胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一种高度致命的恶性肿瘤，是我国第6大癌症致死原因^[1]。虽然根治性切除手术仍是目前最有效的治疗方法，但该疾病通常起病隐匿，侵袭性强，进展迅速，80%~85%的患者在诊断时已无法手术切除^[2]。即使有机会接受手术，患者预后也极差，5年生存率仅为12%左右^[3]。常规放化疗通常会发生肿瘤耐药和抵抗，效果不佳^[2]。因此，深入研究PC的发生发展机制不仅有助于发现可以用于早期诊断、预后评估和治疗效果监测的生物标志物，更能寻找到真正有效的药物靶点，最终改善PC患者的预后。

S100A4作为S100蛋白家族中的一员，具有2个 EF双螺旋结构（手型钙离子结合区），当此区与钙离子结合后其构象就发生变化，暴露出其结合位点，进而通过与相应靶蛋白的结合发挥调控细胞运动、侵袭、分裂和存活等生物学效应，与肿瘤的发生和发展密不可分^[4-5]。本课题组前期通过全景单细胞测序技术，构建人PC的原发灶和配对肝转移灶的高分辨率单细胞图谱，发现S100A4是具有高转移能力的PC细胞的标志物之一（数据未发表）。通过免疫组化实验观察到（图1）：与原发灶的癌性导管细胞相比，在转移灶的癌细胞中S100A4蛋白的阳性表达更强；并且S100A4蛋白在细胞核中的强阳性表达现象在癌周浸润灶和远处转移灶中的PC细胞中特别明显。S100A4在多种癌症中发挥促进肿瘤转移的作用^[6]，但涉及的分子机制仍不清楚。S100A4分布于不同的亚细胞区室，包括细胞核、细胞质和细胞外空间，而其作用机制可能取决于其蛋白的亚细胞定位^[5]。据文献报道，高度转移性肝细胞癌细胞外泌体中的 S100A4 可以通过激活 STAT3 信号通路促进肿瘤转移^[7]。在细胞质中，S100A4与细胞骨架和质膜中的许多伴侣蛋白相互作用^[5]，如非肌肉肌球蛋白 Ⅱ^[8]、p53^[9] 等。当S100A4位于细胞核时，可能会影响基因的转录功能，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）⁃14^[10] 和 E⁃钙黏蛋白^[11]。

迄今，尚未见S100A4核定位与PC发生发展以及PC患者生存之间的关系报道和机制研究。有文献报道^[12]，在人关节软骨细胞中，S100A4蛋白核易位可能需要小泛素相关修饰物（small ubiquitin⁃related modifier，SUMO）参与，而 SUMO 化修饰在蛋白质核质运输、蛋白质之间的相互作用、转录调控、DNA修复以及基因组稳定性维持等方面起着重要作用，与细胞周期、肿瘤内环境的改变以及PC的发生和发展密切相关^[13]。

据此，本研究利用PC病程进展的组织芯片，通过免疫组化和 HALO 数字病理精准分析平台等技术，定量S100A4在组织细胞中的表达，特别是细胞核内的表达情况，并分析各检测指标与各临床参数及生存期之间的关系，旨在找到PC侵袭性和不良预后的预测因子。同时，验证PC细胞中S100A4蛋白的SUMO化修饰是否影响其核定位，在此基础上，通过构建细胞研究模型，观察调控S100A4核定位对改变PC细胞运动与侵袭能力的作用并探究可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

