-
甲状腺癌是内分泌系统最常见恶性肿瘤之一[1]，近20年全球绝大多数国家及地区的甲状腺癌发病率均呈现出暴发式增长，已跃升为恶性肿瘤第8位、女性第4位高发的肿瘤[2-3]。根据2022年国家癌症中心发布的报告，我国甲状腺癌发病率从1990年的 1.40/10 万上升至 2016 年的 14.65/10 万，增长了近 10 倍，其病死率也呈缓慢上升趋势[4]。人甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌最常见的亚型，约占所有甲状腺癌的90%[5]。PTC 生长较缓慢，总体预后较好，但30%~80%的PTC患者在确诊时即存在颈部淋巴结转移[6]。PTC复发率为 10%~35%，其中80%的患者在术后10年内复发。各种异常改变的基因和异常激活的通路相互影响，构成复杂的网络共同影响甲状腺癌的发生发展[7]。因此，进一步探究与其发生发展相关的功能基因，寻找新的潜在诊断和治疗靶点有重要的临床意义。
-
蛋白质翻译后修饰是调控蛋白功能的关键步骤，包括泛素化、过硫化、甲基化、乙酰化和脂质化等[8]。泛素化通过泛素⁃蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome，UPS）在细胞增殖、凋亡、周期阻滞、DNA 复制及修复等多个生物过程中发挥重要作用[9-10]。泛素级联反应分为三步骤：泛素激活酶E1在ATP供能下活化泛素分子，活化的泛素分子传递至泛素结合酶E2的半胱氨酸巯基，最终由泛素连接酶E3特异性识别并连接到靶蛋白上[11]。其中，泛素结合酶 E2是底物识别和泛素级联反应的关键决定因素[12]。
-
泛素结合酶E2T（ubiquitin⁃binding enzyme E2T， UBE2T）属于泛素结合酶E2家族，在泛素级联反应的第二步发挥作用。越来越多的证据表明[13]， UBE2T在多种癌症中高度表达，如宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食管癌、肺癌、胰腺癌等[14-16]，并通过多条途径促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭，这提示靶向 UBE2T 可能是一种有前景的肿瘤治疗方法，然而， UBE2T 在甲状腺癌中的表达及其生物学分子机制仍不清楚。本研究探讨了 UBE2T 在 PTC 中的表达及其对患者预后的影响，以及UBE2T在PTC细胞中的功能及其可能的调控机制，为PTC的治疗提供新的研究方向。
-
1 材料和方法
-
1.1 材料
-
本研究所用的 6 对 PTC 组织及配对的癌旁正常组织样本均来自2022年1月—2023年12月在南京医科大学第一附属医院因 PTC 而手术的患者。本研究经医院伦理委员会批准（伦理号：2023⁃SR⁃ 425），所有参与者均签署书面知情同意书。正常甲状腺细胞系 Nthyori3⁃1 和 PTC 细胞系 TPC ⁃1、 KTC⁃1、B⁃CPAP、IHH4由本实验室保存。
-
RPMI⁃1640 培养基、胎牛血清（Gibco 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（K1018，ApexBio 公司，美国）； Lipo8000（C0533，杭州碧云天公司）；UBE2T单克隆抗体（MA5⁃25226，上海赛默飞公司）；STAT3 单克隆抗体（4904T）、磷酸化 STAT3 抗体（9134T）（Cell Signaling Technology 公司，美国）；GAPDH（60004⁃1⁃ Ig，Proteintech公司，美国）；羊抗兔二抗（A0208）、羊抗鼠二抗（A0216）（杭州碧云天公司），STAT3 激活剂 Colivelin（HY ⁃ P1 061A，MCE 公司，美国）；sh ⁃ UBE2T及对照sh⁃Vehicle质粒由上海吉凯基因公司设计合成。
-
1.2 方法
-
1.2.1 细胞培养
-
细胞均使用含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI⁃1640 完全培养基，放入 5%CO2、37℃ 恒温培养箱中培养，2~3 d换液，使细胞维持在对数生长期。
-
1.2.2 质粒转染
-
收集处于对数生长期的细胞，使细胞浓度达到 6×104 个/mL，按 2 mL/孔将细胞铺于 6 孔板中，待次日细胞密度达到80%~90%时使用 Lipo8000 按照说明书进行质粒转染。
-
1.2.3 细胞克隆形成实验
-
将细胞按照2×105 个/孔数铺于6孔板中，贴壁后分别转染质粒。48 h后收集对数生长期细胞，使用细胞计数板计数后，每孔接种约400个细胞。放入培养箱中培养14 d，视情况换液，14 d后用3%多聚甲醛固定，结晶紫染色，拍照计数。
-
1.2.4 CCK⁃8
-
将细胞按照每孔 100 μL、2×103 个细胞铺于 96 孔板中，5%CO2、37℃恒温培养箱中培养24 h后，每孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液，培养箱孵育 1.5 h，测定 450 nm吸光度。
-
1.2.5 Western blot
-
提取 PTC 组织或细胞的总蛋白，用 10% SDS ⁃ PAGE 胶进行蛋白分离，并转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉溶液封闭1.5 h，加入相应抗体4℃孵育过夜。第 2 天使用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 min。室温孵育二抗2 h，TBST清洗膜3次，每次10 min，最后曝光。
