慢加急性肝衰竭（acute⁃on⁃chronic liver failure， ACLF）是以慢性肝病为基础、急性肝内外损伤为诱因、伴有多器官衰竭和早期高病死率的一组临床综合征^[1]。我国是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染高负担地区，HBV相关ACLF（HBV⁃ACLF）是临床最常见的肝衰竭类型。HBV⁃ACLF患者28 d病死率高达40%，目前普遍认为，T淋巴细胞等免疫细胞的功能紊乱及伴随的细菌（真菌）感染，是造成HBV⁃ACLF 进展和患者早期高病死率的重要原因^[1，4-5]。除肝移植外，尚缺乏有效降低HBV⁃ACLF患者病死率的干预措施^[2-3]。因此，有必要深入研究HBV⁃ACLF患者细胞免疫紊乱的发生机制和潜在干预靶点。

髓源性抑制细胞（myeloid ⁃ derived suppressor cell，MDSC）是一群病理激活、表型异常的髓系来源细胞，可通过多种途径抑制T淋巴细胞等免疫细胞的增殖、活化和迁移。根据来源及形态特征，MDSC 分为单核型MDSC（monocytic MDSC，M⁃MDSC）和多核型 MDSC（polymorphonuclear MDSC，PMN⁃MDSC） 两大亚群，其中PMN⁃MDSC主要通过分泌过量活性氧自由基、精氨酸酶⁃1和前列腺素2发挥免疫抑制功能^[6-7]。外周血PMN⁃MDSC表达水平在败血症、活动性结核病等细菌感染病患者中显著升高，并与疾病严重程度、患者预后密切相关^[8-10]，但关于HBV⁃ACLF患者中PMN⁃MDSC表达及意义的报道不多。本研究探讨HBV⁃ACLF患者外周血PMN⁃MDSC表达水平及其与继发感染风险、疾病严重度及患者短期预后的关联，为HBV⁃ACLF早期干预策略的优化提供思路。

1 对象和方法

1.1 对象

纳入2022年9月—2023年8月皖南医学院弋矶山医院收治的 HBV ⁃ACLF 患者 40 例（HBV ⁃ACLF组），慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者 20例（CHB组），同时选取本院健康体检者10例作为健康对照（healthy control，HC）组。HBV⁃ACLF的纳入标准参照中华医学会《肝衰竭诊治指南（2018 版）》^[11]；CHB 的纳入标准参照中华医学会《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》^[12]。排除标准：①年龄<18岁或>80岁；②妊娠期女性；③合并其他病因所致慢性肝病，或重叠感染其他肝炎病毒；④合并肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等恶性肿瘤或严重肝外器质性疾病；⑤使用免疫抑制剂治疗肝外器质性疾病；⑥住院时间<5 d导致重要临床资料缺失；⑦28 d访视期内失访。比较HBV⁃ACLF组和 CHB 组及 HC 组基线时（入院当日）外周血MDSC 频率的差异。分析HBV⁃ACLF外周血PMN⁃MDSC频率与炎症指标、预后评分的相关性。分别根据基线时合并感染、住院期间继发感染及访视期第28天预后情况对HBV⁃ACLF患者进行分组，比较各组外周血 PMN⁃MDSC频率的差异。本研究符合2013年修订的 《赫尔辛基宣言》的要求，研究方案经皖南医学院伦理委员会审核批准[（2023）伦审第（164）号]，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集

采集所有研究对象的住院资料（或健康体检资料），包括：①性别和年龄；②肝硬化病史；③白细胞计数（white blood cell count，WBC）、中性粒细胞计数 （neutrophil count，NEUT）、淋巴细胞计数（lympho⁃ cyte count，LYMT）、中性粒细胞淋巴细胞比值（neu⁃ trophil⁃to⁃lymphocyte ratio，NLR）、降钙素原（procalci⁃ tonin，PCT）、国际标准化比值（international normal⁃ ized ratio，INR）、总胆红素（total bilirubin，TBil）、氨酸氨基丙转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、血肌酐（creatinine，CRE）、乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙肝 e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、HBV脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid，DNA）等辅助检查结果；④腹水评分（1分：无腹水；2分：少量腹水；3分：中~大量腹水）和肝性脑病评分（1分：无肝性脑病；2分：1~2级肝性脑病；3分：3~4级肝性脑病）。根据基线数据，计算HBV⁃ACLF患者的Child⁃Turcotte⁃Pugh（CTP）评分和终末期肝病模型（model for end⁃stage liver disease， MELD）评分，具体公式参照相关文献^[13]。