无水乙醇、二甲苯（国药集团化学试剂有限公司），Trizol试剂、0.1%结晶紫水溶液（Proteinbio公司，中国），聚乙烯亚胺（polyethyleneinine，PEI）水溶液、 Polybrene（Sigma公司，美国），DMEM 培养基、胎牛血清、Opti⁃MEM（Gibco公司，美国），Lipofectamine3000 （Invitrogen公司，美国），青⁃链霉素、PBS、细胞胰酶消化液（上海碧云天公司），无血清细胞冻存液（苏州新赛美公司），嘌呤霉素（MCE 公司，中国），ECL 超敏感化学试剂（Biosharp 公司，中国），PAGE 凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司），NE⁃PER^TM细胞核和细胞质提取试剂盒（Ther⁃ mo Scientific 公司，美国），靶向剪切反转座酶技术 （cleavage under targets and tagmentation，CUT&Tag） 试剂盒 Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina（南京诺维赞公司），S100A4、泛素结合酶（ubiquitin conjugating enzyme，UBC）9、SUMO1 等抗体（武汉ABclonal公司）。本实验所用细胞株（PANC ⁃1、MIA PaCa⁃2）购自中国科学院细胞库。所用病毒和质粒委托上海吉玛基因、上海和元生物技术、南京科瑞斯公司构建。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学

PC 组织芯片（产品目录号：HPanA060CD02 和 HPanA120Su02）由上海芯超生物有限公司提供，样本来源国家人类遗传资源共享服务平台 （2005DKA21300）。HPanA120Su02 芯片包含 66 例 PC及54例PC癌旁样本，均具备完整的临床信息和术后随访信息。随访截至 2014 年 11 月。HPan ⁃ A060CD02 芯片为 PC 病程芯片，包含正常人胰腺、胰腺炎、PC癌旁/原发灶、PC转移灶和阴性/阳性淋巴结组织，每种组织类型3~18例，每例1点，共60点。相关研究组临床病例信息详见网站 https：//www.superchip.com.cn. 组织芯片的使用由上海芯超生物科技有限公司临床研究伦理委员会批准通过（YBM⁃ 05⁃02）。

PC组织芯片烘片60℃，3 h，脱蜡及水化。然后将切片置于修复液中煮沸（95℃，15~20 min），自然冷却至室温。PBS洗涤3次，每次5 min。5%BSA室温封闭 20 min；一抗 4℃过夜；PBS 洗涤 3 次，每次 5 min；二抗孵育37℃，15~30 min；PBS洗涤3次，每次 3 min；滴加 DAB 显色剂，镜下观察显色情况，及时终止反应；苏木素复染2 min，冲洗后脱水，树胶封片，镜检。

1.2.2 免疫组化结果判读与精准定量分析

利用病理图像分析软件 HALO 的 HALO High⁃ plex FL 分析模块对扫描结果进行半定量分析。所有同类图片分析用同一套分析模板，避免人为主观因素带来的影响。DAB 通道中的阳性程度由专业病理人员先根据图像定义 0（阴性）、1（弱阳性）、3 （强阳性）的阈值，2（中阳性）阈值是 1 和 3 的平均值。染色信号强弱除了通过阳性细胞数目及百分比表示以外，还使用了更为客观精准的组织化学评分（histochemistry score，H⁃Score）。H⁃Score 的取值范围为 0~300，计算方式为：H ⁃Score=[1×（% Cells 1+）+2×（% Cells 2+）+3×（% Cells 3+）]，其中% Cells 1+、% Cells 2+、% Cells 3+分别代表弱、中、强阳性细胞的百分比。细胞核阳性强度也通过统计胞核阳性细胞数目及百分比和组织化学评分（histochemis⁃ try nuclei score，H⁃N⁃Score）来表示。H⁃N⁃Score的取值范围和计算方式同H⁃Score。

1.2.3 S100A4 SUMO化修饰位点的预测

通过多个修饰位点预测网站JASSA、GPS⁃SUMO、 SUMOplot等对S100A4氨基酸序列上的SUMO化修饰位点进行预测并交叉验证。

1.2.4 细胞培养

将PANC⁃1和MIA PaCa⁃2细胞以含10%胎牛血清、1% 青霉素⁃链霉素的 DMEM 完全培养基，置于 37℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.2.5 质粒转染和病毒转导

