小泛素相关修饰物（small ubiquitin ⁃ related modifier，SUMO）修饰是蛋白质翻译后修饰的一种，其能够调控蛋白的相互作用、活性及亚细胞定位^[1]，从而调节多种细胞进程。与泛素化过程类似，SUMO 化修饰是一个动态可逆的过程，SUMO 前体在泛素样蛋白加工酶（ubiquitin⁃like protein⁃specific protease，ULP）或SUMO特异性蛋白酶（sentrin⁃specific protease，SENP）的加工下产生 SUMO⁃GG，由 SUMO E1 酶（Aos1 ⁃ Uba2）激活，转移到 SUMO E2 酶 （Ubc9），并通过 SUMO E3 连接酶（PIAS）与底物结合，最后，修饰底物可通过ULP/SENP发生去SUMO 化，使蛋白质的 SUMO 化和去 SUMO 化处于动态平衡状态^[2-3]。

在哺乳动物中，去 SUMO 化酶 SENP 共有 6 种， SENP1 作为去 SUMO 化酶之一，拥有广泛的特异性底物，这些底物参与多种细胞生物学过程，如信号转导、细胞增殖、凋亡等^[4-6]。近年来，越来越多的研究发现 SENP1 在多种肿瘤中呈现出异常的高表达^[7-10]，促进肿瘤的发生发展，如在乳腺癌中，高表达的 SENP1 通过调控细胞周期素依赖性激酶 p21、p27 以及基质金属蛋白酶 9 的表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。由于 SENP 在肿瘤中的重要作用，其已被确定为肿瘤治疗的分子靶标^[11]。

SPOP（speckle type BTB/POZ protein）是泛素连接酶 E3 家族成员 Cul3 结合底物的接头蛋白，介导许多核蛋白的泛素化修饰，导致蛋白降解，从而调控细胞的多种生理过程^[12]。已有研究证实，SPOP的缺失或突变与多种肿瘤密切相关，包括前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌等^[13-14]。其中受SPOP影响最为显著的是肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma， ccRCC）。SPOP蛋白在正常肾脏组织中表达量非常低，但在 99%的 ccRCC 组织中却大量表达，表明 SPOP蛋白是一个潜在的ccRCC分子标志物。由于 SPOP在ccRCC中的重要作用，其已被确定为ccRCC 治疗的新靶点。前人根据SPOP所识别底物蛋白的晶体结构特点，获得了能够与 SPOP 蛋白结合的小分子化合物，并在体内和体外验证了其作用^[15-16]。 ccRCC中SPOP的相关研究虽然很多，但其在ccRCC 中特异性高表达的机制还未见报道。

2022 年 Lee 等^[17] 发现，去 SUMO 化酶 SENP1 在 ccRCC中存在异常的高表达。本课题组通过实验发现，在 Senp1 敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（murine embryonic fibroblasts，MEFs）中，Spop 的蛋白水平有所下降。因此，本研究拟探讨去 SUMO 化酶 Senp1 是否参与Spop的蛋白水平调控，并在ccRCC中初步探索 SENP1 与 SPOP 之间的相关性，以期为 ccRCC 的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

WT 和 Senp1^-/- MEFs 由上海交通大学医学院程金科教授馈赠；肾上皮细胞 HK⁃2 和 ccRCC 细胞 Caki⁃1、Caki⁃2、A498、786⁃O 均购于武汉普诺赛公司；DMEM 培养基、MEM 培养基、RPMI⁃1640 培养基、McCoy’s 5A 培养基、胎牛血清、0.25%EDTA⁃胰蛋白酶（Gibco 公司，美国）；青霉素/链霉素（苏州新赛美公司）；RNAiso Plus 细胞总 RNA 提取试剂 （TaKaRa公司，日本）；HiScriptⅡ Q⁃RT SuperMix for qPCR（gDNA wiper）逆转录试剂盒及 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 荧光定量 PCR 试剂盒（南京诺唯赞公司）；Duolink^® PLA试剂盒（Sigma公司，美国）；转染质粒试剂 Plus^TM Reagent（Thermo 公司，美国）；Lamin B1、α⁃Tubulin、Spop、HA 抗体（武汉三鹰）；Sumo1抗体（CST公司，美国）；c⁃Myc 抗体 （Sigma公司，美国）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或抗兔 IgG（Jackson ImmunoResearch 公司，美国）；MG132、放线菌酮（cycloheximide，CHX）（Sgima 公司，美国）；Myc⁃Senp1、Flag⁃Spop、Flag⁃Spop⁃K95R、 Flag⁃Spop⁃K110R、Flag⁃Spop⁃K95/110R 质粒均为本实验室自行构建。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

