摘要
目的：通过验证黄芩苷（baicalin，BA）在炎症环境下的抗炎效果并探究其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cell，hDPSC）成牙/骨分化的影响，为牙髓炎的活髓保存治疗提供参考。方法：选取人早期炎症牙髓组织制作冰冻切片并进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，免疫组化染色检测白细胞介素（interleukin，IL）-1β表达，免疫荧光染色检测IL-1β、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达。将人单核细胞白血病细胞系THP-1分化的巨噬细胞在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的诱导下极化为M1亚群，再用50 μmol/L的BA处理后，利用免疫荧光、实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和Western blot分析iNOS、IL-1β及IL-8 的表达变化，利用Western blot检测LC3B、Beclin-1及P62的表达变化以观察巨噬细胞自噬，并在使用自噬抑制剂3-MA阻断自噬后检测IL-1β及IL-8的表达变化。随后，提取不同条件处理的巨噬细胞上清液制备条件培养液作用于hDPSC并进行矿化诱导，采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、茜素红（alizarin red S，ARS）染色、RT-PCR 及 Western blot 分析 ALP、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨桥蛋白 （osteopontin，OPN）及Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen，COL-1）的表达，以观察炎症环境下BA 对hDPSC 成牙/成骨分化能力的影响。结果：早期牙髓炎组织炎症区周围 IL-1β和 iNOS 的表达明显升高。LPS 和 IFN-γ诱导后，巨噬细胞由 M0 向 M1 极化，iNOS、 IL-1β及IL-8表达明显增加。当加入50 μmol/L BA共同孵育24 h后，巨噬细胞极化程度明显降低，IL-1β、IL-8的mRNA水平明显下降；同时，与M1组相比，加入BA后LC3B-Ⅱ、Beclin-1表达升高，P62表达被抑制；3-MA阻断自噬后，IL-1β及IL-8的mRNA 水平显著升高。M1巨噬细胞的上清液作用于hDPSC并进行矿化诱导7~21 d后，hDPSC的ALP活性降低，钙盐沉积减少，ALP、 DSPP、RUNX2、OPN及COL-1的表达减少。BA处理后的M1巨噬细胞上清液加入hDPSC后，ALP活性显著升高，钙盐沉积明显增多，ALP、DSPP、RUNX2、OPN及COL-1的表达明显增加。结论：在炎症微环境下，BA可能是通过激活细胞自噬抑制牙髓炎症反应，促进hDPSC的成牙/骨分化能力。
Abstract
Objective：This study aims to verify the anti-inflammatory effect of baicalin（BA）in an inflammatory environment and explore its influence on the odontogenic/osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells（hDPSC），providing a reference for the vital pulp therapy of pulpitis. Methods：Select the early inflammatory pulp tissue of the human teeth for making frozen sections and conducting HE staining，interleukin（IL）-1β immunohistochemical staining，as well as IL-1β and inducible nitric oxide synthase（iNOS） immunofluorescence staining. Human monocyte leukemia cells（THP-1）were differentiated into macrophages and polarized to the M1 subtype under the induction of lipopolysaccharide（LPS）and interferon-γ（IFN-γ）. Then，cells were treated with BA（50 μmol/L）， the expression levels of iNOS，IL-1β，and IL-8 were analyzed using immunofluorescence，real-time quantitative PCR（RT-qPCR），and Western blot. Additionally，the expression changes of LC3B，Beclin-1，and P62 were assessed by Western blot to monitor autophagic flux alterations in macrophages. To further investigate the relationship between inflammation inhibition and autophagy，we employed the autophagy inhibitor 3-MA to block autophagic flux and re-evaluated the expression changes of IL-1β and IL-8. Supernatants from macrophages cultured under various conditions were collected，and the conditioned medium was prepared and added to mineralized hDPSC. The odontogenic/osteogenic differentiation ability of hDPSC in an inflammatory environment was analyzed by alkaline phosphatase ALP staining，alizarin reds（ARS）staining，RT-PCR，and Western blot. Results：The expression of IL - 1β and iNOS around the inflammatory area of early pulpitis tissue was significantly increased. After induced by LPS and IFN-γ，macrophages were polarized from M0 to M1，and the expressions of iNOS，IL-1β and IL-8 significantly increased. After co-incubation with 50 μmol/L BA for 24 hours，the polarization degree of M1 macrophages significantly decreased，the mRNA levels of IL - 1β and IL - 8 significantly decreased compared with the M1 group. Compared with the M1 group，the expressions of LC3B -Ⅱ and Beclin -1 increased after the addition of BA，while the expression of P62 was inhibited. After 3 - MA blocked autophagy，the mRNA levels of IL - 1β and IL - 8 significantly increased. After adding the supernatant of M1 macrophages to hDPSC and inducing mineralization for 7~21 days，the ALP activity of hDPSC decreased，the calcium salt deposition significantly reduced，and the expressions of ALP，DSPP，RUNX2，OPN and COL - 1 significantly decreased. When adding the supernatant of M1 macrophages treated with BA，the ALP activity of hDPSC significantly increased，the calcium salt deposition significantly increased，and the expressions of ALP，DSPP，RUNX2，OPN and COL-1 significantly increased. Conclusion：BA can inhibit inflammatory responses by activating autophagy，thereby enabling hDPSC to function in an inflammatory microenvironment.