目的基因 UBC9、SENP1、SENP2、SENP3、内源性 S100A4 沉默以及对照 Scramble 使用 pLV3ltr⁃Zs⁃ Green⁃puro⁃U6 shRNA 载体。病毒转导取对数生长期的细胞，最佳MOI值下，加入含病毒培养基，加入 Polybrene 使其终浓度为 8 μg/mL。4~6 h 换新鲜培养基，24~48 h后换含最优浓度puromycin的培养基，收获抗性细胞，经后续在蛋白或mRNA 水平鉴定后即得到稳转细胞系。

S100A4（野生型）、S100A4⁃K22R（第 22 位赖氨酸突变成精氨酸）、S100A4⁃K96R（第 96 位赖氨酸突变成精氨酸）和 S100A4⁃DKR（双位点突变）在 pcDNA3.1（+）⁃EGFP过表达载体的基础上构建带有 HA 标签的表达载体。Flag⁃SUMO1、Flag⁃SENP1 和 Flag⁃UBC9 表达载体也由 pcDNA3.1（+）⁃EGFP 载体构建。当细胞达到 70% 汇合度时，按照制造商的说明使用 Lipofectamine3000 进行瞬时转染。通过 RT⁃qPCR 或免疫印迹验证基因沉默或过表达的效率。

1.2.6 Western blot

取对数生长期的PC细胞加入含有1% PMSF的 RIPA 裂解液分离总蛋白。BCA 法测定蛋白质含量。按照PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书制胶、上样、电泳。在快速转膜缓冲液中，400 mA电流转膜 40 min。5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭2 h。一抗 4℃ 孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。辣根过氧化物酶（HRP）耦联的羊抗兔或鼠IgG二抗室温孵育2 h。TBST洗膜3次后进行ECL化学发光检测。

1.2.7 免疫共沉淀（Co⁃IP）

充分裂解样品后离心取上清进行免疫共沉淀。向准备好的Protein A+G 磁珠加入抗体工作液或正常IgG工作液重悬后室温翻转孵育1 h。TBS洗涤磁珠重复3次。样品与结合了抗体或正常IgG的 Protein A+G磁珠混合，置于旋转混合仪上，4℃孵育过夜。孵育完毕后，去除上清，使用含抑制剂裂解液洗涤磁珠重复3次，SDS⁃PAGE上样缓冲液洗脱， 95℃加热5 min，置于磁力架上分离10 s，取上清用于SDS⁃PAGE电泳或Western检测。

1.2.8 核质蛋白分离实验

按照制造商的说明使用NE⁃PER™ 细胞核和细胞质提取试剂盒进行。胰酶消化收集细胞，PBS洗 1 次。加入预冷的 CER Ⅰ，涡旋 15 s，冰上 10 min。加入预冷的CER Ⅱ，涡旋5 s，冰上1 min，涡旋5 s， 16 000 g，离心 5 min。立即转移上清液（细胞质提取物），-80℃保存。将含有细胞核的不溶性沉淀用预冷的NER重悬，涡旋15 s，冰上10 min，重复4次。离心后转移上清液（核提取物），-80℃保存。

1.2.9 划痕实验

在细胞达到90%的融合度后，用200 μL的移液器吸头划痕。用PBS冲洗净掉落的细胞，并于0 h和 24 h 在相同的位置进行拍照和记录。Image J 计算相对伤口面积。

1.2.10 Transwell侵袭实验

在基质胶包被的上室加入 200 μL 无血清的 DMEM制备的细胞悬液，在下室加入500 μL含10% FBS 的培养基，培养24 h。用棉签轻轻擦拭上室的细胞，4%多聚甲醛固定10 min，然后用0.1%结晶紫染色 5~10 min，PBS 洗涤 3 次。在倒置显微镜下随机评估10个视野（×200）。

