肺间质纤维化是一种以肺泡上皮损伤、成纤维细胞活化及增殖、细胞外基质沉积并伴有大量炎症细胞募集为特征的肺部疾病。特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）机制不明、预后差，中位生存期仅3~5年^[1]。尽管尼达尼布、吡非尼酮、乙酰半胱氨酸等药物可用于治疗肺间质纤维化，但IPF患者预后依旧很差，仍需要进一步探讨肺间质纤维化机制，研发治疗IPF药物。目前用于研究肺间质纤维化的模型主要包括：博来霉素诱导肺间质纤维化动物模型、二氧化硅（SiO₂）诱导肺间质纤维化动物模型及辐射（放射）诱导肺间质纤维化动物模型。尽管博来霉素诱导肺间质纤维化动物模型是较常用的肺间质纤维化动物模型，但博来霉素诱导肺间质纤维化动物模型不能模拟肺间质纤维化进行性发展的特征，且造模28 d后小鼠肺纤维化有一定自限性；辐射（放射）诱导肺间质纤维化动物模型也可以用于肺间质纤维化机制探讨，但该方法建模周期长、辐射量难以把握、费用较高，并存在个体差异性；SiO₂是导致矽肺的主要原因，人体吸入 SiO₂后巨噬细胞活化、矽结节形成、肺间质纤维化。 SiO₂诱导的肺纤维化小鼠模型也是常用于研究肺纤维化发生发展机制的模型^[2]。SiO₂诱导肺间质纤维化动物模型尽管不能完全代表 IPF 的病理生理改变，但SiO₂一旦进入气道及肺组织中，难以从其中清除，可形成持续刺激，炎症反应剧烈，肺泡巨噬细胞极化，肺间质纤维化，因此，SiO₂诱导的肺间质纤维化模型可用于研究肺泡巨噬细胞参与的肺间质纤维化发生发展过程。本研究通过成功建立SiO₂诱导的巨噬细胞极化模型，初步探讨利拉鲁肽（liraglu⁃ tide，Li）对巨噬细胞极化的作用及其细胞生物学机制和分子生物学机制。

肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）作为一种高度异质性的免疫细胞，可分为M1、M2亚型，两者可分泌各种促炎和促纤维化因子，诱导上皮细胞发生间充质转化，促使成纤维细胞增殖，在肺间质纤维化的发生发展中发挥重要作用。其中，M2型巨噬细胞极化是肺纤维化的重要病理学特征，抑制 M2型巨噬细胞极化在肺纤维化中发挥重要保护作用^[3-4]。AM可经不同途径诱发表型改变，调节炎症因子分泌。NOD样受体（NOD⁃like receptor，NLR）以炎症小体的形式发挥作用，包括 NLRP1、NLRP3、 NLRP4等。炎症小体是一类多蛋白复合物，参与多种炎症因子的成熟和释放过程，介导细胞对病原体感染、组织损伤、吸入有害颗粒如SiO₂的应答^[5]。研究显示，NLRP3参与了人体多个组织器官纤维化过程^[6]。本课题组前期研究发现，NLRP3通过Smad2/3 ⁃Snail信号通路参与调控SiO₂诱导气道上皮细胞发生间充质转化^[7]。

Li是一种长效胰高血糖素样肽⁃1（glucagon like peptide⁃1，GLP⁃1）类似物，通过激活胰高血糖素样肽⁃1受体（glucagon like peptide⁃1 receptor，GLP⁃1R） 治疗 2 型糖尿病，在治疗 2 型糖尿病的同时降低肝纤维化的发生^[8]。Li可通过抑制氧化应激、Smad信号通路来抑制心脏纤维化^[9-10]。Li可通过下调TGF⁃β1 表达，减弱 TGF⁃β1/Smad3 信号转导，减轻肾纤维化^[11]。本课题组既往研究发现，Li可通过减少大鼠肺纤维化模型中肺部巨噬细胞等炎症细胞浸润和炎症因子释放，保护肺组织结构，减少胶原沉积，抑制上皮间充质转化，防治大鼠肺间质纤维化^[12]。本研究建立了SiO₂诱导的巨噬细胞极化模型，从细胞水平初步探究Li抑制M2型巨噬细胞极化的细胞生物学和分子生物学机制。

