非酒精性脂肪肝（non⁃alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是指没有过多饮酒，但肝细胞出现以脂质沉积和脂肪变性为特征的一种临床病理综合征。目前我国 NAFLD 平均患病率高达 29%，且患者通常伴随 2 型糖尿病、肥胖、心血管疾病等慢性相关疾病^[1]。目前认为 NAFLD 的发生取决于多种因素的综合作用，如脂代谢异常、内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）、氧化应激、线粒体失功能、炎症等。其中，ERS被认为是NAFLD发展过程中最重要的因素之一^[2]。

槲皮素（quercetin，Que）是一种天然黄酮类化合物，是众多中草药发挥生物学治疗效应的主要成分，如柴胡、桑叶和银杏等^[3]。Que对多种疾病具有预防和治疗作用，其机制体现为抗氧化、抗炎、抗癌和提高免疫力等^[4]。有研究表明，Que对NAFLD体内外模型具有明显的干预作用，涉及的机制主要包括抑制炎症、氧化应激、凋亡以及对自噬的调控^[5]。然而，Que 对 NAFLD 模型下 ERS 相关通路的调控作用目前少有报道，本课题组前期研究发现对ERS调控可明显改善 NAFLD 大鼠肝细胞脂毒性损伤^[6]。因此，本研究利用高脂饲料喂养（high fat diet，HFD） 建立 NAFLD 大鼠模型，探讨 Que 是否可通过调控 ERS信号通路从而改善NAFLD，为Que治疗NAFLD 相关机制研究提供实验基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF 级健康雄性 SD 大鼠 26 只（180~200 g）购买于成都达硕实验动物有限公司，经检验合格后饲养于贵州中医药大学实验动物中心，条件为：室温 20~25℃，湿度70%，分笼饲养，自由饮食饮水，12 h 明暗交替。实验所用大鼠专用高脂饲料购于成都达硕实验动物有限公司。本研究获得贵州中医药大学动物保护伦理委员会的批准（实验伦理号： 20220058）。

1.1.2 细胞及试剂

人肝癌细胞系（HepG2，CL⁃0103，武汉普诺赛生命科技有限公司）；Que（abs47048075，上海爱必信公司）； 甘油三酯（triglyceride，TG）测定试剂盒（A110⁃1⁃1）、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒（A111⁃1⁃1） 和油红O染液（D027⁃1⁃1）（南京建成生物工程研究所）；大鼠胰岛素酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒（ZC⁃37507，上海茁彩生物科技有限公司）；TRIzol^TM 试剂 （15596026，Ambion公司，美国）；5×qRT SuperMix和 2× SYBR Green qPCR Master Mix（Bimake 公司，美国）；β⁃actin商业化荧光定量引物（B661202，上海生工公司）；RIPA 裂解液（R0010，北京索莱宝公司）； BCA 蛋白定量试剂盒、10% PAGE 凝胶快速制备试剂盒、蛋白酶抑制剂混合液、蛋白上样缓冲液、三色预染蛋白标记蛋白、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.22 μm）和快速转膜缓冲液 （上海雅酶生物公司）；C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、激活转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）抗体（Bimake公司，美国）； 葡萄糖调节蛋白 78（glucose regulation protein 78， BiP）、X ⁃盒结合蛋白 1s（X box ⁃ binding protein ⁃1s， XBP⁃1s）和X⁃盒结合蛋白1u（X box⁃binding protein⁃1u， XBP⁃1u）抗体（武汉 Proteintech 公司）；激活转录因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）抗体 （D262665，上海生工公司）；β⁃肌动蛋白（β⁃actin， bsm⁃33036M，北京博奥森公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G， IgG，AS014）和山羊抗小鼠IgG（AS003）（武汉ABclonal 公司）；棕榈酸（palmitic acid，PA，P432956，上海阿拉丁公司）；衣霉素（tunicamycin，TM，T7765，Sigma 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（abs50003，上海爱必信公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型建立