1.2.11 CUT&Tag

使用 Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina进行CUT&Tag检测。连有刀豆蛋白A的磁珠结合细胞后，使用非离子去污剂洋地黄皂苷进行细胞膜通透。然后，将抗S100A4抗体、相应二抗和Protein A/G 一起孵育，使得与Protein A/G 融合的转座子精准靶向切割目的蛋白附近的 DNA 序列。转座子在进行切割的时候，会在被切割的片段两端加上接头序列，经 PCR 扩增后得到高通量测序文库。使用 Agilent 2100 生物分析仪对纯化的PCR产物进行评估。最后，在Illumina NovaSeq 6000平台上对文库进行测序。

1.3 统计学方法

应用SPSS 24.0及GraphPad Prism 9软件进行统计分析。实验数据均以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。使用Kaplan⁃Meier方法估计各检测指标对患者累积生存的影响，并通过Log⁃rank检验，分析各变量与生存率的相关性。通过单因素和多因素Cox回归模型估算风险比（hazard ratio，HR），以确定与总生存期（overall survival，OS）相关的预后影响因素。 P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 S100A4 高表达及细胞核定位与 PC 的转移特征和不良预后正相关

为探究S100A4蛋白表达水平与PC病理进程的相关性，本研究选择不同病程PC组织病理芯片（含位点60例）进行免疫组化分析。如图1A所示，从左到右依次排列的是正常胰腺腺泡组织和逐级递增的胰腺上皮内瘤变（precancerous pancreatic in⁃ traepithelial neoplasias，PanIN）导管。正常胰腺腺泡组织细胞内 S100A4 表达阴性。各级 PanIN 导管上皮细胞中 S100A4 呈阳性表达，定位于细胞胞质和 （或）胞核中。如图1B所示，从左到右依次排列的是胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma， PDAC），PDAC 浸润至胰周脂肪组织内，PDAC 的嗜神经浸润，PDAC 浸润或转移至胰周淋巴结，PDAC 肝脏转移灶。PDAC 癌细胞的胞质和（或）胞核中， S100A4 蛋白大多为强阳性表达。PDAC 最常见的进展形式之一是浸润或侵袭，特别是对神经的浸润或侵袭。在嗜神经浸润和脂肪浸润的PDAC的癌细胞的胞质和胞核中，S100A4 蛋白阳性染色强度增加，与文献中报道一致^[14]。浸润或转移的癌细胞的细胞胞质和胞核中，S100A4蛋白几乎全部为强阳性表达，提示高表达S100A4的癌细胞可能对肿瘤转移具有一定的优势。为了更加客观地反映S100A4表达量及亚细胞定位与PC病理进程之间的关系，利用病理图像分析软件HALO对组织芯片免疫组化结果进行了半定量分析。通过对S100A4阳性细胞百分比和反映S100A4染色强度的组织化学评分H⁃Score、 H⁃N⁃Score的计算，发现正常胰腺组织与胰腺炎组织几乎不表达 S100A4，差异无统计学意义（P >0.05，图2A、C、D）。与正常胰腺组织相比，S100A4 在 PC 癌旁组织表达增加（P <0.05），原发灶S100A4的表达明显升高（P <0.001），而转移灶中S100A4表达量最高（图2B~D），说明S100A4既能先于组织细胞形态改变反映 PC 早期分子病理层面的变化，又能对 PC 细胞转移起提示作用。值得注意的是，相比 S100A4 阳性细胞比例的指标，H⁃Score 纳入了单个细胞 S100A4 染色强度的差异，能更清楚地反映 S100A4表达量差异，特别是H⁃N⁃Score 能精准定量 S100A4在组织细胞中胞核的表达情况，进一步说明随 PC 病程进展，S100A4 强阳性的 PC 细胞比例和S100A4 细胞核定位及核强阳性率显著增加。同时，阳性淋巴结（P <0.05）和转移灶（P <0.001）的 H⁃N⁃Score 高于原发灶，且两者 H⁃N⁃Score 具有比 H⁃Score 更高的平均值，说明 S100A4 的核阳性程度对转移情况的评估可能较 H⁃Score评分更具有提示意义。

