摘要
目的：探讨细胞色素B5还原酶2（NADH-cytochrome B5 reductase 2，CYB5R2）在弥漫大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B- cell lymphoma，DLBCL）中的表达特征及其对临床预后的指示价值，为DLBCL分子分型及个体化治疗提供新依据。方法：本研究采用生物信息学分析与临床验证相结合的策略。首先于 TCGA 数据库获取 DLBCL 相关的差异表达基因数据集，应用 DAVID 6.8平台进行GO功能富集分析筛选关键基因CYB5R2。基于TCGA和GTEx数据库整合分析CYB5R2在DLBCL组织与正常淋巴组织中的表达差异。基于免疫组化判读分析CYB5R2蛋白在DLBCL和小B细胞淋巴瘤中的表达差异。进一步通过回顾性队列研究，纳入南京医科大学第一附属医院2015年1月—2019年12月经病理确诊且随访资料完整的59例DLBCL患者，采用组织化学染色检测肿瘤组织中 CYB5R2 蛋白表达水平，结合临床病理特征［包括 Ann Arbor 分期、细胞起源（cell of origin，COO）分型、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、CD10表达状态等］及治疗反应［完全缓解（complete response， CR）率］进行相关性分析。采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，Log-rank 检验比较生存差异。结果：生物信息学分析显示， CYB5R2在DLBCL组织中显著高表达（P< 0.05）。临床队列验证发现CYB5R2在LDH升高病例中的阳性表达高于LDH正常病例（χ2 =4.832，P=0.028）；在Non-GCB亚型病例的阳性表达高于GCB亚型病例（χ2 =4.468，P=0.035）；在CD10阳性病例中的阳性表达高于CD10阴性病例（χ2 =4.468，P=0.035）。生存分析表明，CYB5R2高表达患者的5年总生存期（overall survival，OS）显著低于 CYB5R2 零或低表达患者（χ2 =4.799，P=0.028）；高表达患者的 CR 率显著低于 CYB5R2 零或低表达患者（χ2 =4.015，P= 0.045）。结论：CYB5R2在DLBCL中呈现特征性高表达模式，其过表达与Non-GCB亚型、LDH升高等不良预后因素显著相关，提示其可为完善DLBCL的分子分型体系及开发靶向代谢治疗策略提供新的理论依据。
Abstract
Objective：To investigate the expression characteristics of cytochrome B5 reductase 2（NADH-cytochrome B5 reductase 2，CYB5R2）in diffuse large B -cell lymphoma（DLBCL）and its prognostic value，providing new insights for molecular classification and individualized treatment of DLBCL. Methods：This study employed a combined strategy of bioinformatics analysis and clinical validation. First，differentially expressed gene datasets of DLBCL were obtained from the TCGA database，and the DAVID 6.8 platform was used for GO functional enrichment analysis to identify key genes，such as CYB5R2. The differences in expression of CYB5R2 between DLBCL tissues and normal lymphatic tissues were analyzed based on integrated data from the TCGA and GTEx databases. Additionally，a retrospective cohort study was conducted，including 59 DLBCL patients diagnosed pathologically with complete follow-up data from Jan. 2015 to Dec. 2019 in the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University. Immunohistochemical staining was used to detect CYB5R2 protein expression levels in tumor tissues，and their correlations with clinicopathological features［including Ann Arbor staging，cell of origin（COO）classification，lactate dehydrogenase（LDH）levels，CD10 expression status，etc.］and treatment response［complete response（CR）rate］were analyzed. Kaplan-Meier survival curves were plotted，and survival differences were compared using the Log-rank test. Results：Bioinformatics analysis revealed that CYB5R2 was significantly overexpressed in DLBCL tissues（P<0.05）. Clinical cohort validation showed that CYB5R2 expression was higher in cases with elevated LDH levels than those with normal LDH levels（χ2 =4.832，P=0.028）. The positive expression rate of CYB5R2 was higher in Non -GCB subtype cases than in GCB subtype cases（χ2 =4.468，P=0.035）and higher in CD10-positive cases than in CD10-negative cases（χ2 =4.468，P= 0.035）. Survival analysis demonstrated that the 5 - year overall survival（OS）rate of patients with high CYB5R2 expression was significantly lower than that of patients with zero or low CYB5R2 expression（χ2 =4.799，P=0.028）. The CR rate in patients with high CYB5R2 expression was significantly lower than that in patients with zero or low CYB5R2 expression（χ2 =4.015，P=0.045）. Conclusion：CYB5R2 exhibits a characteristic overexpression pattern in DLBCL，and its overexpression is significantly correlated with adverse prognostic factors such as the Non-GCB subtype and elevated LDH levels. This study provides important theoretical evidence for refining the molecular classification system of DLBCL and developing targeted metabolic therapy strategies.
