系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）是一种自身免疫性疾病，其特征是对自身抗原的耐受性丧失、自身抗体的过度产生、补体激活和免疫复合物沉积，并引起多器官功能的损伤^[1-3]，其病因尚不完全明确，目前认为可由多种因素诱发。 SLE 的小鼠模型有自发性和诱导型。姥鲛烷（pris⁃ tane）是常用的SLE小鼠模型诱导剂，它是一种烯烃类化合物，化学名为 2，6，10，14⁃四甲基十五烷，可来源于石油或海洋生物，具有细胞毒性，可诱导细胞凋亡，向不同品系小鼠腹腔注射姥鲛烷会导致狼疮样自身免疫综合征，类似人类SLE症状。因此姥鲛烷常作为诱导剂建立狼疮小鼠模型^[4-5]。

S100A9又被称为髓相关蛋白l4（myeloid⁃related proteins 14，MRP14），是属于S100钙调素家族的Ca²⁺ 结合蛋白。S100A9主要来源于免疫细胞，如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞。近年来多数研究表明， S100A9 在创伤、感染、应激及炎症中显著上调^[6-7]，在类风湿性关节炎、干燥综合征及SLE等自身免疫性疾病患者体内也呈现较高水平^[7-9]。狼疮性肾炎 （lupus nephritis，LN）是SLE中较为严重的一种并发症，发生率达 30%，影响患者的治疗效果和预后。有报道显示，S100A9蛋白与SLE患者肾损害的活动性相关^[10]。但是，S100A9的具体作用尚不清楚。为了进一步探索S100A9蛋白在SLE及LN发生发展中扮演的角色，本研究建立了动物模型，系统比较了姥鲛烷诱导野生型和 S100A9 基因敲除 C57BL/6 （B6）小鼠的自身抗体、肾功能、肾脏病理等 LN 症状，旨在阐明S100A9在SLE中的具体作用，也期望为LN的诊断和疗效判定寻找新的生物学标志物。

1 材料和方法

1.1 材料

血清IgG 检测试剂盒（Ebioscience公司，美国）； 姥鲛烷（Sigma 公司，美国）；抗双链 DNA（double ⁃ stranded DNA，dsDNA）抗体检测试剂盒（湖南艾方生物科技有限公司）；肌酐、尿素氮检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），Bradford蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物技术有限公司），Triton⁃X⁃100（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。PCR 仪 （QuantStudio^TM 6 Flex，美国应用生物系统公司）；荧光显微镜（南京奥力科学仪器有限公司）。

B6小鼠购自南京大学模式动物研究所，S100A9 基因敲除（S100A9^-/-）的 B6 小鼠[动物许可证号 SYXK（苏）2019⁃0059]由南京医科大学鼓楼临床医学院风湿免疫科提供。所有小鼠均在南京医科大学鼓楼临床医学院动物中心SPF级环境中饲养。本研究获得南京医科大学鼓楼临床医学院动物保护伦理委员批准（20190503）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

正常B6小鼠及S100A9基因敲除（S100A9^-/-）的B6 小鼠各 10 只，体重为 16~20 g，所有小鼠均为雌性。 5只野生型和5只S100A9^-/- B6小鼠予一次性腹腔注射 0.5 mL 姥鲛烷，作为两组狼疮模型小鼠，分别为 B6+pristane 组和 S100A9^-/- B6+pristane 组；另外 5 只 B6小鼠野生型和5只S100A9^-/- B6小鼠予一次性腹腔注射 0.5 mL 生理盐水，作为两组对照组，分别为 B6组和S100A9^-/- B6组。6个月后，处死所有小鼠。

1.2.2 测量小鼠脾脏重量和长度

处死小鼠后取各组小鼠的脾脏，记录小鼠脾脏重量和长度。

1.2.3 小鼠尿蛋白检测

采用Bradford蛋白含量检测试剂盒检测小鼠尿蛋白。具体步骤如下：取各组小鼠尿液，稀释样品，稀释液总体积为5 μL，加入考马斯亮蓝G⁃250溶液 195 μL，充分混匀，放置2 min后，以标准曲线0号管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光值，绘制标准曲线并计算相应的蛋白质含量。

1.2.4 小鼠血清肌酐检测

应用肌酐测定试剂盒检测小鼠血清肌酐。具体方法如下：取各组小鼠血清，96孔酶标板中加入 6 μL 样本，每孔加入 180 μL 酶溶液 A，37℃孵育 5 min，546 nm波长测定吸光度值A1，然后向每孔中加入60 μL酶溶液B，37℃孵育5 min，546 nm波长测定吸光度A2，计算两次测定吸光度值的差值ΔA=A2-A1，按公式计算肌酐含量（μmol/L）=（ΔA _测定-ΔA _空白）/（ΔA _标准-ΔA _空白）×C _标准（C _标准指标准品浓度）。