进一步地，利用HPanA120Su02芯片（包含 66 例癌及54例癌旁样本，完整的临床信息和术后随访信息，其中癌与癌旁配对49例），通过免疫组化和HALO 定量分析，统计分析各检测指标与各临床参数及生存期之间的关系。在癌与癌旁配对样本中，无论是 H⁃N⁃Score、H⁃Score 或 S100A4 阳性细胞比例，均为 PC 组织显著高于 PC 癌旁组织（P <0.001，图3A~C）。Kaplan⁃meier分析发现S100A4阳性细胞比例高组、H⁃Score或H⁃N⁃Score评分高的患者预后更差，但仅H⁃N⁃Score评分高低对PC患者预后的影响差异有统计学意义（图3D~F）。通过分析S100A4阳性细胞百分比与组织芯片对应的临床病理参数发现，S100A4 的表达高低与T、N分期显著相关（P均<0.05，表1）。单因素Cox回归分析进一步发现H⁃N⁃ Score（HR=2.00，P=0.039）为影响预后的危险因素 （图3G）。将H⁃N⁃Score、H⁃Score、S100A4 阳性细胞百分比、N 分期及年龄这 5 个可能影响PC患者预后的危险因素纳入多因素Cox回归模型进行分析，结果提示 H⁃N⁃Score（HR=2.32，P=0.022）、H⁃Score （HR=1.28，P=0.016）、年龄（HR=1.83，P=0.046）均为独立预后危险因素。 H⁃N⁃Score 具有更高的危险评分，即 S100A4 核定位情况可能对 PC 患者预后的评价更具有参考价值（图3H）。

2.2 PC细胞中S100A4核定位受SUMO化修饰调控

结合文献推测PC细胞中S100A4蛋白的SUMO 化修饰可能是影响其核定位的分子机制。本研究首先使用PC细胞MIA PaCa⁃2进行免疫共沉淀测定 S100A4 SUMO 化情况。结果表明 S100A4 在 MIA PaCa⁃2 细胞中与 SUMO1 或 SUMO2/3 共价结合，且 SUMO1起主要修饰作用（图4A）。

大多数受SUMO修饰的底物蛋白都具有相同的可修饰序列ΨKXE。其中，Ψ代表疏水性氨基酸，如苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸等；K表示赖氨酸，是 SUMO 修饰蛋白的结合位点；X 可以指代任意氨基酸；E则代表谷氨酸^[15]。通过多个修饰位点预测网站 （JASSA、GPS⁃SUMO、SUMOplot等）对S100A4 SUMO 化修饰位点进行预测后发现S100A4两端分别存在一个可能被SUMO蛋白修饰的赖氨酸残基（Lys22和 Lys96）（图4B）。随后通过比对不同物种间S100A4 氨基酸序列发现，预测的 S100A4 SUMO 修饰位点 K22 和 K96 在不同物种间高度保守（图4C），提示 S100A4 普遍受 SUMO 修饰影响。为进一步验证 S100A4与SUMO蛋白的结合位点及其结合机制，本课题组构建了 S100A4 的 Lys22 和 Lys96 位点突变体。首先，通过 SWISS⁃MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/生成了人类S100A4 3D蛋白质模型，并确定第 22 位和/或第 96 位赖氨酸突变成精氨酸的 K22R/K96R突变体S100A4与野生型的结构没有差异（图4D）。在敲低内源性S100A4基础上，同时转染Flag⁃SUMO1和UBC9以及HA标记的S100A4（野生型或不同的突变体），并通过CO⁃IP检测S100A4与 SUMO1结合情况。SUMO⁃S100A4条带在突变体中减少，尤其在S100A4⁃DKR双突变样本中。值得注意的是，在 37 kDa 及以上的位置未观察到 S100A4 条带，提示位点K22和K96在细胞中可能不会同时被 SUMO 化（图4E）。以上实验结果表明，S100A4 是 SUMO化修饰的靶蛋白，且含有2个SUMO修饰位点。