1 材料和方法

1.1 材料

急性单核细胞白血病细胞系THP⁃1（中国科学院上海细胞库），Li、佛波酯（phorbol⁃12⁃myristate⁃13⁃ acetate，PMA）、SiO₂（Sigma 公司，美国），RPMI 1640 培养基（Gibco 公司，美国），细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）⁃8（杭州联科生物科技有限公司），白细胞介素（interleukin，IL）⁃1β ELISA 检测试剂盒 （上海恒远生物科技有限公司）、转化生长因子 （transforming growth factor，TGF）⁃β1 ELISA 检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），增强型线粒体膜电位检测试剂盒（JC⁃1）（上海碧云天生物技术公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），CD68 抗体（Abcam 公司，美国），荧光染料 Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技术公司）NOD样受体蛋白 3（NOD⁃like receptor protein 3，NLRP3）抗体（No⁃ vus公司，美国）；半胱天冬蛋白酶⁃1（cysteinyl aspar⁃ tate specific proteinase，Caspase⁃1）p20 抗体、精氨酸酶（arginase，Arg）⁃1 抗体、IL⁃10 ELISA 检测试剂盒 （武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SiO₂的制备

称取适量SiO₂混匀于0.9%生理盐水中，配制成浓度为10 mg/mL的储备液，超声30 min，200℃灭菌 90 min 后，4℃保存备用。实验时，用 RPMI1640培养基稀释为工作液。

1.2.2 巨噬细胞培养、诱导分化及分组

THP⁃1细胞用含10 %胎牛血清的RPMI 1640完全培养基培养于37℃、5% CO₂的细胞培养箱。取状态良好的THP⁃1细胞，加入150 ng/mL PMA诱导48 h，细胞诱导贴壁为巨噬细胞。弃培养基，PBS洗涤后用于后续实验。

细胞分为5组，分别为对照（Control）组、SiO₂组（SiO₂ 浓度为50 μg/cm²）及SiO₂+Li（10、100、1 000 nmol/L） 组。SiO₂+Li组中先使用Li预处理1 h，再使用SiO₂刺激24 h。

1.2.3 免疫荧光法检测CD68表达

取对数生长期THP⁃1细胞，制成8×10⁴ 个/mL的细胞悬液，接种于装有爬片的24孔细胞培养板中，每孔 500 μL 细胞悬液。加入 150 ng/mL PMA 诱导 48 h，细胞诱导贴壁为巨噬细胞。弃去培养基，PBS 洗涤3次，加入4%多聚甲醛，室温下固定20 min。弃去多聚甲醛，PBS洗涤3次。0.1% Triton X⁃100室温破膜后，PBS洗涤3次。使用5% BSA室温封闭30 min，去除BSA，向24孔板中加入CD68抗体（1∶1 000），4℃ 冰箱孵育过夜。次日使用1×PBST洗涤3次，加入荧光二抗（1∶1 000），37℃孵育 1 h，PBST 洗涤 3 次，每孔加入DAPI反应液300 μL，室温避光孵育10 min 后，PBST清洗3次，滴加适量抗荧光猝灭液封片，将爬片置于荧光显微镜下，观察荧光强度并拍照。

1.2.4 CCK⁃8法检测巨噬细胞活性

将对数期THP⁃1细胞以5×10³ 个/孔接种于96孔板，PMA（150 ng/mL）诱导分化48 h后，弃上清，更换为含0、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L Li的RPMI 1640 完全培养基处理细胞24 h，弃培养基，PBS清洗3次，每孔加入100 μL CCK⁃8工作液，孵育2 h，采用全自动酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值。按照公式细胞活力（%）=[（实验孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（对照孔吸光度值-空白孔吸光度值）]×100%，计算细胞活力。

