关（图3B）。KEGG 分析表明，BCHE的功能可能与PI3K⁃Akt信号通路、TGF⁃β 信号通路和癌症通路等有关（图3C）。

2.4 BCHE敲减对GC细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的影响

为验证 BCHE 在 GC 细胞中的作用，本研究验证了该基因的体外功能。qRT⁃PCR 检测发现， GC 细胞株（HGC27 和 MKN1）中 BCHE mRNA 的表达显著高于胃组织正常细胞株（GSE⁃1）（P <0.001，图4A）。通过 siRNA 敲减 BCHE 表达，敲减效率如图4B、C 所示，选择敲减效率最高的 1 号片段 （si ⁃BCHE ⁃1）进行下游的功能实验。结果发现， BCHE 敲减后明显抑制了 GC 细胞的增殖能力 （P <0.05）和克隆形成能力（P <0.001，图4D~G）。黏附实验结果表明，BCHE敲减后能够促进GC细胞的黏附能力（P <0.05，图5A、B）。迁移和侵袭实验结果表明，BCHE 敲减后明显抑制 GC 细胞的迁移 （P <0.001）和侵袭能力（P <0.001，图5C~F）。这些结果表明，BCHE 是GC细胞中的一个促癌基因，敲减BCHE可抑制其介导的恶性生物学功能。

3 讨论

BCHE 是一个潜在的肿瘤标志物，其 mRNA 水平在卵巢癌、乳腺癌和肺癌中显著升高^[9，19-20]，且 BCHE mRNA的高表达与子宫内膜癌和卵巢癌患者较差的总生存率相关^[19，21]。本研究通过生信数据分析以及实验验证发现，BCHE 在GC细胞中高表达，且BCHE mRNA 的高表达与GC 预后不良呈显著正相关。以上结果提示，BCHE可能是GC新的预后生物标志物。

鉴于GC微环境对肿瘤发生发展和转移具有重要作用，本研究使用CIBERSORT算法和TIMER 2.0 数据库分析发现，BCHE mRNA高表达与B细胞、癌症相关成纤维细胞及巨噬细胞的浸润呈正相关，与 CD4⁺ T 和 CD8⁺ T 细胞浸润呈负相关。研究报道显示，肿瘤微环境中存在较多的免疫细胞亚型，部分免疫细胞亚型与肿瘤患者较差的预后相关，如 M2 型巨噬细胞、调节性 B 细胞、癌症相关成纤维细胞等^[22-24]；亦有研究表明，B细胞浸润可能和肿瘤转移相关^[25]。另外，部分 T 细胞上高表达免疫抑制性分子（如 PD⁃1、CTLA⁃4）等，当与携带相应配体的肿瘤细胞结合时，可抑制效应性T细胞的杀伤功能，从而使肿瘤细胞逃脱体内免疫系统的检查点监视，这也成为针对免疫检查点治疗的核心所在^[26]。据此，有理由推测GC组织中BCHE 的高表达可能通过重塑肿瘤免疫微环境，促进肿瘤的发生发展，进而可影响免疫治疗的效果。

研究表明，BCHE 与细胞凋亡、细胞黏附、细胞增殖和肿瘤发生有关^[27-28]。在神经母细胞瘤中， BCHE mRNA的敲低显著抑制了癌细胞的增殖和侵袭^[28]。在对子宫内膜癌的研究中发现BCHE可能和 TGF⁃β信号通路有关^[21]。然而，BCHE在GC中的生物学功能的研究尚未见报道。本研究通过敲低 BCHE mRNA表达显著减缓了GC细胞增殖和克隆，并促进GC细胞的黏附、抑制GC细胞的迁移和浸润能力。因此，BCHE是一个促癌基因，降低BCHE的表达可抑制其介导的恶性生物学功能。但本研究仍有不足，如未对BCHE的分子机制进行实验验证，因此，本研究团队将会在今后的工作中完善对该部分内容的探索。

参考文献