WT 和 Senp1^-/- MEFs 使用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基，肾上皮细胞 HK⁃2 和 ccRCC 细胞 A498 使用含 10% 胎牛血清的 MEM 培养基， ccRCC细胞Caki⁃1和Caki⁃2使用含10%胎牛血清的 McCoy’s 5A 培养基，ccRCC 细胞 786⁃O 使用含 10% 胎牛血清的RPMI⁃1640培养基，置于37℃、5% CO₂ 培养箱中进行培养。取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞转染

细胞汇合度达70%~80%时，加入质粒转染液，转染 6~8 h 后，换成正常的细胞培养液继续培养至 36~48 h，提取细胞总RNA和总蛋白进行后续实验，或者是培养至一定时间，收集瞬时转染的细胞，进行后续的实验。

1.2.3 细胞总RNA和总蛋白的提取

细胞总 RNA 的提取：收集细胞，先将细胞用 PBS清洗1遍，加入RNAiso Plus，冰上静置 5 min，加入1/5体积的氯仿，4℃冰箱静置10 min，4℃ 12 000 g 离心 10 min。离心后，上清移至干净的 RNase⁃Free离心管中，加入等体积异丙醇，混匀-20℃冰箱冷冻 1 h，4℃ 12 000 g 离心 10 min，弃上清，加入 75%乙醇（DEPC 水配制），4℃ 12 000 g 离心 5 min，弃上清，4℃晾干10 min，加入10 μL DEPC水，冰上溶解 30 min，测定RNA浓度。

细胞总蛋白的提取：收集细胞，先将细胞用 TBS 清洗 1~2 遍，加入适量的 RIPA 裂解液，刮板快速刮下细胞，将裂解液收集于干净的1.5 mL离心管中，冰上裂解15~30 min，4℃ 14 000 r/min离心20 min，离心后，将上清移至新的 1.5 mL 离心管中，吸取适量蛋白液进行 BCA 蛋白浓度的检测。加入相应体积的 5×上样缓冲液，95℃煮 5 min，使蛋白完全变性。

1.2.4 免疫印迹实验（Western blot）

制备好的蛋白样品常温14 000 r/min离心1 min，在SDS⁃PAGE胶上进行电泳。经湿转法恒压80 V，转膜 2 h，脱脂牛奶室温封闭 1 h，加一抗 4℃过夜。次日，TBST洗膜3次，每次15~20 min。室温孵育二抗2 h，洗膜后化学发光显影。

1.2.5 实时荧光定量PCR

使用 RNAiso 提取细胞总 RNA，逆转录试剂盒进行反转录，取10 μL反转录产物稀释至100 μL，取 1 μL做模板进行荧光定量PCR，软件Light Cycler 96 分析数据。每个实验组有3个复孔，实验结果重复 3 次。引物序列：GAPDH 上游 5′⁃CGACCACTTTGT⁃ CAAGCTCA ⁃ 3′，下游 5′ ⁃ CCCTGTT GCTGTAGC⁃ CAAAT ⁃3′；Spop 上游 5′ ⁃CCACCTCCGGCAGAAAT⁃ GTC⁃3′，下游5′⁃ CCTCCCGGCAAAAACTAAAGT⁃3′。

1.2.6 邻位连接技术（proximity ligation assay，PLA）

细胞转染质粒 24 h 后，PBS 清洗 1 遍，4%甲醛固定细胞，0.3% NP⁃40 透化细胞，根据 PLA 试剂盒中的步骤进行封闭、一抗孵育、添加探针、连接、扩增、封片，最后用激光共聚焦显微镜进行拍照分析。