-
1.2.6 Transwell实验
-
每孔2×105 个细胞铺于6孔板中，贴壁后分别转染质粒。48 h后收集对数生长期细胞，使用细胞计数板计数后，无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度为 1×105 个/mL，混匀。下室加入500 μL 全培养基，上室加入200 μL细胞悬液（侵袭实验需在Transwell 上方小室中加基质胶），放入37℃细胞培养箱，TPC⁃1细胞培养24 h、KTC⁃1 细胞培养 18 h。取出小室，PBS 清洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，0.1% 结晶紫染色 20 min，去除未与细胞结合的结晶紫及小室上侧未迁移的细胞，然后在显微镜下观察计数。
-
1.2.7 划痕实验
-
在6孔板的底部平均划3条横线，随后按照2× 105 个/孔细胞铺于6孔板中，贴壁后分别转染质粒。 48 h 后用 20 μL 的枪头在 6 孔板中划 2 条竖线。用 PBS 洗去漂浮的细胞，观察12~48 h，记录划痕愈合情况。
-
1.2.8 生物信息学分析
-
从 UCSC 癌症浏览器（https：//xenabrowser.net/ datapages/）获取 TCGA⁃THCA 数据集的基因表达数据。使用 R 软件（版本 4.2.1）进行配对样本 t 检验。通过 R 软件包 survival 中的 survfit 函数分析两组无疾病间隔（disease⁃free interval，DFI）的差异，并使用 Logrank 检验评估不同组样本之间 DFI 差异的显著性。使用非配对的Student’s t检验进行淋巴结无转移（N0）与淋巴结转移（N1）组间的差异显著性分析。使用基因集富集分析（gene set enrichment anal⁃ ysis，GSEA）软件（3.0版本，http：//software.broadinsti⁃ tute.org/gsea/index.jsp）按照 UBE2T 的表达水平高低排序，前50%为高表达组，后50%为低表达组，以评估相关途径和分子机制。
-
1.3 统计学方法
-
实验数据通过Graphpad Prism 9.0 统计软件进行分析并制图。两组间的比较使用 Student’s t 检验， ANOVA单因素方差分析用于多组间的比较。每组实验均重复3次，P <0.05为差异有统计学意义。
-
2 结果
-
2.1 UBE2T在PTC组织和细胞系中表达水平升高
-
在对TCGA数据库中PTC组织及其相应癌旁正常组织的 RNAseq 数据进行差异分析，生物信息学分析结果表明相比癌旁正常组织，PTC中UBE2T的表达量显著升高（图1A，P <0.001）。通过 Western blot 检测发现，与癌旁正常组织及甲状腺正常细胞相比，在PTC组织（图1B）和PTC细胞株（图1C）中， UBE2T蛋白表达水平均显著升高（P <0.01）。
-
2.2 UBE2T表达水平升高与PTC 预后不良及淋巴结转移相关
-
利用 TCGA⁃THCA 数据库，对 UBE2T 表达与患者临床病理特征进行深入分析。结果表明，UBE2T 高表达与患者 DFI 缩短显著相关，高表达组的 DFI 明显更短[图1D，HR=3.43，95%CI：1.43~8.21，P <0.05]。此外，还观察到淋巴结转移组（N1）的 UBE2T表达水平比淋巴结无转移组（N0）更高，差异有统计学意义（图1E，P <0.01）。
-
2.3 敲减UBE2T抑制PTC细胞增殖、迁移、侵袭
-
采用2种PTC细胞TPC⁃1和KTC⁃1，转染质粒进行UBE2T敲减，Western blot验证敲减效果，结果显示与对照组相比，UBE2T的表达显著降低，差异均有统计学意义（图2A）。
-
利用CCK⁃8法检测UBE2T敲减后对细胞增殖的影响，结果表明，敲减 UBE2T 能显著抑制 TPC⁃1 和 KTC⁃1的增殖活力（图2B，P <0.001）。同时，验证了敲减 UBE2T 能显著抑制 PTC 细胞的集落形成能力 （图2C，P <0.01）。
-
划痕实验进一步探究 UBE2T 对 PTC 细胞迁移和侵袭的影响。结果显示，UBE2T敲减后划痕愈合速度较为缓慢，提示UBE2T敲减可抑制PTC细胞的迁移（P <0.001，图3A；P <0.01，图3B）。Transwell 实验验证，发现UBE2T敲减后，TPC⁃1和 KTC⁃1细胞的迁移和侵袭数目明显减少（图3C、D，P <0.01），进一步说明 UBE2T 敲减可以抑制 PTC 细胞的迁移和侵袭。
-
2.4 UBE2T参与JAK⁃STAT信号通路
-
为了进一步探究 UBE2T 促进PTC细胞增殖迁移侵袭的机制，根据TCGA⁃THCA 样本中UBE2T的表达水平将样本分为UBE2T高表达组和UBE2T低表达组，并进行了 GSEA，结果显示 UBE2T 参与了 JAK ⁃STAT 信号通路（图4A）。接着，在 TPC ⁃1 和 KTC⁃1 细胞中敲减 UBE2T 后，检测了STAT3的磷酸化水平。Western blot 结果显示，相比对照组，敲减 UBE2T 后 STAT3 磷酸化水平显著下调（图4B，P <0.001），提示 UBE2T 可能通过调控 JAK⁃STAT 信号通路促进PTC细胞的增殖、迁移和侵袭。
-
2.5 UBE2T通过激活JAK⁃STAT信号通路促进PTC 细胞增殖
-