大鼠适应性饲养1周后，遵循体重随机分配原则按实验设计分为以下 4 组：正常对照组（Control， 8 只，普通饲料喂养）；模型组（HFD，8只，高脂饲料喂养）；Que低剂量组[HFD+Que（L），5只，高脂饲料喂养，25 mg/kg Que灌胃]；Que高剂量组[HFD+Que （H），5 只，高脂饲料喂养，50 mg/kg Que 灌胃]。高脂饲料喂养 8 周后，正常对照组和模型组各取 3 只大鼠麻醉处死检测模型建立情况，其余继续喂养。各干预组于高脂饲养第 8 周建模成功后开始进行Que每天灌胃1次，共灌胃8周，其余组予以蒸馏水灌胃作为对照处理。各组动物在高脂喂养前1 d、第 4、8、12、16周进行体重、进食量检测。

1.2.2 血清生化指标检测

检测前 1 d 禁食 16 h，第 2 天通过鼠尾静脉采血，检测空腹血糖；收集外周血清全自动生化仪进行 TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇（low⁃density lipoprotein⁃cholesterol，LDL⁃C）、高密度脂蛋白胆固醇（high⁃density lipoprotein⁃cholesterol，HDL⁃C）、天冬氨酸氨基转移酶（glutamic oxalacetic transaminase， AST）、丙氨酸氨基转移酶（glutamic⁃pyruvic transami⁃ nase，ALT）水平检测。通过大鼠胰岛素ELISA试剂盒检测各组大鼠血清空腹胰岛素水平。

1.2.3 糖耐量试验

检测前1 d禁食16 h，第2天腹腔注射50%高糖溶液（2.0 g/kg），分别于注射后0、10、30、60、120 min 通过尾静脉采血利用血糖测试仪检测血糖变化情况。

1.2.4 苏木素⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色

动物饲养16周后，戊巴比妥钠进行麻醉取血处死后开腹完整取出大鼠肝脏进行形态学观察并拍照。之后对肝脏组织进行称重及体积测量（量筒法）。肝脏组织经石蜡包埋成块后，在组织切片机上切片留存以备下一步组织学染色。切片分别在二甲苯Ⅰ液、Ⅱ液、Ⅲ液中分别浸泡 5 min 进行脱蜡；而后依次在100%、95%、90%、80%和70%乙醇中各浸泡 5 min 进行脱水并用蒸馏水冲洗；加入苏木素染液染3~8 min，蒸馏水冲洗后1%盐酸酒精分化 5~10 s，蒸馏水冲洗干净；加入伊红染液染3 min后冲洗干净；再依次加入70%、80%、90%、95%和100% 乙醇浸泡5 min脱水；之后分别在二甲苯Ⅰ液、Ⅱ液中浸泡 5 min 透明化；最后盖玻片封片后显微镜下观察染色结果。

1.2.5 马松（Masson）染色

脱水步骤与 HE 染色相同，而后加入苏木素染色染核 1~2 min，蒸馏水冲洗后 1%盐酸酒精分化 3~5 min，蒸馏水冲洗；加入 Masson 丽春红染液染 5~10 min，1% 磷钼酸溶液洗 2~3 min，1%苯胺蓝染液染 5 min；最后经 95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后镜下观察并拍照。

1.2.6 油红O染色

组织冰冻切片后中性甲醛固定5~10 min，清洗后加入配制好的油红O工作液染色10 min；清洗后加入苏木素染液染核1 min；超纯水清洗后显微镜观察染色结果。

1.2.7 肝脏组织TC、TG检测

肝脏组织 TC、TG 表达水平根据检测试剂盒说明书进行操作。首先将组织加入无水乙醇匀浆后离心制备上清待检；96孔板依次加入空白、标准品、样本 2.5 μL、工作液 250 μL 后 37℃孵育 10 min；酶标仪检测各孔510 nm吸光值后绘制标准曲线，结合蛋白浓度计算出结果。