Keywords
弥漫大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B⁃cell lym⁃ phoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型，由中等或大B淋巴细胞组成，呈弥漫性生长[1]。 60%以上的 DLBCL 患者可以从标准化治疗方案 （R⁃CHOP：利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）中受益[1]，但由于肿瘤的异质性，仍有部分患者在治疗后复发甚至出现疾病进展[2]。从分子变异及细胞代谢规律探索DLBCL 的发生及生物学进展，有助于更精准地选择靶向药物与判断预后，达到精准治疗的目的。
2012 年 Caro 等[3] 提出氧化磷酸化（OxPhos）亚型DLBCL。随着研究的进一步深入，线粒体被认为在OxPhos⁃DLBCL 的代谢特征中占主导地位[4]。线粒体是氧化呼吸的主要场所，在线粒体电子传递链产生ATP的同时[5]，还会以超氧化物自由基的形式产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[6]。过量的 ROS 会破坏氧化还原稳态，通过生成致癌信号、形成肿瘤微环境、调节肿瘤代谢等多种方式参与肿瘤细胞的生长调控[7]。多项研究表明通过抗氧化抑制线粒体中产生的ROS，与DLBCL的发生和进展存在负相关[8]。定位于线粒体的细胞色素 B5 还原酶 （cytochrome B5 reductase，CYB5R）是黄素蛋白家族，可以使用NADH作为电子供体催化辅酶Q和细胞色素B的还原，继而参与调节细胞中的氧化还原平衡，在电子运输[9]、脂质代谢[10] 等多种生理反应中发挥作用。CYB5R2 是其中的一种亚型。最新研究发现，CYB5R2可以诱导三价铁还原为二价铁，从而参与肿瘤细胞铁死亡的调控[11]。此外，CYB5R2 还在鼻咽癌[12]、前列腺癌[13]、卵巢癌[14] 等多种肿瘤组织中异常表达，可能在肿瘤的侵袭中扮演重要角色。然而，关于CYB5R2在DLBCL中的表达及其临床意义尚不明确，因此，本研究采用生物信息学分析及免疫组化法检测CYB5R2在DLBCL中的表达，分析其与临床病理特征及患者预后的关系。
1 对象和方法
1.1 对象
收集2015年1月—2019年12月南京医科大学第一附属医院诊治的临床病理资料完整的 DLBCL 患者，满足随访≥5年，且组织大小合适做组织芯片，共收集到59个病例。调取肿瘤组织蜡块，至少达到 1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的蜡块做组织芯片，所有蜡块均由两位高年资病理医师复核诊断。通过电子病历收集患者的临床及病理资料，根据病史、临床表现、影像学检查、实验室检查等进行临床资料分组。另外收集南京医科大学第一附属医院同期确诊的套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤（small lymphocytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia，SLL/CLL）、黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤（mucosa⁃asso⁃ ciated lymphoid tissue lymphoma，MALT）、滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）各 30 例肿瘤组织做对照组织芯片。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准（批准号2024⁃SR⁃704）。
1.2 方法
1.2.1 基因筛选和公共数据库分析
从 TCGA 数据库下载 DLBCL 相关差异表达基因，通过 DAVID 在线平台（https：//david.ncifcrf. gov/）进行 GO 富集分析，筛选定位于线粒体的基因 CYB5R2。从 TCGA 数据库和 GTEX 数据库下载目的基因在肿瘤组织和正常组织中的表达并作对比。
1.2.2 免疫组化与判读
免疫组化：标本均经过 10%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，3 μm切片，行HE和免疫组化En⁃ Vision两步法染色（CYB5R2兔抗人单克隆抗体，产品编号PH8178，稀释比1∶400，Abmart 公司，美国），光镜下观察。具体步骤严格按照全自动免疫组化仪标准流程和试剂盒说明书进行。
