先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）是新生儿最常见的先天性异常疾病，并导致超过40% 的产前死亡^[1]。我国每年新发 CHD 的总经济负担超过126亿元，给患者家庭和社会带来巨大的医疗负担和精神负担^[2]。目前研究表明 CHD 是胚胎期遗传与环境因素共同作用所导致。研究发现，孕期暴露于不良环境中，如环境污染、酒精、烟草和药物暴露（如抗高血压药、抗惊厥药、抗抑郁药等）都会极大增加胎儿CHD发生^[1，3-5]。

氯氮平（clozapine，CLP）是一种非典型抗精神病药，可抑制多巴胺D2受体并拮抗5⁃羟色胺2C受体 （5⁃hydroxytryptamine receptor 2C，HTR2C）^[6-7]，其对难治性精神分裂症和双相情感障碍具有良好的治疗效果，但也存在着严重的不良反应，会引起心动过速、高血压或低血压、晕厥、心肌炎、心包炎和中性粒细胞减少等症状^[8]。调查发现，育龄和孕期妇女越来越多地使用抗精神病药物^[9]。临床数据显示，氯氮平可穿过胎盘屏障^[10]，影响胎儿发育^[11]。动物实验发现，胚胎期斑马鱼暴露于氯氮平，导致其心包水肿、心室和心房狭窄、心肌细胞减少、心动过缓等异常表型^[12]。以上的研究表明，胚胎期氯氮平暴露会影响心脏发育，但是其影响心脏发育的作用机制尚不明确。

内质网是进行蛋白质合成、折叠、易位等过程的细胞器，生理或病理下内质网功能扰乱时，导致错误折叠和展开的蛋白质的积累，这种情况被称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）^[13]。 ERS与多种心脏功能损伤相关，包括能量代谢、心脏生成、缺血/再灌注、心肌病和心力衰竭等^[14]。氯氮平对心脏发育的毒性是否与内质网应激相关，目前还未有研究报道。本研究以斑马鱼胚胎为模型，探讨胚胎期氯氮平暴露对心脏发育的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

氯氮平（上海源叶生物公司）；溴隐亭（bro⁃ mocriptine，BRC，上海麦克林公司）；4⁃苯基丁酸（4⁃ phenylbutyric acid，4⁃PBA，上海阿拉丁公司）；HiS⁃ cript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wip⁃ er）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Without ROX） （南京诺唯赞公司）；TRIzol（Life technologies 公司，美国）；荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）；荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士）。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼喂养

野生型AB品系斑马鱼及心脏特异表达绿色荧光转基因Tg（Cmlc2：EGFP）均由中国科学院水生生物研究所提供，斑马鱼于28.5℃循环水系统中喂养，光照周期为照射14 h，黑暗10 h。收集胚胎时将文中斑马鱼按照雌雄比3∶2放入交配缸中，于次日早上抽去隔板利用光照刺激交配反射，抽去隔板1~2 h后收集受精卵，并用胚胎培养液（5 mmol/L NaCl、 0.17 mmol/L KCl、0.14 mmol/L CaCl₂、0.16 mmol/L MgSO₄）于28.5℃恒温光照培养箱中继续孵育。

1.2.2 药物处理及分组

将受精正常的受精后 0 h（0 hours past fertiliza⁃ tion，0 hpf）斑马鱼胚胎随机地吸到 6 孔培养板中，每孔 30 个，用不同浓度的处理液进行处理，其中 12.5 μmol/L 氯氮平作为低剂量处理组（L⁃CLP）， 25.0 μmol/L 氯氮平作为高剂量处理组（H ⁃CLP）， DMSO作为溶剂对照。加入4⁃苯基丁酸或溴隐亭处理时，首先利用25 μmol/L氯氮平处理斑马鱼胚胎24 h，然后加入 10 mmol/L 4⁃ 苯基丁酸（CLP+4⁃PBA） 或溴隐亭（CLP+BRC）共同处理至72 hpf，检测相应的心脏发育相关指标，每个实验均重复3次。

1.2.3 斑马鱼心脏结构与功能检测

斑马鱼胚胎于72 hpf时，置于倒置显微镜下观察其心包水肿情况，记录并统计斑马鱼心率，拍摄斑马鱼侧体位图像，并测量静脉窦⁃动脉球（sinus venosus⁃ bulbus arteriosus，SV⁃BA）间距，用于表征其心脏线性化程度^[15]，于72 hpf在倒置荧光显微镜下观察转基因斑马鱼Tg（Cmlc2：EGFP）的心脏结构。

