肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在中国所有肿瘤病例中，HCC的发病率位列第4，但是死亡人数却高居第 3 位^[1]。HCC 生长速度快，患者早期常无特殊症状，治疗效果差，5年生存率低，已成为全球严重的健康负担^[2]。因此，从分子水平研究HCC的发病机理，寻找重要的作用分子，阐明HCC发生与发展的机制迫在眉睫。

肿瘤细胞的生长和转移过程中常伴随着细胞能量代谢重编程，其中有氧糖酵解是重要途径之一^[3-4]。苹果酸酶（malic enzyme，ME）是一类催化苹果酸氧化脱羧为丙酮酸和二氧化碳的氧化脱羧酶，能够调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的生成从而影响肿瘤细胞的糖酵解过程^[5-6]。ME3 是 ME 家族成员之一，在人体不同肿瘤中的表达和作用机制已被逐渐研究报道，如 ME3 在胰腺癌组织中高表达，且与患者的不良预后呈正相关，其可能通过激活TGF⁃β/Smad信号通路促进胰腺癌细胞上皮间质转化^[7]。此外，ME3 能促进脑神经胶质瘤增殖、迁移、侵袭和间质转换等恶性行为^[8]。然而，关于 ME3 对肝癌细胞的生物学功能及其分子调控机制尚不明确。本研究通过生物信息学分析 ME3 在 HCC组织中的表达及与HCC患者预后的关系。随后，采用CCK⁃8、平板克隆形成、Transwell 及侵袭实验、Western blot方法检测ME3对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

正常肝细胞系 LO2 以及 3 种 HCC 细胞系 HepG2、BEL⁃7402及SMMC⁃7721购于上海中国科学院细胞库。胎牛血清和DMEM培养基（Gibco公司，美国）；PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）；转染试剂 Lipo⁃fectamine2000（Invitrogen 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（上海翊圣公司）；兔抗人ME3、PI3K、p⁃AKT、 AKT抗体（Cell Signaling公司，美国）；鼠抗人β⁃tubulin 抗体（Bioworld公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析

分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）数据库中 HCC 患者肿瘤组织和癌旁正常组织的ME3表达量差异，并通过基因表达谱数据动态分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis， GEPIA）网站分析ME3表达量与HCC患者总体生存率的关系。根据GEPIA数据库中ME3表达中位数，将 HCC 患者分为高表达组和低表达组，进行预后研究。

1.2.2 细胞培养与转染

细胞培养于37℃、含有5% CO₂、95%湿度的培养箱内，用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养。干扰质粒 sh⁃ME3 及过表达质粒 Flag⁃ME3 均由本实验室构建，对照质粒分别为 sh ⁃EGFP 和 Vector。将正处在对数增长阶段的肝癌细胞种植在 6 孔板上，接种密度为 2×10⁵ 个/孔，培养 20 h 后根据 Lipo⁃fectamine2000 说明书进行细胞转染，转染 6 h 后，更换 DMEM 培养基，继续培养 48 h，收集细胞进行后续实验。

1.2.3 实时荧光定量 PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，RT⁃qPCR）

Trizol试剂使用指南步骤，实施使用Trizol试剂提取细胞RNA，随后将RNA反转录成cDNA。采用 RT⁃qPCR法，以β⁃actin为内参检测ME3的mRNA水平。ME3 上游引物序列：5′ ⁃ CTTGGTTTCGCTTT⁃ GCCTGG ⁃ 3′，下游引物序列：5′ ⁃ CAGGT⁃ GCTCCCAAAGGGTTA⁃3′；β⁃actin上游引物序列：5′⁃ AGATGTGATCAGCAAGCAG⁃3′，下游引物序列：5′⁃ GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA⁃3′。

1.2.4 蛋白免疫印迹实验（Western blot）

HCC细胞转染48 h后，收集细胞并裂解提取蛋白。100℃煮沸 10 min 后，12 000 r/min 离心 5 min 收取上清。10%的 SDS⁃PAGE 电泳分离蛋白质，并以300 mA的电流转到PVDF膜。5%的脱脂牛奶常温封闭1 h。一抗孵育4℃过夜，TBST洗膜3次，每次 10 min。二抗常温孵育1 h，TBST再次洗膜3次，每次10 min。采用ECL化学发光法曝光，检测目的条带。

