据统计，2020年全球食管癌发病率居世界第8位，新发病例数约 60.4 万，死亡病例数约 54.4 万，其中一半以上的新发病例和死亡病例发生在我国（新发病例数32.4万，死亡病例数30.1万）^[1]。早期食管癌患者及时接受治疗后，5年生存率可达90%以上，但由于缺乏典型症状和体征，大多数患者就诊时往往已是中晚期，预后较差，5年总体生存率仅30%左右^[2]。寻找新的治疗方法和治疗靶点来改善食管癌患者的预后仍然是目前亟待解决的关键问题。皮肤T 细胞淋巴瘤相关抗原 15（cutaneous T cell lymphoma associated antigen 15，CTAGE15）作为CTAGE家族成员，是一个假基因^[3]。假基因被定义为与另一个基因相似但有缺陷的基因组序列，它们存在于几乎所有生命形式中，虽然通常被认为缺乏功能，但越来越多的假基因被发现有重要的生物学作用^[4]。 CTAGE 家族中多个成员的表达与多种肿瘤的进展及预后显著相关，但CTAGE15在肿瘤相关领域尚未见报道。为此本研究探讨CTAGE15在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中表达与患者临床预后及病理分期的关系，同时初步探讨该假基因对ESCC的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

收集的 ESCC 临床样本来自 2016 年 12 月— 2017年12月在南京医科大学附属淮安第一医院确诊为ESCC收治入院并行食管癌根治术的患者。纳入标准：①患者就诊之前均无其他恶性肿瘤病史； ②患者术前未行任何放疗、化疗或其他肿瘤治疗手段；③临床病例完善、随访资料完整；④经病理诊断确为ESCC。共收集 120例ESCC患者的食管鳞癌及癌旁组织，患者术前签署知情同意书，本研究已通过淮安市第一人民医院伦理审核（伦理编号：KY-2023-054-01）。

人ESCC细胞 KYSE⁃150、KYSE⁃30、KYSE⁃410、 TE⁃1（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），人正常食管上皮细胞HEEC（北京龙跃生物科技发展有限公司）。DMEM培养基（Gibco公司，美国）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hyclone 公司，美国），氨苄青霉素（Hyclone公司，美国），小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）由滁州通用生物（安徽）有限公司设计并生产。SDS⁃PAGE试剂（上海生工公司）。BCA Protein Assay Kit、GAPDH抗体（上海碧云天公司）。Lipofectamine^TM 3000 试剂（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 公共数据库分析

下载癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）中 82 例随访信息完整及临床病理和基本资料完善的ESCC 患者数据，按照CTAGE15 表达量中位数分为高表达组（n=41）和低表达组（n= 41），分析CTAGE15表达对患者总生存期及疾病特异性生存期的影响。

1.2.2 临床样本分析

将120例ESCC患者的食管鳞癌及癌旁样本提取 RNA 后逆转录为 cDNA，进行 qRT ⁃ PCR 检测 CTAGE15 表达量。相关引物由滁州通用生物（安徽）有限公司提供。CTAGE15：上游5′⁃ACCATTGG⁃ GTCAGCGTTCAT⁃3′；下游5′⁃GAAGCACAGGTGAG⁃ AGTCCC ⁃3′；内参 GAPDH：上游 5′ ⁃TCATTGACCT⁃ CAACTACATGGTTT⁃3′；下游 5′⁃GAAGATGGTGAT⁃ GGGATTTC⁃3′。PCR程序：95℃预变性2 min；95℃ 变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，重复40个循环。最后收集并处理数据，结果用2^-ΔΔCt法计算。

按照CTAGE15表达量的中位数将120例ESCC 患者分为高、低两组（各60例），分析其与患者临床病理因素，如性别、年龄、T分期、N分期、M分期和分化程度等因素之间的关系，及其对患者预后（5年总体生存率）的影响。

1.2.3 RNA干扰实验

培养KYSE⁃150细胞，按照si⁃CTAGE15干扰说明书在转染前1 d按4×10⁵ 个/孔接种6孔板，待细胞生长至70%~80%时采用Lipo⁃ fectamine^TM 3000试剂盒进行转染，转染后48 h收获细胞用于细胞实验和 qRT ⁃PCR。si ⁃CTAGE15 序列如下：siRNA1⁃F，5′ ⁃ ACAAAUAGCUGAAGCCAAATT ⁃ 3′；siRNA1⁃R，5′ ⁃ UUUGGCUUCAGCUAUUUGUTT⁃3′。siRNA2⁃F，5′⁃ GCUUAGAAGGAGAAAGAAATT ⁃3′；siRNA2⁃R，5′ ⁃ UUUCUUUCUCCUUCUAAGCTT ⁃3′。siRNA3⁃F，5′ ⁃ AAACAAAGGAAGAGCUUACTT ⁃3′；siRNA3⁃R，5′ ⁃ GUAAGCUCUUCCUUUGUUUTT⁃3′。阴性对照：F， 5′ ⁃ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT ⁃ 3′；R：5′ ⁃ AC⁃ GUGACACGUUCGGAGAATT⁃3′。