1.2.8 实时荧光定量 PCR 法（quantitative real⁃time PCR，RT⁃qPCR）检测肝脏组织ERS相关基因表达

液氮研磨组织，加入 TRIzol^TM试剂后提取组织总 RNA，随后加入反转录试剂将 RNA 逆转录为 cDNA。各组肝脏组织Chop、Bip、Atf6、Atf4、Xbp⁃1s基因表达通过实时荧光定量PCR仪进行扩增检测，扩增条件为95℃预变性5 min、95℃ 10 s、65℃ 1 min共 39个循环；熔解曲线反应条件为65~95℃每隔0.5℃ 进行信号检测绘制；内参基因为β⁃actin，各组基因表达差异采用2^-ΔΔCT相对定量法进行分析。本实验引物序列见表1。

1.2.9 蛋白印迹（western blot，WB）法检测ERS相关蛋白表达

肝脏组织及细胞加入RIPA裂解液后匀浆提取组织总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度后经高温变性后保存于-80℃备用。蛋白经凝胶电泳后， 350 mA、40 min 快速转移至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后加入相应一抗：BiP（1∶1 000）、CHOP （1∶1 000）、ATF4（1∶1 000）、ATF6（1∶1 000）、XBP⁃1s （1∶500）、XBP⁃1u（1∶500）和β⁃actin（1∶3 000），4℃孵育过夜；次日 PBST 清洗 3 次后加入二抗（1∶5 000） 常温孵育1 h；PBS吐温缓冲液清洗3次后加入ECL 显影液进行曝光，各组蛋白灰度值通过Image J软件进行灰度计算，经内参蛋白灰度值进行校正（即对照组蛋白表达值为1），得出各组蛋白相对表达量。

1.2.10 细胞培养及分组

人 HepG2 细胞系在 37℃、5% CO₂条件下培养于DMEM高糖培养基中。通过加入400 μmol/L PA 诱导24 h建立细胞脂毒性损伤模型（模型组），同时根据经前期实验结果设立Que（100 μmol/L）干预组， Que 在模型组给药时随 PA 一起加入细胞培养基中。此外，通过 ERS 诱导剂 TM（1 μg/mL）诱导 HepG2 细胞 24 h 建立细胞 ERS 模型，同时设立 Que （100 μmol/L）干预组，干预方法为Que随TM一同加入细胞培养基中。

1.2.11 CCK⁃8细胞活性检测

通过 CCK⁃8 细胞活性试剂盒检测细胞活性。细胞接种于 96 孔板，经 PA 或 TM 处理及药物干预后，向各组细胞培养基中加入1/10体积的CCK⁃8试剂，37℃孵育2~4 h后，采用酶标仪检测在450 nm波长下的吸光值，计算细胞相对活性。

1.3 统计学方法

通过SPSS 25.0软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，对于符合正态分布的数据，采用t检验进行组间比较；对于多组数据先进行单因素方差分析，而后进行多组组间比较，P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Que对NAFLD大鼠生理指标、血脂代谢的影响

体重监测结果显示各组大鼠在饲养期间体重、进食量差异无统计学意义（图1A、B）。与Control组比较，HFD 组大鼠血清 TG、TC、LDL ⁃C 浓度增加 （P <0.05），HDL⁃C 浓度降低（P <0.05）；与 HFD 组比较，HFD+Que（L）组大鼠血清TG、TC、LDL⁃C浓度降低（P <0.05），HDL⁃C浓度升高但差异无统计学意义 （P >0.05）；与HFD组比较，HFD+Que（H）组大鼠血清TG、TC浓度降低（P <0.05），LDL⁃C浓度稍降，差异无统计学意义（P >0.05），HDL⁃C浓度升高，差异无统计学意义（P >0.05，图1C~F）。