1.2.5 CCK⁃8实验

将转染后生长 48 h 的 HCC 细胞用胰酶消化后重新接种至 96 孔板中，接种密度为 2×10³ 个/孔，分为对照组和实验组，每组设置5个复孔，另外设置无细胞的空白对照组作为参照。每天向96孔板中加入CCK⁃8试剂盒；第4天CCK⁃8试剂加入后，将孔板放入培养箱避光继续孵育1~2 h，随后酶标仪测量各孔在450 nm波长处的吸光度值，实验重复3次并绘制细胞增殖曲线。

1.2.6 平板克隆形成实验

HCC 细胞转染 48 h 后种植到 6 孔板上，每孔 500个细胞，并分为实验组和对照组。将6孔板置入恒温培养箱培养 10~15 d 后，观察细胞克隆，用 4% 多聚甲醛固定细胞后结晶紫染色，PBS清洗染液后常温干燥，拍照统计细胞克隆的数目。

1.2.7 细胞迁移和侵袭实验

将肝癌细胞转染24 h后消化，用不含胎牛血清的 DMEM 培养基重悬，细胞计数。将 Transwell 小室置于 24 孔板中，在小室上方加入 1×10⁶ 个细胞， 200 μL无血清培养基，小室下方加入500 μL含血清的 DMEM 新鲜培养基。1 d 后，取出 Transwell 细胞培养器，用棉签轻轻擦掉顶部小室表面细胞，然后使用4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液洗净后涂上结晶紫染色 30 min，PBS 溶液清洗后拍照并计数。侵袭实验中，将 Transwell 小室更换为含 BD 凝胶的小室，其他步骤与细胞迁移实验相同。

1.3 统计学方法

使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，所有数据用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间差异比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P <0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ME3与肝癌预后的相关性分析

TCGA 数据库分析显示 HCC 患者肿瘤组织中 ME3 的表达较癌旁正常组织显著上调（图1A， P <0.001）。通过 GEPIA 数据库分析 HCC 组织中 ME3 mRNA 表达量与 HCC 患者生存率的关系，结果显示与 ME3 mRNA 低表达患者相比，高表达患者预后相对较差，但差异无统计学意义（图1B， P >0.05）。

2.2 ME3在肝癌细胞株中的表达及质粒sh⁃ME3和 Flag⁃ME3的效果验证

对人正常肝细胞LO2以及HCC细胞系Bel⁃7402、 SMMC⁃7721、HepG2中ME3的mRNA和蛋白表达进行检测。结果表明，与 LO2 细胞相比，HCC 细胞系 Bel⁃7402、SMMC⁃7721、HepG2 中 ME3 表达较高 （图2A、B）。在相对高表达ME3的HepG2中转染干扰质粒 sh⁃ME3，MEG3 的 mRNA 和蛋白表达均显著降低（P <0.01），验证了干扰效率（图2C）。在相对低表达 ME3 的 SMMC⁃7721 中转染过表达质粒Flag⁃ME3，其过表达效果同样得到证实（图2D）。

2.3 干扰ME3的表达下调肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力

在HepG2中转染sh⁃ME3干扰质粒，CCK⁃8实验结果表明，敲低ME3的HepG2细胞增殖活性受到抑制（图3A），平板克隆实验表明敲低ME3的细胞克隆形成能力下降（图3B）。同时，Transwell和侵袭实验也表明下调 ME3 可以减弱肝癌细胞的迁移及侵袭能力（图3C）。这表明，敲低ME3的表达能够抑制肝癌细胞的增长、迁移和侵袭能力。

2.4 上调 ME3 的表达增强 HCC 细胞增殖、迁移与侵袭能力

在 SMMC⁃7721 中转染 Flag⁃ME3 过表达质粒， CCK⁃8 实验的数据显示 ME3 过表达的 SMMC⁃7721 细胞的增殖活性提高（图4A），平板克隆实验证明过表达ME3的细胞克隆形成能力增强（图4B）。与此同时，Transwell和侵袭实验表明上调ME3可以促进 HCC细胞的迁移及侵袭（图4C）。因此，过表达ME3 可以增强HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力。

2.5 ME3在HCC细胞中通过活化PI3K/AKT通路发挥促癌基因作用

为深入探究ME3增强HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力可能的分子机制，检测上调或下调 ME3 对 PI3K/AKT 通路的影响。结果表明，敲低 ME3 后，AKT 表达不变，PI3K、p⁃PI3K 和 p⁃AKT 的表达明显减弱。相反，过表达ME3后，AKT 表达不变，PI3K、 p⁃PI3K和p⁃AKT的表达明显增强（图5）。