1.2.4 RNA 提取和实时荧光定量聚合酶链反应 （RT⁃qPCR）

各组于72 hpf收集15只斑马鱼胚胎，使用TRIzol 法抽提总 RNA，按照诺唯赞 HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行操作，取1 μg RNA合成cDNA，使用SYBR⁃Green对每个选定基因进行RT⁃qPCR反应，引物序列见表1。以GAPDH作为内参，实验数据以2^-△△Ct方法进行分析。

1.3 统计学方法

斑马鱼SV⁃BA距离用软件Image J 软件进行统计。全部数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，结果用平均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异，采用SNK法进行组间比较，P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯氮平导致斑马鱼胚胎心脏发育缺陷

为探究氯氮平对胚胎心脏发育的影响，使用含有氯氮平的培养液处理斑马鱼胚胎。根据既往研究，选择低剂量（12.5 μmol/L）及高剂量（25.0 μmol/L）的氯氮平处理胚胎。低浓度氯氮平处理的斑马鱼胚胎脊柱出现轻微弯曲（5.6%），高剂量氯氮平导致脊柱严重弯曲（12.4%），且出现腹腔水肿（图1A）。与对照组相比随氯氮平剂量增加，斑马鱼心脏SV⁃BA 间距逐渐变长，心率逐渐降低（图1B、C）。

斑马鱼为一心房一心室结构，心脏发育经环化而呈现为S型^[15]。侧位观察时，心房心室有明显重叠区域，而低剂量氯氮平处理组心房及心室重叠面积减小，高剂量组心房心室几乎不重叠（图1D）。检测心脏发育相关基因发现，与对照组相比，低剂量 CLP处理显著降低心脏发育相关基因NKX2.5的表达，而高剂量CLP处理后Cmlc2、Hand2和NKX2.5都出现显著降低（图1E）。

以上提示，氯氮平导致斑马鱼心脏形态发育异常、心功能受损、心脏发育相关基因表达异常，并呈现剂量依赖性。

2.2 氯氮平通过内质网应激导致心脏发育异常

为探究氯氮平是否通过内质网应激而影响心脏发育，使用内质网应激抑制剂4⁃苯基丁酸与高剂量氯氮平共同处理斑马鱼胚胎。相比于对照组，高剂量氯氮平处理显著升高斑马鱼内质网应激标志基因Chop与Bip表达，而4⁃苯基丁酸共处理显著逆转了Chop和Bip的高表达（图2A）。同时，相较高剂量氯氮平导致的心脏损伤，4⁃苯基丁酸使得氯氮平导致的心包水肿减轻；SV⁃BA间距显著缩短；心率明显恢复（图2B~D）。高剂量氯氮平处理后，凋亡相关基因Caspase3和Bax/Bcl2表达水平显著上升，而 4⁃苯基丁酸处理后，Caspase3 和 Bax/Bcl2 表达水平恢复正常（图2E）。综上，氯氮平可通过激发内质网应激，促进细胞凋亡，导致心脏发育异常。

2.3 氯氮平通过多巴胺D2受体诱导心脏发育损伤

为进一步验证多巴胺D2受体在氯氮平诱导的心脏发育损伤中的作用，在高剂量氯氮平培养24 h 的斑马鱼胚胎中，加入多巴胺 D2 受体激动剂溴隐亭。结果显示，溴隐亭缓解了氯氮平导致的心包水肿，胚胎心率明显恢复，SV⁃BA距离较H+CLP 组显著缩短（图3A~C）。进一步检测发现，凋亡相关基因 Caspase3 和 Bax/Bcl2 及内质网应激相关基因 Chop、Bip，较氯氮平处理组显著下调（图3D、E）。结果表明，激活多巴胺D2受体可以抑制内质网应激，显著改善了氯氮平导致的心脏发育损伤。