CYB5R2判读标准：CYB5R2阳性定位于细胞核和细胞质，阳性结果通过对肿瘤细胞染色强度及肿瘤细胞阳性数量进行半定量分析。①依据染色强度进行计分：阴性（10倍物镜下不可见）为0分，弱阳性（10 倍物镜下为浅棕色）为 1 分，强阳性（10 倍物镜下为棕褐色）为2分。②依据阳性细胞百分比进行评分：阳性细胞数<50%为1分，≥50%为2分。将两项得分相乘判断CYB5R2的表达：0、1、2分定义为零或低表达，4分定义为高表达。
1.2.3 随访
通过查阅患者的电子病历系统确认患者住院治疗情况，对所有患者进行电话随访，随访时间截至 2024 年3月。总生存期（overall survival，OS）定义为患者从确诊 DLBCL 到任何原因死亡或最后1次随访的时间间隔。
1.3 统计学方法
所有数据应用 SPSS 23.0 软件进行统计学分析。采用卡方检验分析CYB5R2表达与临床病理特征的关系。采用Kaplan⁃Meier 生存分析（组间比较采用 Log ⁃ rank 检验）比较研究组间的生存差异。 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CYB5R2在DLBCL中高表达
通过TCGA数据库获取DLBCL的差异表达基因数据集，应用DAVID 6.8平台进行GO功能富集分析筛选关键基因CYB5R2（图1A）。将TCGA数据库中 47 例 DLBCL 肿瘤组织与在 GTEX 数据库中获得的 337 例正常外周血淋巴细胞作对比，结果显示 CYB5R2基因在DLBCL中的表达明显高于正常血液淋巴细胞（P<0.05，图1B）。进一步判读CYB5R2在 DLBCL和小B细胞淋巴瘤MCL、SLL/CLL、MALT、FL 中的表达（图2），结果显示CYB5R2在DLBCL中高表达，差异均有统计学意义（P均<0.001，表1）。
2.2 临床与病理特征
59例DLBCL患者年龄为（56.2±15.2）岁，男37例，女22例，男女比1.6∶1。59例患者中，原发灶位于淋巴结内37例，位于淋巴结外22例，参照Ann Arbor分期：Ⅰ 期 8 例（8/59，13.6%），Ⅱ 期 11 例（11/59， 18.6%），Ⅲ期14例（14/59，23.7%），Ⅳ期26例（26/59， 44.1%）。 59 例患者中 CD10 阳性 22 例（22/59，3 7.3%），BCL⁃6 阳性 53 例（53/59，89.8%），BCL⁃2 阳性 46 例（46/59，78.0%），MUM⁃1 阳性有 47 例（47/ 59，79.7%），Ki ⁃67 高增殖表达（75%以上）47 例 （47/59，79.7%），CD5 阳性 5 例（5/59，8.5%），CD30 阳性 5 例（5/59，8.5%），c⁃Myc 阳性（40%以上）16 例 （16/59，27.1%）。
图1CYB5R2在DLBCL中高表达（与正常淋巴组织相比）
Figure1CYB5R2 is highly expressed in DLBCL tissues（compared to normal lymphoid tissue）
图2CYB5R2在DLBCL和小B细胞淋巴瘤中的性表达
Figure2Expression of CYB5R2 in DLBCL and small B⁃cell lymphoma tissues
表1CYB5R2在DLBCL和小B细胞淋巴瘤中的表达差异
Table1Differential expression of CYB5R2 in DLBCL and small B⁃cell lymphoma tissues
2.3 DLBCL 组织中 CYB5R2 蛋白表达与临床病理特征之间的关系
CYB5R2在59例DLBCL中呈现核浆阳性，根据 CYB5R2 的表达情况分为高表达组（37/59，62.7%） 和零或低表达组（22/59，37.3%）。