3 讨论

HCC是全球最常见的恶性肿瘤类型之一，尤其在发展欠缺的国家，它是恶性肿瘤相关死亡的主要原因之一。HCC 发现一般较晚，进展快，被确诊时经常已发生转移，因此治疗效果差，其5年存活率仅为 3%~25%，对人类的健康构成了严重威胁^[9]。所以，迫切需要探究肝癌增殖和转移的潜在分子机制，这将有助于研发新的诊疗方案并延长肝癌患者的生存时间。

细胞能量代谢重编程是肿瘤发生发展的重要标志之一，大量研究表明有氧糖酵解的持续激活 （Warburg效应）与包括HCC在内的各种肿瘤的发生发展有关，而ME家族在此过程中重要发挥作用^[10-11]。已有研究表明，ME1和ME2在HCC中表达升高，能促进HCC细胞的生长，且其表达水平与患者的不良预后有关^[12-13]。作为ME家族中重要的一员，ME3已被发现在脑神经胶质瘤和胰腺癌等恶性肿瘤发生发展中发挥作用，然而其在HCC中的表达水平及其作用尚不清楚。为研究ME3在HCC中的作用，首先对TCGA数据库中肝癌患者ME3的表达水平进行分析，结果发现在HCC组织中ME3的水平明显高于癌旁正常组织，为进一步研究 ME3 对 HCC 细胞的功能，通过 RT⁃qPCR 和 Western blot 检测 ME3 在正常肝细胞和HCC细胞中的表达量，发现在HCC细胞中 ME3 的水平明显高于正常肝脏细胞。利用干扰质粒 sh⁃ME3 和过表达质粒 Flag⁃ME3 下调或者上调 HCC细胞中ME3的表达，通过CCK⁃8、克隆平板法、 Transwell、侵袭实验探索 ME3 对 HCC 细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响，结果发现抑制ME3表达可降低 HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而过表达 ME3可以增强HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

在大部分人类恶性肿瘤的产生和发展过程中，磷脂酞肌醇 3⁃激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）信号通路被视为经典信号传导方式之一^[14]。此通路在肿瘤细胞中的活性较高，能够参与肿瘤细胞的增长、死亡、侵袭以及转移等各种过程。PI3K是脂质激酶家族重要成员之一，被激活后可以合成磷脂酰肌醇第二信使，然后与下游的 AKT 结合相互作用，使 AKT 蛋白发生磷酸化^[15]。AKT 的磷酸化有助于触发或抑制信号通道下游的目标蛋白，例如Bcl⁃2蛋白家族，Cyclin蛋白家族等，进而影响肿瘤细胞的扩增或凋亡^[16]。更重要的是，先前的研究表明，PI3K/ AKT 信号通道在肝癌的生成和发展过程中起着决定性的作用，过度激活此信号通道能促进肝癌细胞的生长和迁移，且与患者的不良预后呈正相关^[17]。有研究表明，下调ME2可以诱导肺癌细胞死亡和分化，并影响 PDK1 和 PTEN 的表达从而抑制 PI3K/ AKT通路^[18]。而ME3与PI3K/AKT信号转导通路的关系研究较少。因此，本研究为进一步探究ME3促进HCC细胞增殖和迁移侵袭的机制，检测了ME3是否对 PI3K/AKT 信号通路具有调节作用。结果显示，敲低ME3后，PI3K、p⁃PI3K表达下降，从而抑制下游 AKT 的磷酸化，即敲低 ME3 后 PI3K/AKT 信号通路被明显抑制。过表达ME3后，PI3K、p⁃PI3K 表达增加，促进 p⁃AKT 的表达增加，即上调 ME3 后 PI3K/AKT信号通路被显著激活。

综上所述，本研究显示ME3在HCC组织中表达显著升高。在体外实验中，ME3能促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，从而促进HCC的发生发展，其机制可能通过激活 PI3K/AKT 信号通路来实现，因此它可能会成为针对 HCC 靶向治疗新的潜在靶点。然而，本研究局限于体外实验，下一步研究将通过动物模型验证ME3对HCC发生发展的影响及其可能机制。

参考文献