SUMO化修饰由 SUMO 活化酶 E1、E2 和 E3 酶参与，而去 SUMO 化受 SUMO 特异性蛋白酶 SENP 家族的调节^[16]。成熟的 SUMO 蛋白与 E1 偶联，该酶由两个亚基 SAE1/Aos1 和 SAE2/Uba2 组成。活化步骤由 ATP 水解生成高能 SUMO⁃E1 硫酯键，随后 SUMO 转移到 E2 酶。UBC9 是哺乳动物中目前唯一已知的与靶蛋白结合的E2酶。最后，在 E3 连接酶的帮助下，SUMO 与底物上的特定赖氨酸残基形成异肽键。与磷酸化和去磷酸化类似，SUMO修饰的蛋白可以被 SENP 家族解偶联^[17]。SENP 的功能包括 2 个方面：一是催化 SUMO 分子从前体形式转化为活性形式，二是切断SUMO分子与其所结合的靶蛋白之间的异肽键，从而实现去 SUMO 化^[15]。由于 SUMO 化修饰需要进行 3 个连续的酶促反应，因此本课题组进一步探讨哪些SUMO化相关酶参与 PC 细胞中 S100A4 SUMO 化。在 UBC9 敲低细胞中 SUMO ⁃ S100A4 减少，说明 UBC9 是 S100A4 发生 SUMO化修饰所需要的酶。相比SENP2与SENP3敲低组，在 SENP1 敲低细胞中 SUMO1 与 S100A4 结合显著增加（图5A），因此在去 SUMO 蛋白酶家族中 SENP1为主要参与S100A4 SUMO化修饰调控的酶。为进一步验证 UBC9 和 SENP1 直接参与 S100A4 SUMO 化，对 S100A4 与 UBC9 进行免疫共沉淀来检测两者之间的相互作用。结果发现，外源性S100A4 可与 UBC9 结合，完成 SUMO 化修饰的第 2 步。同样地，SENP1 与 S100A4 也存在相互作用（图5B）。此外，在MIA PaCa⁃2细胞中过表达UBC9时SUMO⁃ S100A4增加，相反，SENP1过表达会减弱S100A4的 SUMO 化修饰（图5C）。上述结果表明，PC 细胞中 S100A4 蛋白的 SUMO 化与去 SUMO 化修饰动态平衡过程是SUMO化相关酶介导的一系列酶促反应。

Significance estimated with χ² test，^* P <0.05.

鉴于SUMO化在调节靶蛋白细胞定位的重要作用^[18]，为确定SUMO化修饰是否影响S100A4在胰腺癌细胞中的核定位，本课题组通过基因调控 UBC9 和 SENP1 构建了 SUMO 化程度不同的细胞和 S100A4突变细胞。然后对不同细胞分组进行核质分离从而检测 S100A4 蛋白在胞核与胞质中的比例。与对照组相比，shUBC9 细胞中，SUMO 化的 S100A4 减少（图5A），S100A4 核表达减少，而胞质比例增加（图6A）；相反，敲低 SENP1 后 S100A4 的 SUMO修饰增加（图5A），核内S100A4的量也相应增加（图6A）。同时，转染第22、96位S100A4 SUMO化修饰位点同时突变（S100A4⁃DKR）的细胞胞核内的 S100A4比例（图6B）及其SUMO化修饰明显减少（图4E），而K22R或K96R单位点突变的细胞株细胞核中的 S100A4 比例则略减少（图6B），提示 SUMO 化修饰可促进S100A4核定位分布。

2.3 调控S100A4蛋白的SUMO化修饰能改变胰腺癌细胞的体外转移能力

在前两部分实验结果的基础上，本课题组进一步在PC细胞株（MIA PaCa⁃2与PANC⁃1）中构建敲低内源性 S100A4 表达的稳转细胞株，并进一步调控 S100A4的 SUMO化修饰酶，设立多个实验分组，建立体外研究模型，观察PC细胞的体外转移能力的变化。