在CYB5R2高表达组中，21例（21/37，56.8%）患者的血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH） 升高，27（27/37，73.0%）例患者的细胞起源（cell of origin，COO）分型为Non⁃GCB型。在CYB5R2零或低表达组中，6例（6/22，27.3%）患者的血清LDH升高， 10 例（10/22，45.5%）患者的 COO 分型为 Non ⁃GCB 型。在CYB5R2高表达组中，10例（10/37，27.0%）患者免疫组化表现出CD10阳性。而在零或低表达组中，12 例（12/22，54.5%）患者 CD10 阳性。与 CYB5R2 零或低表达组相比，CYB5R2 高表达组在临床特征上更频繁地表现出血清 LDH 升高（χ2 = 4.832，P=0.028）、Non⁃GCB亚型（χ2 =4.468，P=0.035） （表2）。在免疫特征上，CD10阳性病例更多出现在 CYB5R2 零或低表达组中（χ2 =4.468，P=0.035）（表3）。在年龄、性别、有无B症状、原发灶是否位于淋巴结内、淋巴结外受累数、美国东部肿瘤协作组体力状态评分（Eastern cooperative oncology group per⁃ formance status，ECOG）评分、国际预后指数评分（in⁃ ternational prognostic index，IPI）评分及肿瘤分期中， CYB5R2在高表达组与零或低表达组的差异均无统计学意义（P均>0.05，表2）。
2.4 DLBCL 组织中 CYB5R2 蛋白表达与患者预后之间的关系
59例 DLBCL 患者均接受标准 R⁃CHOP 方案治疗，治疗效果评估为完全缓解（complete response， CR）者 33 例（33/59，55.9%），部分缓解（partial re⁃ sponse，PR）者12例（12/59，20.3%），疾病稳定（stable disease，SD）者 11 例（11/59，18.6%），疾病进展（pro⁃ gressive disease，PD）者 3 例（3/59，5.1%）。在 37 例CYB5R2高表达组中，17例（17/37，45.9%）患者达到 CR，11 例（11/37，29.7%）患者达到 PR，CR 率为 45.9%，总反应率（PR + CR）为 75.6%。在 22 例 CYB5R2零或低表达组中，16例（16/22，72.7%）患者达到 CR，1 例（1/22，4.5%）患者达到 PR，CR 率为 72.7%，总反应率（PR+CR）为 77.2%。两组间的 CR 率差异有统计学意义（45.9% vs.72.7%，χ2 =4.015，P= 0.045）。59例DLBCL患者随访4~60个月，患者的平均生存时间为52.4个月，18例因病死亡，41例生存，生存曲线显示，CYB5R2 高表达组的 5 年 OS 率为 59.5%，零或低表达组为86.4%，差异有统计学意义 （χ2 =4.799，P=0.028，图3）。
表2CYB5R2零或低表达与高表达组的临床特征差异
Table2Differences in clinical characteristics between CYB5R2 zero or low expression and high expression groups
Note：the serum LDH level≤271 U/L is considered the normal.
表3CYB5R2零或低表达组与高表达组免疫标记特征差异
Table3Differences in immunohistochemical characteris⁃ tics between CYB5R2 zero or low expression and high expression groups
3 讨论
CYB5R是一类具有还原功能的蛋白，通过催化电子从NADH转移调节细胞中的氧化还原平衡[15]。在哺乳动物中发现 CYB5R 家族有 5 个成员（1~5），其同工酶主要出现在细胞质、细胞核、线粒体[16]。其中CYB5R2在肿瘤中的异常表达引起较多关注。研究发现，CYB5R2在鼻咽癌[12]、乳腺癌[11] 等肿瘤中表达缺失，但是CYB5R2在DLBCL中呈现高表达状态[17]。通过TCGA数据库分析发现，膀胱尿路上皮癌、非小细胞肺癌、胰腺癌等肿瘤中，CYB5R2也呈现高表达，猜测这可能与组织特异性有关。本研究发现，与正常淋巴细胞、小 B 细胞淋巴瘤对比， CYB5R2在DLBCL中特征性高表达。进一步研究其功能发现，CYB5R2与鼻咽癌转移相关[18]、与胶质母细胞瘤预后相关[19]。
图3CYB5R2表达与DLBCL患者生存的关系
Figure3The association between CYB5R2 expression and survival in DLBCL patients