1.2.5 血清尿素氮检测

按照尿素氮检测试剂盒操作说明进行：取各组小鼠血清，按照试剂盒步骤和剂量依次加入双蒸水、10 mmol/L尿素氮标准应用液、待测样本、缓冲酶液，混匀，37℃准确水浴10 min，再加入酚显色剂和碱性次氯酸钠，充分混匀，37℃水浴10 min，640 nm处测定吸光度值A。按公式计算尿素氮浓度（mmol/L）= （A _测定-A _空白）/（A _标准-A _空白）×C _标准×N（C _标准指标准品浓度，N为样本测试前的稀释倍数）。

1.2.6 血清抗ds⁃DNA抗体和IgG检测

取小鼠血清，参照抗 ds⁃DNA 抗体、血清 IgG 检测试剂盒说明书进行检测。

1.2.7 肾脏病理学检查

注射姥鲛烷6 个月后处死小鼠，分离肾脏，4% 中性甲醛固定，5 μm石蜡切片，常规脱蜡及水化，常规HE染色，制片完毕后于光镜下观察。

1.3 统计学方法

应用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行处理分析。服从正态分布的计量资料以均数±标准差 （$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的体重、脾脏重量和脾脏长度变化

结果显示，4组小鼠（B6、B6+pristane、S100A9^-/-B6和S100A9^-/-B6+pristane）之间体重差异没有统计学意义（图1A）。与B6鼠相比，姥鲛烷诱导的B6小鼠脾脏重量显著增加（图1B）、脾脏长度也显著增加 （图1C）。与姥鲛烷诱导的 B6 小鼠相比，姥鲛烷诱导的 S100A9^-/-B6 小鼠脾脏重量和脾脏长度均减少 [脾脏重量：（0.178±0.014）g vs.（0.140±0.005）g；脾脏长度：（2.080±0.086）cm vs.（1.840±0.044）cm]，差异均有统计学意义（图1B、C）。

2.2 各组小鼠肾脏病理情况

野生型和 S100A9^-/- B6 小鼠的肾脏形态正常。与野生型B6鼠相比，姥鲛烷诱导的B6小鼠肾脏出现明显的狼疮样改变，HE 染色下可见肾脏肾小球体积增大，肾小管上皮水肿样变性、管腔狭窄。与 S100A9^-/- B6 小鼠相比，姥鲛烷诱导的 S100A9^-/- B6 小鼠也表现出肾小管上皮水肿样变性、管腔狭窄等 LN症状（图2）。但姥鲛烷诱导的S100A9^-/- B6小鼠肾脏病理改变比姥鲛烷诱导的B6小鼠轻。

2.3 小鼠肾功能

血清肌酐和血清尿素氮是衡量肾功能的重要指标。结果表明，野生型和 S100A9^-/- B6 小鼠上述两种肾功能指标差异没有统计学意义。但是，姥鲛烷诱导的B6小鼠血清肌酐、血清尿素氮水平明显高于对照的B6小鼠。姥鲛烷诱导的S100A9^-/-B6小鼠这两种肾功能指标也明显高于对照的 S100A9^-/- B6 小鼠。进一步分析后发现，与姥鲛烷诱导的 B6 小鼠相比，姥鲛烷诱导的 S100A9^-/- B6 小鼠的血清肌酐和血清尿素氮水平较低[血清肌酐：（45.78± 3.15）μmol/L vs.（32.97±1.80）μmol/L；血清尿素氮： （5.743±0.388）mmol/L vs.（4.597±0.145）mmol/L]，且差异均有统计学意义（图3A、B）。

2.4 小鼠血清抗ds⁃DNA抗体和IgG

野生型和S100A9^-/-B6小鼠在姥鲛烷诱导后，自身抗 ds⁃DNA 抗体水平均显著高于相应的对照小鼠。但是姥鲛烷诱导的S100A9^-/-B6小鼠抗ds⁃DNA 抗体增高的程度明显低于姥鲛烷诱导的 B6 小鼠 （0.027±0.001 vs. 0.035±0.002），差异有统计学意义 （图4A）。血清IgG含量结果显示，姥鲛烷诱导的B6 小鼠、S100A9^-/-B6小鼠血清IgG含量均明显高于相应的对照小鼠。与姥鲛烷诱导的 B6 小鼠相比，姥鲛烷诱导的S100A9^-/-B6小鼠的血清IgG含量相对较低 [（197.50±16.53）g/L vs.（132.60±21.61）g/L，图4B]。

