肺癌是临床常见的上皮来源恶性肿瘤，是癌症致死亡最常见病因之一，呈世界范围流行^[1]。目前，肺癌是仅次于乳腺癌和前列腺癌的第三大常见癌症，每年约有160万人死于肺癌，但在所有癌症相关死亡中占比最大（22%），且5年生存率低至15%^[2]。肺癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，虽然新药物和新疗法不断涌现，但肺癌患者的预后仍然不理想，发病率和死亡率仍然较高^[3-4]。因此，在精准治疗时代寻找肺癌生物标志物至关重要。

模式样识别受体通过识别多种类型病原相关分子模式和损伤相关分子模式激活天然免疫系统，调控获得性免疫反应^[5]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide⁃binding oligomerization domain⁃like receptor，NLR），是一族细胞内胞浆病原模式识别受体，能识别侵入细胞的“内部”信号，以“细胞内监视”的方式调控机体的天然免疫系统。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3） 可识别多种信号，招募半胱氨酸蛋白酶1（cysteine⁃ aspartic acid protease1，Caspase⁃1）和凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis⁃associated speck⁃like protein，ASC），形成炎症小体，参与多种疾病的发生发展^[6-7]。在炎性小体复合物中，Caspase⁃1被自动切割并激活。活化的Caspase⁃1可以加工白细胞介素（interleukin， IL）⁃1β前体和IL⁃18前体至成熟形式，成熟的IL⁃1β 可促进嗜酸粒细胞聚集，并维持相关细胞因子水平^[8]。IL⁃18 增加自然杀伤细胞的溶细胞活性和 γ⁃干扰素（interferon⁃γ，IFN⁃γ）的产生，并影响中性粒细胞的募集和激活^[9]。然而NLRP3炎性小体在肺癌疾病发生发展过程中的作用及分子机制尚不明确。为了深入探索血液 NLRP3 炎性小体表达与肺癌的关系，本研究采集肺癌初诊患者血液，测定外周血单核细胞和外周血中NLRP3 炎性小体水平及其与肺癌的相关性，旨在为肺癌临床筛查和诊断提供生物标志物。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料

选取 2021 年 6 月—2023 年 8 月江苏省连云港市赣榆区人民医院收治的肺癌住院患者72例初诊患者作为肺癌组（其中腺癌 34 例、鳞癌 31 例、肉瘤样癌 1 例、大细胞癌 6 例），男 47 例，女 25 例；年龄 （52.41±7.04）岁，范围（38~74岁）。选取同期在同一医院行健康体检且身体健康者72例作为健康对照组。其中，男 39 例，女 33 例；年龄（33.68±5.72）岁，范围（17~69岁）。纳入标准：符合“肺癌诊断与治疗进展”中肺癌诊断标准^[10]，病理活检确诊为肺癌者； 未经手术、靶向药治疗、化疗等；临床资料完整。排除标准：临床资料不完整；除肺癌外伴其他恶性肿瘤；有手术、药物治疗史；对本次研究拒绝者。本研究经连云港市赣榆区人民医院医学伦理委员会批准（许可证号：2021020），所有患者及家属均签署知情同意书。

1.1.2 试剂

人外周血淋巴细胞分离液（上海索莱宝生物技术有限公司），RNAiso Plus、PrimeScript^TM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（宝日医公司，日本），基因特异性引物（安徽通用生物有限公司），LightCycler^® 480 Multiwell Plate96，white、96孔板封板膜（罗氏公司，美国），FastStart Universal SYBR^® Green Master （ROX，04913914001）、IL ⁃ 1 beta Human ELISA Kit （Invitrogen公司，美国），Human Caspase⁃1/ICE Quan⁃ tikine ELISA Kit（R&D Systems公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 肺功能检测

采用肺功能检测仪测定肺癌组患者和健康对照者的1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV₁）、用力肺活量（forced vital capacity， FVC）及第1秒用力呼气量占用力肺活量比例（FEV₁/ FVC）肺功能指标。

1.2.2 外周血单核细胞 NLRP3 炎性小体转录水平测定

外周血单核细胞分离：取新鲜抗凝血，与等体积生理盐水混匀；加入 2 倍体积淋巴细胞分离液，经400 g离心20 min；收集第2层细胞，转入 4 倍体积生理盐水中，充分洗涤后经400 g离心20 min； 重复2次后收集细胞沉淀。