3 讨论

本研究使用斑马鱼胚胎为研究模型，发现氯氮平可以诱导胚胎期斑马鱼心脏线性化及功能损伤，抑制心脏发育相关基因表达，增加内质网相关基因Chop、 Bip及凋亡相关基因、Caspase3、Bax/Bcl2的表达。内质网应激抑制剂4⁃苯基丁酸及溴隐亭显著缓解氯氮平诱导的心脏损伤，降低Chop、Bip、Caspase3及Bax/ Bcl2的表达水平。

斑马鱼是药物筛选的优良模型，已成为体内毒性试验的模式生物，包括心脏毒性、致畸、神经毒性、基因毒性等^[16]。斑马鱼的心脏在受精后26 h左右开始跳动，48 h观察到血液循环。因此，斑马鱼胚胎提供了一种低成本、易于处理的系统来观察心脏发育、腔室变化和血液流动的模型^[17]。

以往研究发现，氯氮平处理斑马鱼的半数致死浓度（LC₅₀）值为 50 μmol/L，为了保证一定的存活率进行后续实验，本文选择12.5 μmol/L及25.0 μmol/L CLP处理斑马鱼^[12]。形态学检测显示，氯氮平导致斑马鱼出现心包水肿、心动过缓，与既往文献报道一致^[12]，本文还发现氯氮平会导致斑马鱼心房与心室部分重叠减少，心脏结构线性化，并抑制斑马鱼 NKX2.5、Hand2、Cmlc2 表达。 NKX2.5、Hand2、 Cmlc2在心脏发育及功能成熟中发挥重要作用，其中转录因子NKX2.5 在心脏形成、环化以及成熟中起作用，该基因缺失会导致心脏房间隔缺损和房室传导缺损；Hand2是转录因子Hand家族成员，其家族在发育中的心室中不对称表达，在心脏形态发生中起着至关重要的作用，且调节血管发育和生成，是先天性心脏病的介质；Cmlc2调控心肌细胞增殖、心脏收缩和肌纤维组装^[18-20]。

长期内质网应激可诱导细胞凋亡并与多种心血管疾病相关，如心力衰竭、心肌病和缺血性心脏病^[14]。内质网应激由位于内质网膜上的3个传感器介导：IRE1α、ATF6和PERK，这些途径通过Bip的解离激活。未折叠蛋白的积累将Bip募集到内质网腔中，其与 IRE1α、ATF6 和 PERK 的解离导致其活化。在 Bip 解离后，ATF6 诱导 Bip、CREB、Chop 和 XBP1 基因的转录。PERK 同样激活 Chop 的转录， Chop 是一种转录因子，主要控制促凋亡因子的表达^[21-22]。内质网应激引起的细胞死亡是通过细胞凋亡的线粒体途径发生的，由Bcl⁃2蛋白质家族高度调节。其中 Bcl2 是抗凋亡蛋白，Bax 是促凋亡蛋白， Bcl2 通过抑制 Bax 亚家族蛋白，阻止线粒体释放 Caspase激活因子，从而抑制细胞凋亡^[23]。本研究发现氯氮平可诱导内质网应激相关基因Chop及Bip表达，细胞凋亡相关基因 Bax/Bcl2、Caspase3 表达；而使用4⁃苯基丁酸抑制内质网应激至72 hpf时，斑马鱼心包水肿、心率过缓、心脏线性化等均得到缓解， Chop、Bip、Bax/Bcl2 及 Caspase3 表达均降低。这些结果说明氯氮平能诱导内质网应激，进一步诱导 Caspase3 及 Bax/Bcl2 的表达，提示氯氮平能诱导细胞凋亡。

研究报道，氯氮平抗精神病药物的作用基础是暂时占据人纹状体中的多巴胺D2受体^[6]。本文使用溴隐亭处理斑马鱼胚胎，寻找氯氮平引起内质网应激的主要原因。溴隐亭是一种多巴胺D2受体激动剂，作为围产期心肌病治疗药物，具有高效和安全性^[24]。溴隐亭处理后相较于H⁃CLP组，内质网应激标志基因显著下调，斑马鱼心包水肿、心率过缓，心脏环化均得到缓解。以上提示，氯氮平引起胚胎发育的心脏损伤，可能是其多巴胺D2受体的毒性作用所致。

综上所述，氯氮平可能因其抑制多巴胺 D2 受体，导致胚胎出现内质网应激，引起了细胞凋亡，最终造成了斑马鱼心脏发育损伤。

参考文献