与对照组相比，外源性表达S100A4野生型的细胞划痕愈合能力增强，而表达突变型 S100A4⁃DKR 的细胞迁移距离与对照组的差异无统计学意义。在转染各型 S100A4 基础上分别敲低 UBC9 和 SENP1，敲低 UBC9 可部分逆转表达野生型 S100A4 所带来的增益效果，而在转染S100A4⁃DKR 的突变组中，细胞愈合能力虽有降低，但差异无统计学意义。敲低 SENP1 后发现，表达野生型 S100A4 的细胞迁移能力明显增强，而S100A4⁃DKR突变型细胞的愈合能力差异无统计学意义（图7A、C）。以上结果提示，S100A4 SUMO 修饰增强，细胞运动能力提高，促进细胞划痕愈合；S100A4⁃DKR由于SUMO 位点突变，调控 SUMO 相关酶的表达无法改变 S100A4⁃DKR 的 SUMO 修饰水平，故细胞迁移距离没有明显改变。侵袭实验结果也同样表明 S100A4 SUMO化修饰程度会影响细胞转移能力（图7B、D）。

2.4 S100A4核定位参与调控肿瘤转移功能相关的基因网络

为了进一步探究S100A4在PC细胞核内影响了哪些与转移功能相关的基因转录，使用抗S100A4抗体对 S100A4 ⁃ DKR 和 WT 的胰腺癌细胞株进行 CUT&Tag测定。数据显示，CUT&Tag信号主要分布在转录起始位点（transcription start site，TSS）上游，说明S100A4在基因组上的结合位点富集于转录启动区（图8A~C）。对S100A4⁃DKR和WT在基因组上的结合差异基因位点进行GO和KEGG富集分析，结果表明，CUT&Tag 测序中的 S100A4 参与调控的基因在与肿瘤转移相关的多种信号通路中富集（图8D、E），如划痕愈合、焦点黏附、肌动蛋白细胞骨架调节、Wnt 信号通路、细胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）、细胞外基质受体相互作用等，提示 S100A4 在人类胰腺癌进展中的关键作用。寻找 Peak上具有特异性的短序列Motif并分析这些Motif 对应的转录因子的结合位点，发现TWIST2（bHLH） （14.62%，q=0.0274）、BMAL1（bHLH）（13.90%，q= 0.0416）、c ⁃ Myc（bHLH）（10.21%，q=0.0006）、p53 （p53）（8.62%，q=0.0485）、AP ⁃ 2γ（AP2）（7.80%，q= 0.0419）、MNT（bHLH）（7.57%，q=0.0028）等转录因子对应的Motif占总序列百分比较高（表2）。这些转录因子与肿瘤转移的恶性生物学行为密切相关，提示 S100A4 可能通过与这些转录因子相互作用，进而参与转移相关基因的转录调控，提高 PC细胞迁移侵袭的能力。

3 讨论

肿瘤转移是影响预后的关键因素，也是导致治疗失败和患者死亡的首要原因。癌症转移是一个多步骤的过程，在分子水平上有许多与转移相关的蛋白质参与^[19]。1989年，Ebralidze^[20]、Ishikawa^[21] 等鉴定出S100A4，并首次证明其与肿瘤转移相关。最早在人乳腺癌中发现S100A4的过表达可作为预后不良和高转移潜力的指标^[22]。对于食管鳞状细胞癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、PC和胆囊癌^[23-24] 等消化系统肿瘤，S100A4是其不良预后和手术切除或辅助化疗后肿瘤复发的重要预测因子。本研究使用不同病程和癌与癌旁配对组织病理芯片进行免疫组化分析，发现与正常胰腺组织或癌旁组织相比，PC原发灶S100A4的表达显著升高，而转移灶中 S100A4 表达量最高，并且与 PC 的 T、N 分期以及不良预后呈显著正相关。值得注意的是，S100A4核定位与PC的恶性进展和不良预后显著正相关。与胰腺原发灶相比，肝转移灶和淋巴结转移灶中S100A4 核阳性强度显著升高。随PC病程进展，H⁃N⁃Score 即S100A4细胞核定位表达显著增加。同时，单因素和多因素COX回归模型和Kaplan⁃meier分析结果也说明 H⁃N⁃Score 是独立预后危险因素，评分高的患者预后更差。