RNA 抽提：向细胞沉淀中加入 1 mL RNAiso Plus，室温裂解5 min，经12 000 g 4℃离心5 min；收集上清液加入 1/5 体积的氯仿，涡旋混匀，室温作用 5 min，经 12 000 g 4℃离心 15 min；收集上清加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温作用 10 min，经 12 000 g 4℃离心10 min；弃掉上清，加入等体积 75% 无水乙醇，颠倒混匀，经 7 500 g 4℃ 离心 5 min；弃掉上清，风干后加入 10 μL 无核酸酶水充分溶解。

cDNA合成：向反应管中加入2.5 μg total RNA、 1 μL dNTP（10 mmol/L）、1 μL Oligo dT Primer （50 μmol/L），无核酸酶水补足总体积至 10 μL，于 65℃作用 5 min，转移至冰上冷却；向反应管中继续加入 4 μL 5 × PrimeScript Ⅱ Buffer、0.5 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、1 μL PrimeScript Ⅱ RTase（200 U/μL）、4.5 μL无核酸酶水，混匀后依次置于42℃ 30 min、95℃ 5 min，转移至冰上冷却。

荧光定量：向反应管中加入 12.5 μL FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）、0.75 μL 上游引物（10 μmol/L）、0.75 μL 下游引物（10 μmol/L）、 1 μL cDNA模板、10 μL无核酸酶水，充分混匀；按照反应条件95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s 40个循环进行PCR扩增。引物序列参照表1 ^[11]。每样本做 3个技术重复，复孔CT差值不得>0.5。采用2^-ΔΔCt相对定量法测定Nlrp3、Caspase⁃1、Il⁃1β基因相对管家基因Gapdh的转录水平。

1.2.3 外周血Caspase⁃1和IL⁃1β分泌水平测定

收集血清：采集新鲜血液，4℃静置过夜，经 3 000 g 4℃离心5 min，收集血清，用于Caspase⁃1和 IL⁃1β分泌水平测定。

IL⁃1β水平测定：向试剂盒孔板中依次加入200 μL 梯度稀释的标准品和血清原液、50 μL anti⁃IL⁃1β HRP Conjugate solution，混匀后室温作用2 h；弃掉反应板内溶液，加入250 μL 1×Wash Buffer充分洗涤，重复3次；加入200 μL TMB显色液，室温作用15 min；加入100 μL Stop solution，即刻置于450 nm处读取吸光度值，绘制标准曲线，计算外周血样本中IL⁃1β水平。

Caspase⁃1水平测定：向试剂盒孔板中依次加入 50 μL Assay Diluent、100 μL 梯度稀释的标准品和外周血原液，混匀后室温作用 1.5 h；弃掉反应板内溶液，洗涤 3 次；加入 100 μL Conjugate solution，室温作用 30 min；弃掉反应板内溶液，洗涤3次；加入 200 μL Substrate solution，室温作用 20 min；加入 50 μL Stop solution，即刻置于540 nm处读取吸光度值，绘制标准曲线，计算外周血样本中Caspase⁃1水平。

1.3 统计学方法

使用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理。定量资料以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，肺癌组和健康对照组之间的肺功能比较、外周血单核细胞中 NLRP3 炎性小体转录水平比较、血清 Caspase⁃1 和IL⁃1β分泌水平比较使用t检验。肺癌组的外周血单核细胞 NLRP3炎性小体转录水平比较及血清Caspase⁃1/IL⁃1β 分泌水平与肺功能指标 FEV₁、FVC、FEV₁/FVC 之间的相关性采用Spearman相关分析。P <0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肺功能指标比较

肺癌组 FEV₁、FVC、FEV₁/FVC 水平均显著低于健康对照组，差异有统计学意义（P <0.05，表2）。

2.2 两组外周血单核细胞NLRP3炎性小体转录水平比较

肺癌组 NLRP3炎性小体关键基因，包括Nlrp3、 Caspase⁃1、Il⁃1β，相对管家基因Gapdh的mRNA相对表达水平均高于健康对照组，差异有统计学意义 （P <0.05）。而肺癌组 Asc 基因的 mRNA 相对表达水平较健康对照组差异无统计学意义（P >0.05，表3）。

2.3 两组外周血Caspase⁃1和IL⁃1β分泌水平比较

肺癌组外周血 Caspase⁃1 和 IL⁃1β分泌水平均高于健康对照组，差异有统计学意义（P <0.05，表4）。

2.4 肺癌组 NLRP3 炎性小体水平与 FEV₁、FVC、 FEV₁/FVC相关性分析

Spearman 相关性分析结果表明，肺癌组外周血单核细胞Nlrp3基因相对表达量与 FEV₁、FEV₁/FVC 水平呈负相关（P <0.05）；肺癌组外周血IL⁃1β分泌水平均与 FEV₁/FVC 水平呈正相关（P <0.05，表5，图1）。

3 讨论

肺癌来源于上皮细胞不受控制的生长而引发的肺恶性肿瘤。全世界每年约有760万例癌症引发的死亡，而肺癌占其中的137万例^[12]。吸烟、空气污染、遗传因素等均有助于肺癌的发生。早期肺癌可以手术治疗，生存率高，然而，大多数病例是在晚期发现的，手术和药物干预效果不佳，病死率高^[13]。因此，发现肺癌生物标志性分子对诊断、治疗和预防肺癌尤为重要。