1.2.7 免疫荧光染色

细胞转染后24 h，将细胞接种于用0.1%明胶包被的细胞爬片上，继续培养24 h后，PBS清洗1遍， 4%甲醛固定细胞，使用抗体稀释液（3% BSA、0.3% Triton X⁃100，溶于PBS）4℃下封闭并透化细胞1 h，之后4℃孵育一抗过夜。使用TBST清洗细胞2次，每次3~5 min，之后室温条件下荧光二抗避光孵育1 h，不同荧光二抗使用的稀释比例均为 1∶200。TBST 清洗细胞3次，每次3~5 min。最后使用封固剂（含 DAPI）将细胞爬片固定在载玻片上。拍摄使用 LSM900 激光共聚焦显微镜图像，图像处理使用ZEN 3.0（blue edition）软件。

1.2.8 蛋白周转速率检测

细胞接种于6孔板，待细胞长满后，用终浓度为 20 μmol/L的蛋白合成抑制剂CHX分别处理细胞各种不同时间，在相应时间点，收取蛋白样品进行 Western blot分析。

1.2.9 相关性分析

从GEO数据库中下载ccRCC患者的基因表达数据（GSE73731），利用 GraphPad Prism 7.0 对 SENP1 与 SPOP 的基因表达进行皮尔逊相关系数分析并作图。

1.3 统计学方法

采用 GraphPad Prism 7.0 进行统计分析并作图。计量资料采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，组内比较采用重复测量数据的方差分析，两组间比较采用 t 检验分析，多组间比较采用单因素方差分析。 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Senp1 敲除下调 Spop 蛋白水平但不影响其 mRNA水平

为了研究 Senp1 是否参与调控 Spop，本研究提取了WT和Senp1^-/- MEFs的RNA和蛋白，检测Senp1 敲除对于 Spop 表达的影响。结果显示，Senp1 敲除后，Spop 的蛋白水平显著下降（图1A、B），但其 mRNA水平没有明显变化（图1C）。由于Senp1是去 SUMO 化酶，所以上述结果提示 Senp1 可能参与了 Spop的SUMO化修饰过程。

随后，为了进一步确认Senp1对Spop蛋白水平的调控作用，在 Senp1^-/- MEFs 中梯度回补了 Senp1 蛋白。Western blot 结果显示，随着Senp1蛋白水平的升高，Spop的蛋白水平也随之梯度升高（图1D），进一步说明去SUMO化酶Senp1能够调节Spop的蛋白水平。

2.2 Senp1敲除后Spop蛋白稳定性下降

通常认为，影响底物蛋白的降解速率，即蛋白周转率，是SUMO化修饰对底物蛋白进行调控的重要手段。为了检测Senp1是否影响Spop的蛋白周转率，利用 CHX（20 μmol/L）分别处理 WT 和 Senp1^-/- MEFs不同时间后检测细胞中Spop的蛋白水平。结果显示，Senp1^-/- MEFs中的Spop含量下降到50%的时间要短于 WT MEFs（图2A、B），表明 Senp1 敲除后，Spop的蛋白周转率变快，蛋白稳定性下降。

后续，为了研究Spop蛋白是否通过蛋白酶体途径降解，利用蛋白酶体抑制剂MG132（20 μmol/L）处理 Senp1^-/- MEFs。WB 结果显示，当用 MG132 抑制蛋白酶体活性后，细胞中的Spop有所升高（图2C），表明在Senp1^-/- MEFs中Spop通过蛋白酶体途径降解。