进一步使用 STAT3 激活剂 Colivelin 来探究 STAT3 在 UBE2T 介导的 PTC 细胞功能变化中的关键作用。CCK⁃8、平板克隆实验的结果显示Colivelin 逆转了敲减UBE2T引起的细胞增殖活力的降低（图4C，P <0.001，P <0.01）），以及对集落形成能力的抑制（图4D，P <0.05）。然而，对敲减UBE2T细胞TPC⁃1 和 KTC⁃1 的迁移和侵袭能力，Colivelin 并未表现出明显作用（图4E~H，P >0.05）。综上所述，本研究支持UBE2T通过激活JAK⁃STAT信号通路促进PTC增殖的假设。
-
图1 UBE2T在PTC中的表达及其与临床特征的关联
-
Figure1 The expression of UBE2T in PTC samples and its association with clinical features
-
图2 敲减UBE2T抑制PTC细胞增殖
-
Figure2 The inhibition of PTC cell proliferation after UBE2T knockdown
-
图3 敲减UBE2T抑制PTC细胞迁移、侵袭
-
Figure3 The inhibition of PTC cell invasion and migration after UBE2T knockdown
-
3 讨论
-
近 10 年来，甲状腺癌的发病率呈迅速增长趋势。尽管甲状腺癌总体预后较好，其复发率仍可为 10%~35%，其中80%的患者在术后10年内复发。因此，探索肿瘤复发转移的潜在分子机制对发现新的治疗靶点并改善甲状腺癌患者的预后具有重要意义。
-
本研究重点探讨了 UBE2T 在 PTC 中的作用。通过生物信息学分析，发现PTC组织中UBE2T的高表达与淋巴结转移相关，并与患者的DFI呈负相关，提示 UBE2T 可能参与了 PTC 的发生和发展。通过 Western blot 验证，与癌旁正常组织相比，PTC 组织中 UBE2T 蛋白的表达水平明显升高。敲减 UBE2T 可以抑制PTC细胞TPC⁃1和KTC⁃1的增殖、迁移和侵袭。
-
为进一步揭示 UBE2T 改变 PTC 细胞生物学功能的具体机制，进行了GSEA，结果提示UBE2T参与 JAK⁃STAT信号通路。Western blot发现敲减 PTC细胞UBE2T 后，STAT3的磷酸化水平下调。
-
JAK⁃STAT 信号转导通路在动物中高度保守，能够高效地将胞外信号从跨膜受体传递到细胞核，进而在细胞分化、代谢、生存、稳态和免疫反应中发挥调节作用[17]。细胞因子与受体结合后，JAK被激活并磷酸化，从而创建对接位点，招募细胞质的 STAT结合。活化的磷酸化STAT能够通过分子间相互作用形成同源或异源二聚化，然后转位到细胞核，结合DNA调控元件，诱导基因转录。已有研究表明，JAK⁃STAT 信号的异常激活已在多种免疫介导的疾病和肿瘤中被发现，包括黑色素瘤、头颈部恶性肿瘤、肺癌、胰腺癌和前列腺癌等[18-21]。
-
图4 UBE2T通过激活JAK⁃STAT信号通路促进PTC细胞增殖
-
Figure4 The promotion of PTC cell proliferation by UBE2T through activation of the JAK ⁃ STAT signaling pathway
-
为了进一步探讨 UBE2T 对甲状腺细胞癌变中 STAT3 的关键作用，使用 STAT3 激活剂 Colivelin 处理敲减 UBE2T 后的 PTC 细胞。CCK⁃8 和平板克隆实验观察到Colivelin可以逆转敲减UBE2T对PTC 细胞增殖活力和集落形成能力的抑制作用。然而， Colivelin对敲减UBE2T细胞的迁移和侵袭能力无明显作用。由此，证实了 UBE2T 通过调控 JAK⁃STAT 信号通路促进PTC细胞增殖，但UBE2T 促进PTC细胞迁移和侵袭的具体机制还需要进一步深入研究。
-
综上所述，本研究发现敲减UBE2T能抑制PTC 细胞TPC⁃1和KTC⁃1的增殖、迁移和侵袭，UBE2T通过调控 JAK⁃STAT 信号通路促进 PTC 细胞增殖，提示UBE2T有可能成为治疗PTC的潜在靶点。
-
参考文献
-
[1] CHEN D W，HAYMART M R.Disparities research in thy⁃ roid cancer：challenges and strategies for improvement［J］.Thyroid，2020，30（9）：1231-1235
-
[2] CHEN W Q，ZHENG R S，BAADE P D，et al.Cancer sta⁃ tistics in China，2015［J］.CA A Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132
-
[3] SUN D Q，CAO M M，LI H，et al.Cancer burden and trends in China：a review and comparison with Japan and South Korea［J］.Clin J Cancer Res，2020，32（2）：129-139
-
[4] ZHENG R S，ZHANG S W，ZENG H M，et al.Cancer in⁃ cidence and mortality in China，2016［J］.J Natl Cancer Cent，2022，2（1）：1-9
-