1.2.4 qRT⁃PCR

使用 TRIzol 从培养的 KYSE ⁃ 150、KYSE ⁃ 30、 KYSE ⁃410、TE ⁃1 细胞及 HEEC 细胞中提取 RNA， Prime Script RT Master Mix 反转录试剂盒将 1 ng RNA 逆转成cDNA，并按照qRT⁃PCR反应体系配制反应溶液。使用Nanodrop 2000/2000 C分光光度计测量 RNA 的浓度。用荧光定量 PCR 试剂盒在 ABI StepOnePlus^TM实时PCR系统上进行qRT⁃PCR实验，方法同1.2.2。

1.2.5 细胞划痕实验

先用黑色记号笔在 6 孔板背面每隔大约0.7 cm 划横线，每孔划3条横线。每孔加入5×10⁵ 个KYSE⁃ 150细胞。第2天用200 μL枪头垂直于背后的横线划痕。用PBS洗细胞3次，清除划下的细胞，加入无血清培养基，放入37℃、5% CO₂培养箱培养。按 0、 48 h时间点拍照。

1.2.6 细胞增殖实验

平板克隆实验：取对数期 KYSE⁃150 细胞做梯度稀释，6孔板每孔种3 000个细胞，培养约2周后从培养箱中取出，PBS 清洗 2 遍，每孔加入 1 mL 甲醇固定 20 min 后弃甲醇，每孔加入 1 mL 结晶紫染色 20 min，PBS洗2遍，晾干后用核酸凝胶成像仪拍照，观察克隆大小，计数超过50个克隆的数量。CCK⁃8 实验：将细胞按照实验设计要求接种于96孔板中，每组设置 3 个复孔，每孔接种 3 000 个细胞，分别在 24、48、72 h 按照 CCK⁃8 试剂盒说明书检测各组细胞450 nm处的吸光度值。

1.2.7 细胞迁移实验

将处于对数生长期的 KYSE⁃150 细胞胰酶消化后重悬并计数，调整细胞密度至 5×10⁴ 个/mL，取细胞悬液 200 μL加入Transwell小室。24 孔板下室加入 600 μL 含 10%胎牛血清的培养基，放入 37℃、5% CO₂培养箱培养48 h。然后取出Transwell 小室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS洗3遍，甲醇固定20 min。随后用0.1% 结晶紫染色30 min，PBS洗3遍。相差显微镜下随机选择5个视野观察细胞并计数。

1.2.8 细胞侵袭实验

将 Matrigel 基质胶 1∶20 稀释，包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置37℃ 6 h，使Matrigel 基质胶聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。将处于对数生长期的 KYSE⁃150 细胞胰酶消化后重悬计数，调整细胞密度至 2×10⁵ 个/mL，取细胞悬液 100 μL 加入 Transwell 小室。24 孔板下室加入 600 μL含 10%胎牛血清的培养基，放入37℃、5% CO₂培养箱培养48 h。然后取出Transwell 小室，弃去孔中培养液，用棉签轻轻擦掉 Matrigel 基质胶及上层未侵入细胞，PBS 洗 3 遍，甲醇固定 20 min。0.1%结晶紫染色 20 min，PBS 洗 3 遍。显微镜下随机选择 5 个视野观察细胞并记数。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0统计软件，计量资料采用均数± 标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用 Student’s t 检验分析，3组之间比较采用单因素方差分析或Dun⁃ nett⁃t检验。计数资料采用频数（百分比）表示，统计分析采用卡方检验。生存风险比例采用COX 单因素回归模型分析，生存分析选用 Kaplan⁃Meier（log⁃ rank）分析，图片使用 GraphPad Prism 8 软件绘制， P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA 数据库中 CTAGE15 与食管鳞癌预后的关系

通过TCGA数据库下载数据，按照CTAGE15表达量中位数将 ESCC 患者分为高表达和低表达两组，Kaplan⁃Meier 生存法分析总体生存期和疾病特异性生存期发现，CTAGE15表达与ESCC 患者生存期相关，高表达组患者生存期较长（图1A、B，P <0.05）。卡方分析表明，CTAGE15在ESCC中的表达与肿瘤T分期显著相关，GTAGE15高表达患者T分期相对更早（表1，P <0.05），进一步单因素Logistics 回归分析也与上述结果一致，CTAGE15与肿瘤T分期显著相关（表2，P <0.05）。

a：Based on chi⁃square test statistical analysis, and if necessary, based on Fisher’s exact test. b：Some of the sample data is missing due to reasons such as not being collected or protecting patient privacy obtained from the TCGA database.