2.2 Que对NAFLD大鼠肝脏形态和功能的影响

与Control组比较，HFD组大鼠血清肝脏功能指标AST和ALT浓度升高，与HFD组比较，HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组AST和ALT浓度降低（P <0.05，图2A、B）。解剖大鼠完整分离其肝脏发现，与Con⁃ trol组比较，HFD组大鼠肝脏形态明显脂肪化，颜色偏白且体积增加（P <0.01）、重量增加（P <0.05）；与 HFD组比较，HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组肝脏体积、重量均减少（P <0.05，图2C~E）。Masson染色结果提示，与Control 组比较，HFD 组肝脏组织胶原沉积增加较为明显，提示肝脏纤维化区域增加；与 HFD组比较，HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组肝脏组织纤维化区域有所减少（图2F）。

2.3 Que对NAFLD大鼠肝脏脂质沉积的影响

HE染色结果显示，与Control组比较，HFD组肝脏肝细胞脂肪变性明显，形态明显肿胀且呈气球样变及呈空泡化，而HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组肝细胞脂肪变性程度有所改善（图3A）。油红O染色结果显示，与Control 组比较，HFD 组肝脏组织细胞脂质沉积明显增加，表现为大量脂滴聚集于肝细胞，而HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组大鼠肝细胞脂质沉积有所减少（图3B）。此外，本研究检测了大鼠肝脏组织TG与TC的含量，结果显示与Control组比较，HFD 组肝脏组织内 TG 与 TC 含量增加；HFD+ Que（H）组肝组织 TG 与 TC 相比 HFD 组减少（P <0.05）；而 HFD+Que（L）组肝组织 TG 相比 HFD 组减少（P <0.05），肝组织TC平均值减少但差异无统计学意义（P >0.05，图3C、D）。

2.4 Que对NAFLD大鼠糖代谢的影响

NAFLD是一种代谢性疾病，其发生发展与糖代谢密切相关，因此本研究评估了Que对NAFLD大鼠糖代谢的影响。各组大鼠空腹血糖结果显示，与 Control 组比较，HFD 组大鼠空腹血糖值稍有升高，而 HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组大鼠空腹血糖值与HFD组比较稍有降低，但各组血糖值差异均无统计学意义（P >0.05，图4A）。空腹胰岛素检测结果显示，与Control 组比较，HFD 组大鼠空腹胰岛素明显升高（P <0.01），结合血糖轻微升高情况，提示 HFD 组大鼠出现了胰岛素抵抗；与 HFD 组比较， HFD+Que（L）、HFD+Que（H）组大鼠空腹胰岛素水平明显降低（P <0.05），提示胰岛素抵抗减轻（图4B）。

糖耐量试验发现，30 min时，与Control组比较， HFD组血糖值升高（P <0.05），HFD+Que（L）组血糖值相比 HFD 组降低（P <0.05），HFD+Que（H）组与 HFD 组血糖值差异无统计学意义；60 min 后，与 Control组比较，HFD组血糖值升高（P <0.05），而HFD+ Que（L）、HFD+Que（H）组血糖值相比 HFD 组降低 （P <0.05）；120 min后各组大鼠血糖水平差异无统计学意义（图4C）。以上糖耐量实验显示HFD组大鼠存在糖耐量受损情况，而Que低、高剂量灌胃可改善高脂饲料诱导的大鼠糖耐量受损。

2.5 Que减轻NAFLD大鼠肝脏组织ERS水平

ERS在NAFLD发生发展过程中扮演关键作用，为了探讨Que是否可通过调控ERS相关通路从而改善NAFLD，本研究检测了ERS相关通路重要分子的表达变化。RT⁃qPCR 结果显示，与 Control 组比较， HFD 组大鼠肝脏组织 ERS 通路重要基因 Bip、Atf6、 Atf4、Xbp⁃1s 和 Chop 表达显著增加（P <0.05 或 P <0.01），Que低、高剂量灌胃处理可降低以上基因在肝脏组织表达水平（P <0.05或P <0.01，图5A~E）。蛋白检测结果显示，在NAFLD模型大鼠肝脏组织中， ERS 信号通路关键蛋白 BiP 和 CHOP 表达均升高， ERS发展过程中涉及的3条主要通路关键蛋白ATF4、 ATF6 以及 XBP ⁃1 剪切体 XBP ⁃1s 表达也均有升高 （P <0.05或P <0.01）；与HFD组相比，Que低、高剂量干预可显著降低大鼠肝脏组织中ERS通路相关蛋白表达（P <0.05或P <0.01，图5F）。以上结果提示Que 低、高剂量干预可减轻NAFLD大鼠肝脏组织ERS，这可能是Que改善大鼠NAFLD的重要机制之一。