[5] 中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局.甲状腺癌诊疗指南（2022年版）［J］.中国实用外科杂志，2022，42（12）：1343-1357
-
[6] 徐震纲，刘绍严.分化型甲状腺癌颈侧区淋巴结清扫专家共识（2017版）［J］.中国实用外科杂志，2017，37（9）：985-991
-
[7] 童厚超，斯岩，张浩，等.MiR⁃590⁃3p对甲状腺乳头状癌的抑制作用研究［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2019，39（6）：873-879
-
[8] LIN H N，CAROLL K S.Introduction：posttranslational protein modification［J］.Chem Rev，2018，118（3）：887-888
-
[9] COCKRAM P E，KIST M，PRAKASH S，et al.Ubiquitina⁃ tion in the regulation of inflammatory cell death and can⁃ cer［J］.Cell Death Differ，2021，28（2）：591-605
-
[10] ZHOU X F，SUN S C.Targeting ubiquitin signaling for cancer immunotherapy［J］.Signal Transduct Target Ther，2021，6（1）：16
-
[11] CHANG S C，DING J L.Ubiquitination and SUMOylation in the chronic inflammatory tumor microenvironment［J］.Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2018，1870（2）：165-175
-
[12] STEWART M D，RITTERHOFF T，KLEVIT R E，et al.E2 enzymes：more than just middle men［J］.Cell Res，2016，26（4）：423-440
-
[13] ZOU R Y，XU H Y，LI F F，et al.Increased expression of UBE2T predicting poor survival of epithelial ovarian can⁃ cer：based on comprehensive analysis of UBE2s，clinical samples，and the GEO database［J］.DNA Cell Biol，2021，40（1）：36-60
-
[14] 郑志刚，华清泉，陈锋.UBE2T基因表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响［J］.实用癌症杂志，2019，34（10）：1579-1582
-
[15] WU M Q，LI X L，HUANG W W，et al.Ubiquitin⁃conju⁃ gating enzyme E2T（UBE2T）promotes colorectal cancer progression by facilitating ubiquitination and degradation of p53［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2021，45（2）：101493
-
[16] 吴新军，陈炳合，李帅超，等.UBE2T调控三阴性乳腺癌增殖、迁移和侵袭等生物学行为的实验研究［J］.临床肿瘤学杂志，2020，25（10）：870-875
-
[17] O’SHEA J J，SCHWARTZ D M，VILLARINO A V，et al.The JAK ⁃ STAT pathway：impact on human disease and therapeutic intervention［J］.Annu Rev Med，2015，66：311-328
-
[18] LEE S O，LOU W，QURESHI K M，et al.RNA interfer⁃ ence targeting Stat3 inhibits growth and induces apoptosis of human prostate cancer cells［J］.Prostate，2004，60（4）：303-309
-
[19] MIRTTI T，LEIBY B E，ABDULGHANI J，et al.Nuclear Stat5a/b predicts early recurrence and prostate cancer⁃spe⁃ cific death in patients treated by radical prostatectomy［J］.Hum Pathol，2013，44（3）：310-319
-
[20] OWEN K L，BROCKWELL N K，PARKER B S.JAK ⁃ STAT signaling：a double ⁃ edged sword of immune regula⁃ tion and cancer progression［J］.Cancers，2019，11（12）：2002
-