1.2.2 流式细胞术检测外周血MDSC频率

基线时，使用EDTA 抗凝管采集外周血静脉血 5 mL，采用人淋巴细胞分离液（Axis⁃shield 公司，挪威）和密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC），1 mL 磷酸缓冲盐溶液（phosphoric acid buffer salt solution， PBS）重悬细胞，0.4%台酚蓝计数并调整细胞浓度为 2×10⁶ 个/mL。采用流式细胞术检测 PBMC 中 PMN⁃ MDSC频率，主要步骤包括：①取100 μL PBMC悬液 （2×10⁵ 个细胞）加入5 mL流式管中，分别加入APC⁃ HLA ⁃DR、FITC ⁃ CD11b、Alexa Fluor700 ⁃ CD33、PE ⁃ Cy7⁃CD14和PE⁃CD15流式单抗（Biolegend 公司，美国）各2 μL，避光孵育20 min；②加入2 mL PBS吹打混匀细胞，离心、弃上清，并重复该步骤1次；③加入流式鞘液 200 μL 重悬细胞，使用贝克曼公司 Cyto⁃ flex S 流式细胞仪检测外周血MDSC 频率（PBMC 中 MDSC 占比），PMN ⁃MDSC 标记策略为 HLA ⁃DR^-/low CD11b⁺ CD33⁺ CD14^- CD15⁺ 细胞，M⁃MDSC标记策略为HLA⁃DR^-/lowCD11b⁺ CD33⁺ CD14⁺ CD15^- 细胞。

1.2.3 细菌真菌感染诊断标准及患者短期预后评估

临床医师综合患者临床表现、感染标志物、影像学检查、微生物学培养、宏基因二代测序及经验性抗感染疗效，对合并/继发细菌真菌感染进行诊断，各部位感染的具体诊断标准参照《终末期肝病合并感染诊治专家共识（2021年版）》^[14]。访视期第 28天评估HBV⁃ACLF患者的预后情况，患者短期预后差定义为：28 d访视期内死亡，或放弃治疗自动出院，或接受肝移植手术。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.5对数据进行统计分析。计数资料以例数（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ² 检验。正态分布计量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析。非正态分布计量资料以中位数（四分位数）[M（P₂₅，P₇₅）]表示，两组比较采用 Mann⁃Whitney U 检验，多组比较采用 Kruskal⁃Wallis检验。变量间相关性分析采用Spear⁃ man检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象基线特征比较

HBV⁃ACLF 组性别构成、年龄、WBC、NEUT 和 CRE 相比 HC 和 CHB 组，差异无统计学意义（P 均>0.05）。HBV⁃ACLF 组NLR、INR 和TBil 均显著高于 HC 和 CHB 组；LYMT 和 ALB 均低于 HC 和 HBV 组，差异有统计学意义（P 均<0.001）。与 CHB 组比较， HBV⁃ACLF组肝硬化患者比例、合并细菌感染患者比例和 PCT 均升高，差异有统计学意义（P 均<0.01）；但2组HBsAg、HBeAg、HBV DNA和ALT水平比较，差异无统计学意义（P均>0.05，表1）。