2.2 CTAGE15 在 ESCC 患者临床样本中表达及其与患者病理特征的验证分析

临床样本的COX生存风险分析结果表明，N分期（P=0.040）及CTAGE15表达水平（P <0.001）是纳入本研究患者的生存风险因素，而性别、年龄、T分期、M 分期和分化程度与生存风险不相关（表3）。CTAGE15 虽然在 ESCC 中的表达上调（图2A，P <0.001），但却与肿瘤的 T 分期（P <0.01）及 N 分期 （P <0.001）呈负相关（图2B、C）。按照CTAGE15表达量中位数将120例ESCC患者分为高表达和低表达两组。CTAGE15高表达组的T分期、N分期较早的比例高于 CTAGE15 低表达组（表4）。Kaplan ⁃ Meier法分析总体生存期也显示CTAGE15高表达组患者的生存预后好于 CTAGE15 低表达组（图2D， P <0.001）。

2.3 CTAGE15 表达对 KYSE⁃150 细胞恶性表型的影响

与HEEC 细胞相比，ESCC 细胞系KYSE⁃150 细胞中 CTAGE15 表达显著上调（图3A），在 siRNA 敲低KYSE⁃150细胞中CTAGE15的表达后（图3B），划痕实验结果显示，KYSE⁃150 细胞（对照组、siRNA1 组、siRNA2 组、siRNA3 组的平均愈合率为 31.4%、6 4.5%、62.9%、66.9%，P <0.01，图3C、D）；进一步通过Transwell迁移实验发现（图3E、F），敲低CTAGE15后 KYSE ⁃150 细胞穿过小室的数量（siRNA1 组、 siRNA2 组、siRNA3 组分别为 372.33±7.59、339.33± 94.55、382.00±10.80）较对照组（221.00±15.51）显著增加，提示细胞迁移能力增强；Transwell 侵袭实验也与上述结果一致（对照组、siRNA1组、siRNA2组、 siRNA3 组的侵袭细胞数分别为 191.00 ± 23.04、 324.00±7.87、325.33±19.20、371.00±27.58），提示敲低GTAGE15后，细胞侵袭能力显著增强（P <0.001，图3E、G）；平板克隆实验（对照组、siRNA1 组、 siRNA2组、siRNA3组的KYSE⁃150细胞集落数分别为 772.00±61.16、1 388.67±130.44、1 566.33±94.55、 1 457.33±68.99，P <0.01，图3H、I）和CCK⁃8实验（对照组、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组第3天450 nm 处吸光度分别为 1.22±0.02、1.62±0.08、1.79±0.07、 1.53±0.02，P <0.001，图3J），提示 CTAGE15 表达下调后，KYSE⁃150细胞增殖能力显著增强。

a：Based on single factors logistics regression analysis. b：Some of the sample data is missing due to reasons such as not being collected or protecting patient privacy obtained from the TCGA database. OR：odd ratio；CI：confidence interval.

a：Based on Cox hazards analysis，the P⁃value was appropriately adjusted for gender，age，TNM staging，and tumor differentiation. N+：N1&N2&N3.

a：Based on chi ⁃ square test statistical analysis，and if necessary， based on Fisher’s exact test. N+：N1&N2&N3.

3 讨论

根据2023年国家癌症中心发布的中国癌症统计数据，食管癌是中国第六大癌症种类，也是第四大死亡原因，每年新发病例数 25.3 万，死亡病例数 19.4万^[5-6]。而ESCC病因复杂，早期症状不明显，患者确诊时往往已处于中晚期，且预后不佳^[7]。尽管近年来针对ESCC的诊断和靶向治疗手段取得了一定进展，但我国ESCC发病率和死亡率居高不下的现状仍在持续，近年来患者生存期并没有显著提高^[8-9]。因此，总体上针对ESCC的防治工作还未达到预期。