[21] SPIOTTO M T，CHUNG T D.STAT3 mediates IL ⁃6⁃in⁃ duced neuroendocrine differentiation in prostate cancer cells［J］.Prostate，2000，42（3）：186-195
-
摘要
目的：探讨泛素结合酶E2T（ubiquitin-binding enzyme E2T，UBE2T）在人甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcino- ma，PTC）中的表达情况及其对患者预后的影响，同时探讨UBE2T在PTC细胞中的功能，旨在识别其可能的调控机制，为未来 PTC的靶向治疗策略提供理论依据。方法：采用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，系统分析UBE2T在 PTC中的表达及其与患者预后的关系。通过Western blot技术检测UBE2T在甲状腺肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达。在 PTC细胞系（TPC-1、KTC-1）中进行UBE2T敲减实验，借助CCK-8、平板克隆、划痕和Transwell实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力，并通过Western blot检测相关蛋白水平的变化。结果：TCGA数据库生物信息学分析表明，PTC组织中UBE2T显著升高，且其表达与患者无疾病间隔、淋巴结转移相关（P <0.01）。UBE2T敲减导致TPC-1和KTC-1细胞增殖活力显著下降，同时抑制细胞迁移和侵袭，诱导STAT磷酸化下调。敲减UBE2T的细胞系加入STAT激活剂后，细胞增殖显著提高。结论：敲减UBE2T 能抑制PTC细胞系TPC-1和KTC-1的增殖、迁移和侵袭，UBE2T通过调控JAK-STAT信号通路促进细胞增殖，提示UBE2T有可能成为PTC的治疗靶点。
Abstract
Objective：This study aims to investigate the expression of ubiquitin-binding enzyme E2T（UBE2T）in papillary thyroid carcinoma（PTC）tissues and its effect on patient prognoses. Additionally，the effects of UBE2T on PTC cell function were explored， aiming to identify potential regulatory pathways and provide theoretical foundations for future targeted therapies. Methods：By using The Cancer Genome Atlas（TCGA）database，the UBE2T expression in PTC tissues and its association with patient prognosis were systematically analyzed. The UBE2T expression in tumor tissues and adjacent normal tissues of thyroid were assessed by Western blot. UBE2T knockdown experiments were performed in PTC cell lines（TPC - 1 and KTC - 1）. Cell proliferation，migration，and invasion abilities were evaluated by using CCK -8 and colony formation，wound healing and Transwell assays，respectively，with Western blot measuring protein levels. Results：The TCGA analysis revealed significantly elevated UBE2T expression levels in PTC tissues， correlated with disease -free interval and lymph node metastasis（P < 0.01）. The UBE2T knockdown led to decreased proliferation， migration，and invasion ability in TPC-1 and KTC-1 cells，accompanied by the reduced STAT phosphorylation levels. The proliferation of UBE2T - knockdown cells significantly increased when treated with a STAT activator. Conclusion：The UBE2T knockdown suppresses the proliferation，migration，and invasion of PTC cell lines，suggesting UBE2T as a potential therapeutic target for PTC by modulating the JAK-STAT signaling pathway.