1.2.5 ELISA 法检测细胞培养上清中 IL⁃1β、IL⁃10 及TGF⁃β1

收集各组细胞培养上清于 4℃、1 000 g 离心 20 min 去除杂质及细胞碎片。除空白孔外，分别将各组细胞培养上清及不同浓度标准品加入相应孔中（100 μL/孔），用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱中孵育 90 min。洗板 4 次，除空白孔外，每孔加入 100 μL生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱中孵育 60 min。洗板 4 次，除空白孔外，每孔加入100 μL酶结合物工作液，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱中孵育30 min。洗板4次，每孔加入100 μL显色剂，避光37℃孵箱中孵育15 min。每孔加入 100 μL 终止液，混匀后在酶标仪上读取 450 nm处的吸光度值。

1.2.6 Western blot 测定 NLRP3、Caspsae ⁃ 1 p20 及 Arg⁃1表达水平

各组去除细胞培养液，加入细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。各组细胞总蛋白使用浓度为 7.5%~12.5%的 SDS⁃PAGE 胶分离后转移到 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭 1 h，加入 NLRP3 抗体（1∶1 000）、 Caspsae⁃1 p20抗体（1∶1 000）、Arg⁃1抗体（1∶1 000）， 4℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入二抗，室温孵育 1 h。TBST洗涤3次后加入ECL化学发光液，置于化学发光仪中曝光并拍照，使用Image Lab软件分析灰度值。

1.2.7 JC⁃1荧光探针染色检测线粒体膜电位

将各组细胞接种于6孔板中，吸除培养液，PBS 洗涤1次，加入1 mL细胞培养液。各孔中分别加入 1 mL JC⁃1染色工作液，充分混匀。37℃细胞培养箱中孵育 20 min，吸除上清，用 JC⁃1 染色缓冲洗涤液洗涤 2 次，加入 2 mL 细胞培养液，使用荧光显微镜观察并拍照，使用Image J软件分析平均荧光强度，计算红色/绿色荧光度比值。

1.2.8 ROS检测

将各组细胞接种于提前放置爬片的24孔板中，向各孔加入含10 μmol/L DCFH⁃DA的RPMI 1640培养基，37℃细胞培养箱中孵育1 h。弃去上清，使用荧光显微镜拍摄细胞内ROS荧光图像。使用Image J软件分析平均荧光强度。

1.3 统计学方法

数据分析采用 GraphPad Prism 6.0 软件。所有数据以均数±标准误（$\stackrel{-}{x}\pm s_{\stackrel{-}{x}}$）表示。多个样本间均数比较采用单因素方差分析，组间均数比较使用LSD⁃ t检验法。P <0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 巨噬细胞鉴定

免疫荧光染色结果显示，培养的细胞中 CD68 （巨噬细胞标志物）表达阳性，提示 PMA 成功诱导 THP⁃1细胞贴壁分化为巨噬细胞（图1）。

2.2 Li对巨噬细胞活性的影响

与 Control 组相比，不同浓度 Li（1、10、100、 1 000、10 000 nmol/L）处理巨噬细胞24 h后，细胞活性差异无统计学意义（P >0.05），提示在1~10 000 nmol/L 内，Li对巨噬细胞无明显细胞毒性（图2）。1 nmol/L 浓度太低不易显示出差异，10 000 nmol/L在人体内浓度太高，故选择 10、100、1 000 nmol/L 3 个浓度梯度完成后续实验。

2.3 Li对巨噬细胞NLRP3活化的影响

与Control组相比，50 μg/cm² SiO₂作用于巨噬细胞 24 h，可显著上调NLRP3和活化的Caspase⁃1 p20蛋白表达（P <0.001）。与SiO₂组相比，SiO₂+Li（10 nmol/L） 组、SiO₂+Li（100 nmol/L）组及SiO₂+Li（1 000 nmol/L）组 NLRP3、Caspase⁃1 p20 表达水平降低，差异有统计学意义（P <0.05，图3）。以上结果提示 Li（10、 100、1 000 nmol/L）可浓度依赖性抑制 SiO₂诱导的 NLRP3及Caspase⁃1 p20蛋白表达。