2.2 3组外周血MDSC频率的比较

HBV⁃ACLF 组、CHB 组、HC 组外周血 M⁃MDSC 频率分别为 2.20%（1.41%，3.01%）、1.41%（0.90%， 1.92%）和 0.57%（0.43%，0.67%），整体差异有统计学意义（H=29.672，P <0.001）；HBV⁃ACLF组外周血 M⁃MDSC 频率高于 CHB 组和 HC 组，差异有统计学意义（P均<0.05）；CHB组外周血M⁃MDSC频率高于 HC组，差异有统计学意义（P=0.008，图1A）。HBV⁃ ACLF 组、CHB 组、HC 组外周血 PMN⁃MDSC 频率分别为 3.77%（1.35%，5.11%）、0.67%（0.55%，0.82%） 和 0.50%（0.40%，0.59%），整体差异有统计学意义 （H=44.401，P <0.001）；HBV⁃ACLF组外周血M⁃MDSC 频率高于CHB组和HC组，差异有统计学意义（P均 <0.001）；CHB组和HC组外周血PMN⁃MDSC频率比较，差异无统计学意义（P=0.421，图1B）。

2.3 HBV⁃ACLF 外周血 PMN⁃MDSC 频率与炎症指标、疾病严重度的相关性分析

Spearman 检验显示，HBV ⁃ACLF 患者外周血 PMN⁃MDSC 频率与炎症指标 WBC、NLR、PCT 表达水平均呈正相关（r=0.347、0.799、0.506，P 均 <0.05），与 LYMT 呈负相关（r=-0.428，P <0.01，图2A~D）。HBV⁃ACLF 外周血 PMN⁃MDSC 频率与疾病严重度指标 INR、TBil、CTP 评分、MELD 评分均呈正相关（r=0.450、0.462、0.470、0.481，P 均<0.01，图2E~H）。

2.4 HBV⁃ACLF 外周血 PMN⁃MDSC 频率与患者合并或继发感染、短期预后的关系

40例HBV⁃ACLF患者中，入院时合并感染共计18 例[细菌感染 16 例（88.9%），细菌真菌混合感染 2 例（11.1%）]，其外周血PMN⁃MDSC频率高于对照组[5.22%（4.08%，7.44%） vs.1.50%（1.18%， 3.77%）]，差异有统计学意义（Z=-1.268，P <0.001，图3A）。住院期间继发感染共计 17 例[细菌感染 8 例（47.1%），细菌真菌混合感染9例（52.9%），二次感染 12 例（70.6%）]，其外周血 PMN⁃MDSC 频率高于对照组[5.02%（3.97%，7.47%）vs.1.74%（1.24%， 4.15%）]，差异有统计学意义（Z=-3.737，P <0.001，图3B）。全部 HBV⁃ACLF 患者中，28 d 预后差患者共计21例（死亡14例，自动出院5例，接受肝移植手术 2 例），其外周血 PMN ⁃MDSC 频率高于对照组 [5.02%（4.42%，7.32%）vs.1.33%（1.09%，2.42%）]，差异有统计学意义（Z=-5.349，P <0.001，图3C）。

Compared with the HBV⁃ACLF group，^* P <0.05.

3 讨论

M⁃MDSC和PMN⁃MDSC在表型分子、诱导因素、免疫抑制介质等特征上存在不同程度差异，MDSC 亚群构成取决于病原种类、机体免疫应答特征、疾病阶段等因素^[6-7]。HBV是一种嗜肝病毒，通过持续诱导适应性免疫应答和固有免疫应答，造成肝细胞损伤及伴随的肝脏炎症、纤维化乃至癌变^[11]。多项研究表明，M⁃MDSC 是CHB患者体内MDSC主要亚群，HBsAg和HBeAg是M⁃MDSC扩增的重要诱导因素；M⁃MDSC可通过分泌一氧化氮、精氨酸酶⁃1、白介素⁃10等，抑制HBV特异性CD4⁺ /CD8⁺ T淋巴细胞的增殖和活化，导致HBV持续感染与疾病进展^[15-17]。当 CHB 发展至终末期肝病阶段，患者体内免疫微环境更加复杂，MDSC 表达水平和亚群构成亦发生一定变化。Zeng 等^[18] 研究表明，HBV⁃ACLF 外周血 MDSC水平明显高于CHB，外周血MDSC频率与TBil、 INR、ALT 水平呈明显正相关，与 HBsAg、HBeAg、 HBV DNA水平无相关性。Nan等^[19] 研究表明，乙肝肝硬化所致 HCC 患者外周血和肝脏中 PMN⁃MDSC 水平明显高于非HCC患者。