炎性小体是一种蛋白质复合物，在多种炎症性疾病中起着重要作用。炎性小体形成先天免疫系统的一部分，触发炎症细胞因子 IL⁃1β和 IL⁃18 的激活。NLRP3 炎性小体因能被多种病原相关分子模式和损伤相关分子模式识别而被广泛研究。 NLRP3 可以使适配器蛋白 ASC 寡聚化，招募和激活蛋白酶 Caspase⁃1。活化的 Caspase⁃1 催化 IL⁃1β和 IL⁃18 的加工和释放，诱发机体炎症反应^[14]。炎症反应是组织清除致病因子，以恢复正常生理功能的主要反应。虽然炎症促进癌症的机制尚不完全清楚，但有两种相互关联的假说：一种内在途径，由导致肿瘤和炎症的基因改变驱动，另一种外在途径，由炎症条件驱动，增加癌症风险^[15-16]。肺癌和炎症密切相关，炎症反应增强可能会增加肺癌疾病发展的风险^[16]。IL⁃1β 是具有免疫调节功能的炎性因子，IL⁃1β与其受体结合可激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）、核因子κB（nuclear factor kappa⁃light⁃chain⁃enhancer of activated B cells，NF⁃κB）信号通路，导致巨噬细胞激活，免疫抑制髓细胞在瘤内积聚，肿瘤生长、侵袭性、转移和血管生成。有证据表明，IL⁃1β及其一些下游效应物，如IL⁃6、IL⁃8、环氧合酶2，在许多恶性肿瘤中作为预后标志物^[17]。有研究发现：IL⁃1β通过 p38信号通路促进肺腺癌细胞糖酵解，从而引起肿瘤细胞的迁移和侵袭，靶向 IL⁃1β和糖酵解途径可能是一种潜在的治疗肺癌的策略^[18]。还有研究发现：环鸟苷单磷酸（cyclic guanosine monophosphate， cGMP）信号转导是新生儿肺功能和发育的重要调节因子，可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase alpha1 subunit，sGCα1）是肺cGMP信号转导的主要效应因子，而 IL⁃1β的表达足可降低 sGCα1 蛋白水平，通过抑制新生儿肺中 sGCα1 表达而抑制 cGMP 信号，影响肺功能^[19]。本研究结果显示，肺癌组 NLRP3 炎性小体关键基因，包括 Nlrp3、caspase⁃1、 Il⁃1β的mRNA 相对表达水平均高于健康对照组，说明肺癌患者体内的NLRP3炎性小体被激活。但Asc 基因的 mRNA 相对表达水平较健康对照组差异无统计学意义，这可能与 NLRP3 炎性小体激活时， ASC发生寡聚化而未引起表达量改变有关。此外，本研究还检测了 NLRP3 炎性小体激活的效应因子 Caspase⁃1及其切割引起活化的IL⁃1β分泌水平，发现肺癌组外周血Caspase⁃1和IL⁃1β分泌水平均高于健康对照组，提示IL⁃1β参与肺癌疾病进展。

肺功能重要指标包括 FEV₁、FVC、每分钟最大通气量（maximum voluntary ventilation，MVV）等^[19]，大多数肺癌会伴随肺功能指标降低。本研究比较了肺癌组和健康对照组的 FEV₁、FVC、FEV₁/FVC 水平，结果表明，肺癌组FEV₁、FVC、FEV₁/FVC水平均显著低于健康对照组。为了深入探讨 NLRP3 炎性小体与肺癌的相关性，本研究选择了肺癌组NLRP3 炎性小体标志分子，Nlrp3基因的mRNA 相对表达水平和 IL ⁃1β分泌水平，与肺癌组 FEV₁、FVC、FEV₁/ FVC 水平进行相关性分析。Spearman 相关分析显示，Nlrp3 基因相对表达量与 FEV₁、FEV₁/FVC 水平呈显著负相关；肺癌组IL⁃1β分泌水平与FEV₁/FVC 水平均呈显著正相关。综上所述，通过分析外周血单核细胞中 NLRP3 mRNA 的相对表达水平和外周血 IL⁃1β的分泌水平，可以了解炎症性调节因子在肺癌进展中的作用。高NLRP3 mRNA表达和IL⁃1β 分泌水平可能与肺癌的恶性程度和进展阶段相关。这可能是因为 NLRP3 是炎症小体的一个组成部分，而 IL⁃1β是一种由炎症小体激活释放的炎症介质。进一步研究揭示NLRP3/IL⁃1β信号轴在肺癌中的具体作用机制，血液NLRP3炎性小体水平与肺癌存在相关性，有望成为肺癌诊断的生物标志物。

参考文献