2.4 Li 对巨噬细胞 IL⁃1β、IL⁃10 及 TGF⁃β1 表达的影响

SiO₂组 IL ⁃1β水平为（127.00±17.05）pg/mL，较 Control 组（37.72±10.23）pg/mL 明显增加，差异有统计学意义（P <0.001）；与 SiO₂ 组相比，SiO₂+Li （10 nmol/L）组、SiO₂+Li（100 nmol/L）组及 SiO₂+Li （1 000 nmol/L）组 IL ⁃ 1β 水平分别为（77.40 ± 12.55）、（64.74±6.86）、（41.55±12.74）pg/mL，较 SiO₂ 组降低，差异有统计学意义（P <0.05，P <0.001，图4A）。

SiO₂ 组 IL ⁃ 10 水平为（212.70 ± 6.97）pg/mL，较 Control组（70.88±3.21）pg/mL明显增加，差异具有统计学意义（P <0.001）；SiO₂+Li（10 nmol/L）组、SiO₂+Li （100 nmol/L）组及SiO₂+Li（1 000 nmol/L）组IL⁃10水平分别为（127.80 ± 7.70）、（110.80 ± 6.53）、（85.13 ± 7.17）pg/mL，较SiO₂组明显降低，差异有统计学意义 （P <0.001，图4B）。

SiO₂组TGF⁃β1水平为（854.60±98.00）pg/mL，较 Control组（268.40±19.29）pg/mL明显增加，差异具有统计学意义（P <0.001）；SiO₂+ Li（10 nmol/L）组、 SiO₂+Li（100 nmol/L）组及 SiO₂+Li（1 000 nmol/L）组 TGF ⁃β1 水平（分别为 511.20±66.53、386.70±32.30、 308.00±89.20 pg/mL，较 SiO₂组明显降低，差异有统计学意义（P <0.01，P <0.001，P <0.001，图4C）。

以上结果提示Li（10、100、1000 nmol/L）可浓度依赖性抑制SiO₂诱导的细胞上清中IL⁃1β、IL⁃10及 TGF⁃β1分泌。

2.5 Li对巨噬细胞Arg⁃1表达的影响

与Control组相比，SiO₂组细胞中Arg⁃1蛋白表达水平显著升高（P <0.001）。与SiO₂组相比，SiO₂+Li （10 nmol/L）组、SiO₂+Li（100 nmol/L）组及 SiO₂+Li （1 000 nmol/L）组Arg⁃1表达水平降低，差异有统计学意义（P均 <0.05，图5）。以上结果提示Li（10、100、 1 000 nmol/L）可浓度依赖性抑制 SiO₂诱导的 Arg⁃1 蛋白表达。

2.6 Li对巨噬细胞线粒体膜电位的影响

与 Control 组相比，在 SiO₂处理的巨噬细胞中， JC⁃1 红色荧光强度明显减弱，绿色荧光强度增强，提示线粒体膜电位下降。与 SiO₂ 组相比， SiO₂+Li（10 nmol/L）组、SiO₂+Li（100 nmol/L）组及 SiO₂+Li（1 000 nmol/L）线粒体内红色荧光逐渐增强、绿色荧光逐渐降低，提示 Li（10、100、1 000 nmol/L）可浓度依赖性保护 SiO₂诱导的线粒体膜电位下降 （图6）。

2.7 Li对巨噬细胞ROS水平的影响

与Control组相比，SiO₂组ROS相对荧光强度增加，差异有统计学意义（P <0.05）；与 SiO₂组相比， SiO₂+ Li（10 nmol/L）组、SiO₂+ Li（100 nmol/L）组及 SiO₂+Li（1 000 nmol/L）组ROS相对荧光强度逐渐下降，差异有统计学意义（P 均 <0.05，图7）。以上结果提示Li（10、100、1 000 nmol/L）可浓度依赖性减少 SiO₂诱导的ROS生成。