2.6 Que通过抑制ERS通路减轻肝细胞脂毒性损伤

为了进一步验证体内实验结果，同时探索 Que改善NAFLD的分子机制，利用PA（400 μmol/L） 诱导 HepG2 细胞建立脂毒性损伤模型，并观察 Que（100 μmol/L）的干预效果。CCK⁃8 结果显示， PA 诱导 24 h 后，HepG2 细胞活性降低至 60%，而 Que 干预后细胞活性恢复至 81%，提示 Que 可改善 PA对HepG2细胞的活性抑制（图6A）。WB结果显示，PA 可诱导ERS 信号通路关键蛋白BiP 和CHOP 表达升高，而Que可以降低其表达（图6B），提示Que 可抑制PA引起的HepG2细胞ERS。本研究进一步使用ERS诱导剂TM（1 μg/mL）建立ERS细胞模型，观察 Que 对 ERS 激动剂引起 HepG2 细胞的损伤是否同样具有干预作用。CCK⁃8 结果显示，TM 诱导 24 h后，HepG2细胞活性降低至63%，而Que干预后细胞活性恢复至84%，提示Que可改善TM对HepG2 细胞的活性抑制（图6C）。WB结果显示，TM可诱导 ERS 信号通路关键蛋白 BiP 和 CHOP 表达升高，而Que 可以明显抑制其表达，提示 Que 可通过抑制 ERS 通路减轻 ERS 激动剂引起的细胞损伤（图6D）。以上结果提示Que可通过抑制ERS通路减轻肝细胞脂毒性损伤。

3 讨论

NAFLD作为一种代谢性疾病，其发病机制十分复杂。目前认为过量代谢底物如脂肪酸积聚于肝细胞内导致的肝细胞功能损伤是NAFLD发生发展的最关键因素^[7]。内质网作为细胞内负责蛋白质、脂类、糖类合成，折叠，包装，修饰和转运的重要细胞器，对细胞整体代谢和功能稳态的维持起到了非常重要的作用^[8]。当肝细胞内代谢底物（如脂肪酸、蛋白质等）过量积聚时，未折叠蛋白及脂质水平失调，内质网“工作”压力负荷增大，此时内质网便会启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）来帮助内质网降低压力负荷从而使细胞功能恢复稳态^[9]。如果UPR长期进行仍无法使细胞功能恢复稳态，ERS便会发生^[10]。持续的ERS可诱发炎症、氧化应激并与之相交联，共同促进NAFLD的发生发展。有文献表明，NAFLD患者肝脏组织ERS水平明显增加^[11]，并且ERS在NAFLD发生的早期过程中起关键作用^[12]。ERS 激活主要涉及 IRE1/XBP1、 ATF6 以及 PERK/ATF4 3 条信号通路，本研究利用高脂饲料喂养大鼠从而模拟人NAFLD自然发生过程，结果发现高脂饲养16周后，模型组大鼠肝脏组织ERS 3条信号通路关键基因及蛋白XBP⁃1s、ATF4 和 ATF6 表达均有不同程度增高，提示 ERS 通路在模型组大鼠持续激活。其中转录因子XBP1由相关酶从未剪切体 XBP⁃1u 剪切为具有活性的 XBP⁃1s，观察到XBP⁃1s升高的同时，XBP⁃1u未有明显升高，提示 ERS 的高度激活。同时本研究也检测了 ERS 早期关键蛋白BiP以及晚期凋亡诱导蛋白CHOP的变化，结果显示二者均有升高，提示本研究中大鼠肝脏组织在持续的ERS 影响下，肝细胞通过CHOP 转录因子启动凋亡程序^[13]，而肝细胞凋亡将直接影响肝脏功能。