2.3 Senp1不影响Spop的亚细胞定位

SUMO 化修饰除影响底物蛋白的周转速率外，还可以调控底物蛋白在细胞中的定位^[18]。研究表明，在 ccRCC 中 SPOP 错误定位在胞质中并大量累积，靶向与细胞增殖和凋亡有关的底物降解，导致肿瘤增生^[15]。为了研究去SUMO化酶Senp1是否参与调控 Spop 的亚细胞定位，分离了 WT 和 Senp1^-/- MEFs 的胞核蛋白和胞浆蛋白，并分别检测其中的 Spop蛋白水平。Western blot结果显示，在WT MEFs 中，Spop 蛋白主要定位在细胞核中，仅有少量蛋白存在于胞浆中；Senp1^-/- MEFs中Spop的分布情况与 WT MEFs 基本一致，表明 Senp1 的敲除并不影响Spop在细胞中的定位（图3A、B）。

为了进一步确认上述结果，利用免疫荧光技术分别检测了内源 Spop 和外源 Spop 在 WT 和 Senp1^-/- MEFs 中的定位情况。结果显示，在 WT 和 Senp1^-/- MEFs 中，无论内源还是外源 Spop 的亚细胞定位都与胞核高度重合，进一步表明Senp1并不影响Spop 在细胞核中的定位（图3C、D）。

2.4 Senp1通过参与Spop的去SUMO化修饰实现对 Spop的蛋白调控

初步确定Senp1能够上调Spop的蛋白水平后，为了研究该过程是否通过影响 Spop 的 SUMO 化修饰实现，首先对Spop的氨基酸序列进行了分析，在其MATH结构域中发现了2个潜在的SUMO化修饰位点，分别是第95位和第110位的赖氨酸（图4A）。随后构建了单 SUMO 化位点突变质粒 Flag ⁃Spop ⁃ K95R、Flag⁃Spop⁃K110R 和双 SUMO 化位点突变质粒 Flag ⁃ Spop ⁃ K95/110R，并分别在 WT 和 Senp1^-/- MEFs中进行过表达。结果显示，当在Senp1^-/- MEFs 中过表达野生型Spop时，其蛋白表达量较WT MEFs 减少，说明 Senp1 敲除后，Spop 的 SUMO 化修饰增加，影响Spop的蛋白水平。而当在Senp1^-/- MEFs中过表达Spop突变体时，即Spop不能进行SUMO化修饰时，其蛋白水平相比WT MEFs不再减少（图4B）。

2.5 SUMO 化位点突变 Spop 与 Sumo1 在细胞核中结合变弱

为了进一步研究Spop蛋白的SUMO化修饰，分别在WT和Senp1^-/- MEFs中共表达Sumo1和野生型 Spop或其SUMO修饰位点的突变体，利用PLA实验检测 Spop 与 Sumo1 蛋白之间的相互作用（图5A）。统计结果显示，当细胞中存在Senp1蛋白时，与过表达的Flag⁃Spop蛋白相比，过表达的Flag⁃Spop⁃K110R 蛋白和Flag⁃Spop⁃K95/110R蛋白与Sumo1蛋白的相互作用显著减少，表明 K110 位点的突变能够影响 Spop 与 Sumo1 的相互作用。进一步统计这些相互作用在胞质、胞核中的分布情况，结果显示，PLA阳性信号主要集中在胞核中，说明Spop蛋白主要在胞核中进行 SUMO 化修饰（图5B）。而当细胞中无 Senp1 蛋白时，野生型 Spop 与 Sumo1 的相互作用较 WT MEFs 有所下降，这可能是 Senp1 的缺失导致 Spop 蛋白稳定性下降，进而蛋白量减少所致；除此之外，和WT MEFs组一致，与过表达的Flag⁃Spop蛋白相比，过表达的 Flag ⁃Spop ⁃K110R 和 Flag ⁃Spop ⁃ K95/110R 蛋白与 Sumo1 蛋白相互作用降低。有趣的是，Flag ⁃ Spop ⁃ K95R 与 Sumo1 的相互作用在 Senp1^-/- MEFs 中显著下降，推测这可能是因为一般情况下 K95 位点在 Spop 与 Sumo1 蛋白结合中的作用较小，需要在SUMO修饰大量存在的情况下，相互作用的微小变化才能显现出来。同样分别统计了 PLA 信号在 Senp1^-/- MEFs 细胞中的分布情况，结果与WT MEFs组一致，SUMO化修饰后的Spop蛋白主要定位在胞核中（图5C）。