3 讨论

间质性肺病是以弥漫性肺实质、肺泡炎和间质纤维化为病理特征，以渐进性劳力性呼吸困难为临床主要症状的一类疾病的总称，最终可发展成蜂窝肺及呼吸衰竭，严重影响患者生活质量^[13-14]。间质性肺病预后差，特别是IPF缺乏有效治疗手段。近年来随着恶性肿瘤发病率逐年增高，抗肿瘤的化疗药物如博来霉素等可引起间质性肺病，程序性死亡受体⁃1（programmed cell death protein 1，PD⁃1）、细胞程序性死亡⁃配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PD⁃L1）临床的广泛应用也是导致间质性肺病的重要原因之一，已逐渐引起广泛关注和重视。目前间质性肺病、肺间质纤维化机制尚不完全明了。AM 是肺组织的重要免疫细胞之一，参与肺部免疫应答、宿主防御和损伤后修复。当吸入有害颗粒、病原体或发生变态反应时，AM 等免疫细胞在局部聚集，释放各种炎症因子和生长因子，引起局部炎症，导致间质性肺炎，最终发展为肺间质纤维化^[15]。因此，巨噬细胞在间质性肺病、肺间质纤维化发生发展过程中可能发挥了重要作用。朱佳丽等^[12] 研究发现，口服灌胃 Li 可减轻大鼠模型的肺间质纤维化，但巨噬细胞在其中作用及其机制尚不完全明了。巨噬细胞在矽肺相关的间质性肺病发病机制中发挥重要作用，本研究建立了SiO₂诱导的巨噬细胞极化模型，从炎症反应、氧化应激、线粒体功能，探讨了 Li 对 SiO₂诱导巨噬细胞极化的细胞及分子生物学机制。

THP⁃1细胞是急性单核细胞白血病细胞系，经 PMA诱导贴壁后可具有“巨噬细胞样功能”，被广泛用于构建炎症相关疾病的细胞模型。本研究在体外应用PMA诱导的THP⁃1巨噬细胞，从细胞和分子水平进一步探究 Li 对巨噬细胞极化的作用及机制。SiO₂与巨噬细胞共培养24 h，M2型巨噬细胞标志蛋白Arg⁃1表达增加，上清液中M2型巨噬细胞炎症因子IL⁃10、TGF⁃β1浓度增高，提示SiO₂可诱导巨噬细胞向M2型极化。

Jiao等^[15] 研究发现，巨噬细胞吞噬SiO₂后，释放相关炎症因子、生长因子，导致肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cell，AEC）损伤，炎症因子释放进一步增加，上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition， EMT）。NLRP3 炎症小体在炎症因子的成熟、释放中发挥重要作用，并介导免疫应答。炎症小体包括 4种类型，其中NLRP3在炎症反应中的作用最引人关注。NLRP3主要由感受器NLRP3蛋白、适配器凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC）以及效应器Caspase⁃1 3 部分组成。巨噬细胞吞噬 SiO₂，诱导 NLRP3 组装活化，pro⁃Caspase⁃1剪切为活化的Caspase⁃1 p10和 Caspase⁃1 p20，加速IL⁃1β成熟及分泌，导致炎症瀑布^[16]。本研究结果显示，SiO₂与巨噬细胞共培养，可上调NLRP3蛋白组分及Caspase⁃1 p20表达，增加细胞培养上清中炎症因子IL⁃1β分泌，提示SiO₂可促进 NLRP3炎症小体活化。

NLRP3炎症小体活化在M1型巨噬细胞极化中被广泛研究，也有研究提示，NLRP3 炎症小体参与 M2型巨噬细胞活化。Liu等^[17] 发现泛素特异性蛋白酶19可通过抑制NLRP3炎症小体活化，减少M2型巨噬细胞极化。Krishnan等^[18] 发现NLRP3炎症小体抑制剂MCC 950可减少小鼠肾组织中M2型巨噬细胞数量。本研究也发现，在SiO₂诱导的巨噬细胞中， NLRP3 活化同样伴随着 M2 型巨噬细胞极化，提示 NLRP3 炎症小体可能参与 M2 型巨噬细胞极化，但其具体分子机制尚需进一步研究。