Que是众多中草药发挥生物学治疗效应的主要成分，如柴胡、桑叶、赶黄草和银杏等。其中保肝降酶中成药肝苏颗粒便是由赶黄草成分加工而成，文献表明Que是肝苏颗粒发挥其对肝脏疾病治疗作用的主要成分^[14]。目前，已有较多研究表明 Que 对 NAFLD 具有明显的干预作用。有研究利用高脂饲料喂养建立 SD 大鼠 NAFLD 模型并利用 Que 低剂量（75 mg/kg）、高剂量（300 mg/kg）灌胃12周后发现Que能阻止大鼠血清抗炎因子IL⁃10浓度降低及促炎因子 IL⁃18 浓度升高，提示 Que 改善 NAFLD 的作用与其调控炎症作用有关^[15]。另有研究在大鼠高脂饲料喂养并给药10周后发现Que低、高剂量组 （40 mg/kg、80 mg/kg）大鼠肝脏脂质沉积降低，炎性细胞浸润减少，同时肝脏纤维化病程度减轻，并且这种作用可能是通过PI3K/AKT/NF⁃κB信号通路实现的^[16]。此外，Que还可以改善NAFLD大鼠胰岛素抵抗^[17] 和肝脏氧化应激损伤^[18]。然而，ERS 作为 NAFLD发展过程中最关键的因素之一，Que对其是否具有干预作用报道很少。本研究观察了Que低、高剂量给药对NAFLD大鼠肝脏组织ERS水平的影响，发现与模型组相比较，Que明显降低了ERS 3条通路中关键蛋白 XBP ⁃1s、ATF4 和 ATF6 的表达水平，同时也降低了ERS⁃凋亡通路关键蛋白CHOP的表达水平，提示Que对ERS的干预是多靶点的，并且可能减轻ERS诱导的肝细胞凋亡。值得注意的是，不同研究中Que大鼠灌胃给药用量差别非常大，在 30~500 mg/kg 之间，造成这种差异的主要原因可能是不同实验采用了不同来源的Que以及灌胃溶液制备方法，从而导致Que的制作工艺、纯度以及稀释方法均有所差异，造成了大鼠的吸收利用度不同。本研究根据前期研究结果，采用了低剂量（25 mg/kg） 和高剂量（50 mg/kg）两种浓度以观察不同剂量Que 对NAFLD大鼠是否具有不同的干预效果。结果提示，综合各项指标研究结果，发现Que高、低两种浓度都有效减轻了NAFLD大鼠肝脏损伤以及ERS程度，但两组干预效果差异无统计学意义。此外，本研究予大鼠8周高脂饲料喂养建模成功后再进行给药而不是从建模初期给药，目的是更好地模拟临床实际情况，即大部分患者服药时已发展为NAFLD。因此，本研究重点观察Que的治疗作用而不是预防作用。本研究同时观察到 Que 在减轻 NAFLD 大鼠肝脏病理变化的同时，还可以改善大鼠糖耐量受损和胰岛素抵抗现象。NAFLD 与代谢综合征常常联系紧密，NAFLD患者往往伴随胰岛素抵抗、脂代谢异常以及高尿酸血症^[19]。因此，本研究提示Que在抑制NAFLD发生发展过程的同时，还可以改善大鼠脂代谢异常以及胰岛素抵抗，提示Que的治疗作用是多靶点的，同时也是Que相比其他单体药物在发挥治疗效应时的一大优点。由于ERS是NAFLD发生发展早期过程中最关键的因素^[20]，因此，对Que调控 ERS信号通路及关键靶点进行更深入地研究有助于揭示 Que 以及以 Que 为主要成分的中药药物防治 NAFLD的机制。

综上所述，本研究发现Que可以改善NAFLD大鼠脂代谢异常、糖耐量受损、肝脏脂质沉积以及病理学改变，同时首次发现其机制可能与调控ERS相关通路有关。本研究为进一步深入阐明 Que 改善 NAFLD的作用机制研究提供了实验依据。

参考文献