2.6 SPOP和SENP1在肾癌中呈正相关

鉴于 SPOP 在 ccRCC 中高表达且具有核心作用，为了研究其高表达是否与去SUMO化修饰相关，首先利用 GEO 数据库中 ccRCC 患者的基因表达数据，对 SPOP 和 SENP1 在 ccRCC 患者中的表达进行了相关分析。结果表明，ccRCC患者的SPOP表达和 SENP1表达呈明显的正相关关系（r=0.44，P <0.001，图6A）。同时，还检测了肾上皮细胞HK⁃2和ccRCC 细胞 Caki ⁃ 1、Caki ⁃ 2、A498、786 ⁃ O 中的 SENP1 和 SPOP表达情况，ccRCC 细胞中SPOP的蛋白水平高于正常肾上皮细胞。ccRCC 细胞中 SENP1 的表达也比正常细胞多，与已有报道一致^[16]，提示 ccRCC 中SPOP的表达可能受SENP1的调控（图6B）。

3 讨论

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系统中的常见恶性肿瘤之一。全世界每年约有 20.9 万人确诊RCC，约10.2万人死于该疾病^[19]。ccRCC 是 RCC 中最常见的病理亚型，约占 75%^[20]。大约 30%的 RCC 患者在确诊时已经发生了癌细胞的转移^[21]，未转移的RCC 患者在进行手术切除治疗后，约40%会复发，并且RCC对放疗、化疗均不敏感，患者的5年生存率<10%^[22]。因此探索RCC发病的分子机制，寻找RCC早期诊断和治疗的分子靶标迫在眉睫。

作为泛素连接酶E3家族成员Cul3结合底物蛋白的接头蛋白，SPOP 介导许多底物蛋白的泛素化修饰，导致蛋白降解，从而参与细胞的多种进程。在 ccRCC 中，SPOP 的异常高表达与低氧诱导因子 （hypoxia inducible factor，HIF）密切相关，肿瘤内部的低氧微环境会活化HIF，SPOP作为HIF的下游靶基因被启动转录，SPOP错误定位在胞质中并大量累积，靶向与细胞增殖和凋亡有关的底物降解，最终导致肿瘤增生^[15]。

蛋白的翻译后修饰对于蛋白行使功能具有重要作用，SUMO化修饰作为蛋白翻译后修饰的一种已被证实可以调控蛋白的活化、功能和亚细胞定位。近年来人们发现，参与SUMO化修饰的酶在肿瘤中存在异常表达，如在 SPOP 发生突变的前列腺癌患者中，去 SUMO 化酶 SENP7 呈现出高表达。 SENP7 通过减少异染色质蛋白 1α（heterochromatin protein 1α，HP1α）的SUMO化修饰和沉默与HP1α相关的基因来延缓细胞衰老。抑癌因子 SPOP 突变后，失去诱导 SENP7 降解的能力，细胞过度增殖最终导致肿瘤发生^[23]。

以上研究表明SPOP的SUMO化修饰过程可能在ccRCC中具有重要作用，但作为调控SUMO化修饰的关键分子之一，SENP1 与 SPOP 之间的关系还不清楚。本研究发现，MEFs中去SUMO化酶Senp1 参与 Spop 的表达调控，Senp1 敲除后，Spop 蛋白的稳定性下降并通过蛋白酶体途径降解，这一现象可能与 Senp1 敲除，改变 Spop 的 SUMO 化修饰状态有关。除此之外，还发现敲除 Senp1 后，Spop 在 MEFs 细胞核中的定位并没有发生改变，说明Senp1可能并不参与调控 Spop 的亚细胞定位。另外，生物信息学分析和 Western blot 结果也表明，ccRCC 患者的 SPOP 表达和 SENP1 表达呈明显的正相关关系，提示 SPOP 的表达在一定程度上受 SENP1 的调控。综上，SENP1 可能成为 ccRCC 新的潜在治疗靶点。

参考文献