TGF⁃β1主要来源于M2型巨噬细胞，是强有力的促进成纤维细胞活化、驱动纤维化发生的重要细胞因子。本研究发现，SiO₂刺激后可诱导巨噬细胞向M2型极化，并分泌大量TGF⁃β1。研究表明，SiO₂ 可通过激活NLRP3炎症小体，促进巨噬细胞分泌大量的促炎因子IL⁃1β ^[19]。而IL⁃1β可通过激活巨噬细胞表面IL⁃1受体促进TGF⁃β1表达，增强TGF⁃β1介导的促纤维化作用^[20]。

乙酰半胱氨酸为还原型谷胱甘肽的前体物质，能够清除自由基，增加抗氧化能力，调节氧化⁃抗氧化失衡，可用于肺间质纤维化的治疗。氧化应激在肺间质纤维化的发生发展中可能发挥了重要作用。ROS是细胞有氧代谢过程中产生的中间产物，可与不饱和脂肪酸形成脂质活性氧，破坏细胞内膜结构，造成细胞损伤。线粒体作为氧化磷酸化的关键场所，可能参与了ROS的产生和代谢。线粒体内膜两侧的质子或其他离子浓度不对称时，产生线粒体膜电位。膜电位正常是维持线粒体稳态、强化氧化磷酸化的条件，有利于维持细胞的正常生理功能。线粒体功能障碍引起的氧化应激增强可促进 ROS大量生成[21⁃22]，进而激活NLRP3，促进IL⁃1β、IL⁃ 18的成熟与分泌，导致一系列瀑布样炎症反应^[23-25]。肺组织慢性炎症诱导肺成纤维细胞活化，并合成和分泌大量细胞外基质，导致肺组织结构破坏和肺间质纤维化形成。本研究显示，SiO₂与巨噬细胞共培养 24 h 后，巨噬细胞线粒体膜电位下降、ROS 水平增高，NLRP3 炎症小体活化，提示线粒体作为能量代谢的重要细胞器，偶联了能量代谢与NLRP3介导的巨噬细胞炎症反应过程。

近年来研究发现，Li 是能量代谢的重要调节剂，不仅可调节糖脂代谢，还具有抗炎、抗氧化应激及减轻肾、心、肝等器官纤维化的作用[8⁃11]。例如在肾纤维化中，Li可通过抑制下游信号分子Smad3的活化，减弱 TGF⁃β1/Smad3 信号转导，抑制 EMT，减少细胞外基质的分泌和沉积，最终阻止肾纤维化的发展^[11]。在心肌纤维化中，Li可通过抑制局部肾素⁃ 血管紧张素系统活性，下调TGF⁃β1表达，抑制其下游致纤维化因子Col⁃Ⅳ的生成，发挥抗纤维化作用^[9]。本课题组研究发现，Li可抑制肺动脉高压大鼠肺动脉周围CD68⁺ 巨噬细胞和甲苯胺蓝染色阳性的肥大细胞聚集，可通过抑制 TGF⁃β1 和 IL⁃1β诱导 Smad/ 非Smad信号通路激活，抑制肺动脉内皮细胞间质转化，保护肺血管内皮细胞，发挥治疗 PAH 作用^[26]。此外，Li可通过下调TGF⁃β1表达减轻博来霉素诱导的大鼠肺部炎症反应及胶原合成，从而改善肺纤维化^[12]。本研究进一步发现，Li可缓解SiO₂诱导的培养巨噬细胞线粒体膜电位的下降，改善线粒体功能，减少ROS氧化应激，减弱NLRP3相关炎症反应，抑制 M2 型巨噬细胞极化，这可能是 Li 发挥抗炎和抗纤维化作用的潜在细胞和分子生物学机制。

综上所述，本研究从线粒体功能、氧化应激、炎症反应等过程，探讨了Li对SiO₂诱导的培养巨噬细胞向M2极化的抑制作用及其机制。发现Li可抑制 SiO₂诱导的巨噬细胞线粒体功能障碍，降低ROS水平，抑制NLRP3炎症小体活化，抑制体外培养的巨噬细胞向M2极化，下调炎症因子TGF⁃β1、IL⁃10表达，提示 Li 可通过抑制 SiO₂诱导的 M2 型巨噬细胞极化，调节相关疾病的病理生理过程。

参考文献