2.5 小鼠尿蛋白

小鼠尿蛋白检测结果显示，与B6鼠相比，姥鲛烷诱导的B6小鼠尿蛋白明显增加。与S100A9^-/-B6 小鼠相比，姥鲛烷诱导的S100A9^-/-B6小鼠尿蛋白也明显增加。但是，姥鲛烷诱导的 S100A9^-/- B6 小鼠尿蛋白水平较姥鲛烷诱导的 B6 小鼠低[（0.086± 0.004）mg/mL vs.（0.146±0.022）mg/mL]，差异有统计学意义（图5）。

3 讨论

SLE作为一种目前发病机制尚不明确的自身免疫性疾病，建立和研究狼疮动物模型对探索其发病机制及诊疗手段意义重大。1995年Satoh等^[11] 发现给小鼠腹腔注射姥鲛烷可成功诱导小鼠狼疮发作，目前姥鲛烷已成为常用的造模诱导剂。引发小鼠细胞凋亡进而产生自身抗体可能是姥鲛烷诱导狼疮发病机制中的一个关键因素，同时还伴有细胞因子分泌失调，生成氧自由基，造成炎症环境，从而出现狼疮症状^[4，12]。

本研究发现，在姥鲛烷的诱导下，野生型B6小鼠和 S100A9^-/- B6 小鼠均出现血清肌酐、尿素氮升高、尿蛋白增加等肾功能受损表现，同时还出现自身抗体（anti⁃dsDNA）浓度升高、脾脏增大以及肾脏狼疮样病理改变，提示野生型小鼠和 S100A9^-/- B6 小鼠在姥鲛烷处理后均诱导出狼疮样症状，小鼠狼疮模型建立成功。

S100A9 是 S100 蛋白家族中重要的成员之一，可介导炎症反应、调节细胞生长分化、诱导细胞凋亡等^[7]，与包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发生、发展相关。Pavón 等^[13] 采用双向电泳和基质辅助激光解吸电离质谱检测了外周血单个核细胞中的S100A9，发现SLE患者的S100A9水平，无论是在 mRNA和蛋白水平上，均明显高于正常人群。Dono⁃ hue 等^[14] 发现与对照组相比，青少年 SLE 患者血清 S100A9 升高，且活动性 SLE 患者的血清 S100A9 高于非活动性狼疮患者或健康人，并认为S100A9作为青少年SLE和活动性LN的生物标志物具有潜在的研究前景。但是，S100A9是否直接参与SLE的发生和进展尚不清楚。

为了探究S100A9是否与SLE发生相关，本研究应用S100A9基因敲除B6小鼠，采用姥鲛烷诱导狼疮，并系统比较了姥鲛烷诱导野生型B6组和姥鲛烷诱导S100A9^-/- B6组的小鼠狼疮症状。本研究发现姥鲛烷诱导的S100A9^-/- B6小鼠血清肌酐、尿素氮、尿蛋白及自身抗体的升高及脾脏肿大情况均较姥鲛烷诱导的 B6 小鼠轻。肾脏病理改变，即肾小管上皮细胞水肿也较姥鲛烷诱导的B6小鼠少。另外，本研究中诱发SLE的S100A9^-/-小鼠，其抗ds⁃DNA抗体水平明显低于诱发SLE的野生小鼠，提示S100A9 基因敲除可抑制小鼠自身免疫反应，可能是抑制了小鼠自身抗原的生成和释放，进而自身抗体的产生减少。综上所述，S100A9^-/- B6狼疮小鼠的脾脏、肾脏等损害表现比B6狼疮小鼠更轻，敲除S100A9后对狼疮小鼠有保护作用。这些结果说明S100A9参与了狼疮的炎症反应。Davison 等^[15]研究发现 S100A9缺陷的雄性NZBWF1小鼠的自身免疫加重，血清自身抗体水平升高，蛋白尿进展迅速。而雌性小鼠对S100A9缺乏没有反应，甚至疾病症状有所减轻。本研究也显示雌性小鼠S100A9基因敲除后病变程度较轻。因此，S100A9的作用还有待进一步探究，可采用不同的狼疮诱导方式，如咪喹莫特或雷西莫特诱导，来进一步明确S100A9在SLE发生中的作用。或者采用慢病毒转染等技术使小鼠体内S100A9 增加，然后观察不同诱导剂作用下的狼疮症状，才能比较全面和系统地验证S100A9与SLE发生的关系。

综上所述，S100A9基因与SLE的发生存在相关性。虽然其介导狼疮炎症反应的明确机制仍需进一步研究，但该基因可能成为SLE诊疗的新靶点，有望为SLE的诊疗提供新思路。

参考文献