长期以来，基因重复被认为是新基因产生的主要机制之一，而在长期演化过程中，片段重复会积累各种突变从而产生假基因。1977年，Jacq等^[10] 首次使用“假基因”一词来描述非洲爪蟾中一个截短的 5S 核糖体 RNA 基因。最早，人们认为假基因不具有功能，但随着研究的进展，越来越多的证据证明假基因发挥着重要的生物学作用，“假基因”现在被用来定义任何与另一个基因相似但有缺陷的基因组序列^[11]。由于许多假基因发生了截短或突变，这使得它们不太可能（或不能）被翻译成蛋白质，然而，截短或突变并不能阻止假基因发挥生物学功能。Korneev等^[12] 在蜗牛中发现了一种一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）假基因，这个假基因相对于亲本基因是反义转录的，在体内可以与亲本基因形成稳定的RNA双链，从而抑制亲本NOS mRNA 的翻译。假基因发挥作用的另一种机制是影响染色质或基因组结构，Ma等^[13] 发现位于人β⁃珠蛋白基因簇中的假基因HBBP1（又称η⁃globin）在红细胞发育中发挥特异的关键调控作用，提出人类特异表达的假基因可能参与人类特异性状演化的新概念，为假基因功能机制研究提供重要参考。

CTAGE15 是 CTAGE 家族的成员，CTAGE 家族属于癌症/睾丸（cancer/testis，CT）抗原^[14]。CT 抗原在多种人类癌症中异常表达，参与肿瘤细胞的转录调控、有丝分裂和蛋白质降解等^[15]。CTAGE家族拥有15个成员（CTAGE1~15），其中多个成员被认为与肿瘤的发生发展有重要关联，CTAGE1、CTAGE5是肿瘤特异性抗原（tumor⁃specific antigens，TSA），之前的研究报道CTAGE1影响肿瘤细胞凋亡、增殖等，而 CTAGE5在蛋白质分泌和神经发育中至关重要^[16-17]。 Zhang 等^[3]对 CTAGE 家族的溯源研究认为， CTAGE15产生于CTAGE8（又名CTAGE4）的片段重复。CTAGE4在肿瘤及正常组织中差异表达，而关于 CTAGE15 及 CTAGE4 的功能作用和潜在机制尚未见报道^[18-19]。

不同于大多数CT家族成员基因位于X染色体，仅在人类生殖系和各种肿瘤细胞中表达，CTAGE家族分布于常染色体，并在多种正常组织中均有表达，鉴于生殖系干细胞与肿瘤细胞具有许多共同特征，在促癌基因异常激活的同时，CTAGE家族可能被一并激活，并参与肿瘤的发生中，CTAGE家族的这种特性可能是其在肿瘤组织及肿瘤细胞中高表达的原因^[20]。CTAGE家族的另一特性，即家族内大部分成员是通过逆向复制产生的，像亲本 NOS 转录出的 mRNA被其假基因抑制翻译一样，CTAGE家族成员转录出的mRNA可能互相形成稳定的RNA双链，从而抑制翻译，发挥抑癌作用^[3]。总之，CTAGE15 潜在的功能机制有待进一步研究。

本研究通过公共数据库及临床 ESCC 组织和 KYSE⁃150细胞发现CTAGE15表达水平显著高于正常食管上皮组织和HEEC细胞，且CTAGE15的表达水平与患者总体生存期呈正相关。细胞实验则表明，敲低CTAGE15的表达能显著增强KYSE⁃150细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在临床样本研究中， COX生存风险分析提示N分期、CTAGE15表达水平是影响 ESCC 患者生存的风险因素；临床病理因素的相关性分析提示 CTAGE15 与肿瘤的 T 分期及 N 分期呈负相关。导致基因表达上调常见的原因涉及细胞内外的各种调控机制，在细胞内，基因突变以及在转录水平、表观遗传学水平及蛋白质修饰等多种层面改变可以导致基因表达上调，而在细胞外，细胞因子的刺激和环境因素的影响也可以影响基因表达^[21-23]。本研究初步探索了CTAGE15在ESCC中的表达及其功能，所有这些结果都表明 CTAGE15 在 ESCC中可能发挥着抑制肿瘤进展的功能。

综上所述，ESCC 患者中 CTAGE15 的表达水平与其临床预后显著正相关，KYSE ⁃150 细胞中的 CTAGE15 高表达能够抑制细胞的恶性表型进展， CTAGE15 可能是预测ESCC患者预后及相关治疗的潜在新靶点。本研究也存在一定的局限性，CTAGE15 抑制 ESCC 进展的具体分子机制尚缺乏详细的研究，后续将设计实验对其详细作用机制进行探讨。

参考文献