本研究比较了3组研究对象两群MDSC表达水平差异，结果显示，HBV⁃ACLF外周血两群MDSC频率均高于CHB 组和HC 组，且HBV⁃ACLF 组外周血 PMN⁃MDSC 频率明显高于 CHB 组；CHB 组外周血M⁃MDSC频率明显高于HC组，但2组PMN⁃MDSC频率接近。在此基础上，本研究分析了HBV⁃ACLF 组外周血PMN⁃MDSC频率与炎症指标、合并细菌感染的关系，发现 HBV⁃ACLF组外周血PMN⁃MDSC频率与 WBC、NLR、PCT 呈正相关（与 NLR 的相关性最高），与 LYMT 呈负相关，且 LYMT 在 HBV ⁃ACLF、 CHB和HC中呈递减趋势；40例HBV⁃ACLF患者中，基线时合并细菌感染者 18 例（45.0%），其外周血 PMN⁃MDSC 频率明显高于对照组。结合相关文献，以上结果提示PMN⁃MDSC扩增于HBV⁃ACLF阶段而非CHB阶段，HBV⁃ACLF外周血PMN⁃MDSC富集加重了T淋巴细胞的增殖、活化障碍，细菌感染可能是 HBV⁃ACLF患者体内PMN⁃MDSC扩增的重要诱因。

目前普遍认为，细菌感染是 HBV⁃ACLF 发生、发展的重要肝外因素，通过诱发内毒素血症、炎性细胞因子风暴及伴随的全身炎症反应综合征，导致凝血系统等肝外器官功能衰竭^[20]。多项研究表明，与无细菌感染HBV⁃ACLF患者相比，合并细菌感染者病情进展更快，短期病死率更高^{[3，14，20]}。Darcy等^[8] 研究表明，败血症患者体内富集 PMN ⁃MDSC，外周血 PMN⁃MDSC 频率与疾病严重程度呈正相关。Ruan 等^[9] 研究表明，与M⁃MDSC相比，外周血PMN⁃MDSC 频率与败血症患者免疫耐受状态相关性更好，PMN⁃ MDSC持续高水平更有助于预测二次感染风险。本研究发现，HBV ⁃ACLF 外周血 PMN ⁃MDSC 频率与 INR、TBil、CTP 评分、MELD 评分均呈正相关；40 例 HBV⁃ACLF患者中，住院期间继发细菌感染者17例 （42.5%），其中二次感染占70.6%，继发细菌感染者外周血PMN⁃MDSC频率明显高于对照组患者；并且所有真菌感染均在细菌感染基础上发生，基线感染谱中真菌感染占比仅为11.1%，继发感染谱中真菌感染占比提升至52.9%，提示PMN⁃MDSC表达上调加重了HBV⁃ACLF患者体内免疫抑制微环境，导致二次感染与疾病进展。本研究进一步比较了不同预后HBV⁃ACLF患者外周血PMN⁃MDSC水平，发现 28 d 预后差的患者外周血 PMN⁃MDSC 频率明显高于预后好的患者，提示外周血PMN⁃MDSC频率可作为 HBV⁃ACLF 患者短期预后评估的免疫炎症指标之一。

本研究存在以下不足：①HBV⁃ACLF样本量偏少，可能造成一定的统计偏倚，也不利于计算外周血 PMN⁃MDSC 频率评估患者短期预后的临界值； ②尽管在细菌真菌感染诊断中严格遵从了相应规范、标准，但由于 HBV⁃ACLF 患者存在不同程度的细胞免疫功能障碍，加上腹腔积液、外周血等微生物培养的阳性率不高且耗时偏长，对合并或继发细菌真菌感染的判读可能不够准确。今后需通过增加样本量、应用新型病原学诊断方法（如靶向二代测序、细菌核酸检测）等进一步研究。

综上所述，本研究发现，HBV⁃ACLF患者外周血 PMN⁃MDSC 富集，其频率与继发感染风险、疾病严重度及患者短期预后密切相关。本研究有助于完善HBV⁃ACLF细胞免疫紊乱的形成机制，并为HBV⁃ ACLF干预措施的优化提供理论依据。

参考文献