本研究通过免疫组化判读 CYB5R2 在 DLBCL 中的表达，结果显示CYB5R2在Non⁃GCB组的表达强度显著高于GCB组，在血清LDH升高病例中的表达强度高于LDH正常病例，提示CYB5R2和COO分型、血清 LDH 水平一样可以作为预后判断指标，与其他研究相似[20-21]。CYB5R2的主要功能之一是催化电子从 NADH转移给细胞色素 B5（cytochrome B5，CYB5）[22]，参与能量的产生。NADH电子转移后生成的NAD+ 除了正反馈促进电子转移[23]，还参与糖酵解反应中 3⁃磷酸甘油醛的氧化，是重要的氧化剂[24]。LDH在催化丙酮酸向乳酸转化过程同样伴有NAD+ 的生成[25]，猜测CYB5R2与LDH协同发挥作用，以催化肿瘤细胞中的糖酵解反应，进而为肿瘤的增殖迁移提供能量。另外，本研究还发现CYB5R2与 CD10的相关性：CYB5R2 低表达组中 CD10 的表达显著高于高表达组，符合基于CD10/BCL6/MUM1的 DLBCL COO分型。
本研究的主要目的之一是评估CYB5R2的表达与患者预后的关系。随访5年后发现CYB5R2零或低表达组的病死率为13.6%，而高表达组的病死率为 40.5%，差异有统计学意义，并且CYB5R2零或低表达组治疗评估为 CR 者可以达到 72.7%，与高表达组 45.9%相比，差异有统计学意义。以上提示CYB5R2 高表达可能预示着更差的预后。生存分析也证明这一观点。另外，Ma等[26] 在探索DLBCL的预后时发现 CYB5R2 在 CD5+ DLBCL 和 CD5- DLBCL 中出现差异表达，发现 CYB5R2 高表达组在 CD5+ DLBCL 中提示较差的预后，并且是不利预后的独立因素。 CYB5R2 作为具有还原功能的蛋白质，可以缓解因高代谢产生 ROS 导致的氧化应激，维持细胞内的氧化还原平衡，从而促进肿瘤细胞存活，导致更差的预后。有研究证实，DLBCL 可以通过溶酶体对部分化疗药物产生耐药[27]，而CYB5可以导致溶酶体功能障碍[28]，CYB5R2是否通过直接还原CYB5，促进溶酶体介导的 DLBCL 耐药，进而影响患者预后有待进一步研究证实。
CYB5R2 在多种肿瘤中表达异常，并在 DLBCL 中呈现高表达状态。本研究通过免疫组化进一步对CYB5R2在DLBCL中的表达情况进行判断，发现 CYB5R2 的表达与 COO 分型、血清 LDH 水平以及 CD10的表达相关，并且是DLBCL预后不良的标志，提示 CYB5R2 在 DLBCL 患者预后评估以及靶向治疗中具有重要作用。目前，有关CYB5R2在DLBCL 中高表达的功能及机制尚未阐明，探索CYB5R2在 DLBCL发生及恶性生物学进展中的具体机制，可能为DLBCL患者带来更大的治疗获益。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
All authors declare no conflict of interests.
作者贡献声明：
孙书凝负责数据收集、文献查阅、论文初稿撰写；龚予希负责数据收集、数据解读、文献查阅；杨野梵负责生信分析； 甘芠源负责数据分析；陈刚负责免疫组织化学染色实验；肖菁娇和张诗婷负责数据收集、论文修改；张智弘负责研究设计、数据解读、论文修改，提供基金项目支持。
Author’s Contributions：
SUN Shuning was responsible for data collection，literature review，and drafting the initial manuscript；GONG Yuxi was re⁃ sponsible for data collection，data interpretation，and literature review；YANG Yefan was responsible for bioinformatics analy⁃ sis；GAN Wenyuan was responsible for data analysis；CHEN Gang was responsible for immunohistochemical staining experi⁃ ments；XIAO Jingjiao and ZHANG Shiting were responsible for data collection and manuscript revision；ZHANG Zhihong was responsible for research design，data interpretation，manuscript revision，and providing funding support.