据报道，S100A4的核定位与结直肠癌诊断时的肿瘤分期存在显著相关性^[25-26]。也有研究表明在非肿瘤性疾病，例如胆道上皮细胞的细胞质中有S100A4的阳性表达，推测其是上皮损伤反应的表现特征^[27]。但是，S100A4 的核阳性表达仅仅特征性见于胆管细胞癌，非肿瘤性胆道上皮细胞中未见该特征^[28]，本课题组也观察到S100A4蛋白，特别是核阳性率在逐级加重的胰腺上皮内瘤变导管细胞中升高，而有证据表明^[29]，即使在仅具有致癌性 Kras 突变的低级别PanIN 阶段，细胞就已经“脱层” 并在腺样瘤早期发生周围组织和循环系统的转移，提示S100A4的核定位可能参与了PC的发生与早期转移，即上皮内瘤变的细胞获得早期转移能力可能与S100A4在细胞核内发挥的作用有关。急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）原始细胞与正常人CD34⁺ 细胞的核蛋白质组和转录组分析研究表明^[30]，AML细胞核中差异表达最高的蛋白质是 S100A4。S100A4 敲除会导致 AML 细胞死亡，而正常的造血干祖细胞不受影响。由此推测S100A4在肿瘤细胞核内发挥的促肿瘤效应有别于其对正常细胞的生理作用。本研究中Motif分析表明S100A4 可能影响TWIST2、BMAL1、c⁃Myc、p53、AP⁃2γ、MNT 等转录因子的激活或抑制。其中，TWIST2的激活可促进上皮间充质转化（epithelial⁃mesenchymal transi⁃ tion，EMT）^[31]。MNT通过表观遗传抑制上皮基因表达程序促进EMT^[32]。肝细胞癌中，血液学和神经学样表达 1（hematological and neurological expressed 1 like， HN1L）以AP⁃2γ依赖性方式上调METTL13基因，从而通过上调TCF3和ZEB1促进细胞增殖和转移^[33]。 S100A4 在细胞核内可能与这些转录因子相互作用从而参与与癌细胞转移表型相关的基因调控途径。

一项包含 1 184 个样本的队列研究表明， S100A4的阳性表达强度与胰腺切除术后生存率低正相关，并且是术后前 24 个月PC复发的强预测因子^[34]，这与本研究结果吻合。但是，该大型队列研究未区分和定量S100A4在肿瘤细胞中胞核或胞质表达，而本研究首次系统地研究与展示了PC进展不同阶段下S100A4表达评分与其在细胞核内的表达情况，并分析了S100A4表达评分及核内表达情况与临床参数的相关性、对患者生存期的影响。此外，本研究通过S100A4⁃DKR 细胞模型的构建、核质蛋白分离、Co⁃IP、体外运动与浸润能力检测、CUT&Tag 等技术证明了 SUMO 化修饰增加了 PC 细胞的 S100A4 的核定位并增强了其转移能力，具体机制是 UBC9 介导下 S100A4 的 K22 和 K96 号位点与 SUMO1 结合，并通过 SENP1 实现去 SUMO 化，动态平衡 PC 细胞中 S100A4 的 SUMO 化修饰水平。因此，靶向调控 S100A4 的 SUMO 化修饰，阻断 S100A4的核定位，可能是削弱或阻断PC 转移能力的新途径。

综上，本研究表明，一方面，S100A4蛋白的核表达定量可提示PC预后风险，如果对其与胰腺癌转移的关联性进行前瞻性验证，S100A4核表达情况可能成为临床决策制定的工具。另一方面，抑制S100A4 的核定位可能成为抑制PC转移，特别是早期转移，改善PC患者预后的有效策略，可通过筛查小分子药物来实现。

参考文献