对于牙髓炎患牙，目前国际公认的最有效的治疗方法为根管治疗。但是，根管治疗后患牙失去正常牙髓功能，机械强度和抗折能力下降[1]，直接影响患牙的长期预后。基于此背景，活髓保存治疗策略逐渐成为牙髓病学领域的研究热点。
在牙髓炎的发生发展过程中，大量的免疫和非免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、成牙本质细胞和内皮细胞等，能够识别病原体相关分子模式分子并启动免疫反应[2-3]。有研究表明，巨噬细胞在牙髓组织炎症中占主导地位[4]。M1巨噬细胞分泌大量促炎介质和细胞因子，对清除组织碎片和促进炎症反应至关重要[5]。相关介质如肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor，TNF）⁃α、白细胞介素（interleu⁃ kin⁃1β，IL）⁃1β和 IL⁃8 帮助招募免疫细胞清除入侵病原体，在免疫反应的启动中起重要作用[6-7]。然而，过量炎症介质的释放会引起组织损伤[8]。因此，调控巨噬细胞的生物学行为是控制牙髓炎症发展的有效策略。
黄芩苷（baicalin，BA）是中药黄芩中提取出来的黄酮类化合物，在多个疾病模型中有积极治疗作用，具有很强的抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物活性[9-11]。其作用机制涉及多条信号通路的协同调控，通过抑制IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α等炎症介质的表达实现氧化应激与炎症反应的调节[12]。值得关注的是，自噬作为细胞维持稳态的重要机制[13]，可能与 BA 的药理效应存在关联；研究证实该成分可通过激活自噬通路减轻氧化损伤、抑制细胞凋亡[14]，并调控炎症微环境[15]。本课题组的前期研究表明，BA可促进炎症人牙髓干细胞（human dental pulp stem cell，hDPSC）成牙/骨分化[16]，但BA是否通过激活自噬而抑制炎症，并促进hDPSC成牙/骨分化有待进一步研究。
因此，本研究拟探讨 BA 在炎症微环境下通过调控细胞自噬，抑制巨噬细胞的M1向分化，降低炎症因子释放水平，从而间接促进hDPSC的成牙/骨分化，达到治疗牙髓炎症的目的，为BA用于活髓保存治疗提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
人单核细胞白血病细胞THP⁃1购自美国Oricell 生物科技有限公司。胎牛血清（Oricell公司，美国）， RPMI⁃1640培养液（Gibco公司，美国），佛波酯、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、抗坏血酸（vitamin C， VC）、β⁃甘油磷酸酯（beta⁃glycerophosphate，β⁃GP）、地塞米松（Sigma ⁃Aldrich 公司，美国），γ干扰素 （interferon⁃γ，IFN⁃γ，上海Novoprotein公司），CCK⁃8 试剂盒（Apexbio 公司，美国），BA（上海 Macklin 公司），高纯总 RNA 快速提取试剂盒（上海 Bioteke 公司），Prime Script RT Master Mix 试剂盒、SYBR1 Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa公司，日本），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天公司），茜素红 （alizarin red S，ARS）染色试剂盒（北京 Leagene 公司），IL⁃1β抗体、P62抗体、ALP 抗体（Abcam公司，美国），LC3B 抗体、Beclin⁃1 抗体（上海 Abmart 公司）、 OPN 抗体、GAPDH 抗体（武汉 Proteintech 公司）、 DSPP抗体（Santa Cruz公司，美国）。
1.2 方法
1.2.1 牙髓组织获取
选择龋导致的早期慢性牙髓炎病例，无明显急性牙髓炎和根尖周炎症状及体征，X线片显示根周组织无明显变化，无深牙周袋，去腐未尽即露髓的上颌前牙1例，开髓后使用无菌拔髓针完整拔除牙髓，浸泡于4%多聚甲醛中固定备用。收集样本前，向患者充分解释收集样本的目的及用途，并取得患者的知情同意。本研究经南京医科大学口腔医学院伦理委员会批准（批号：PJ2022⁃204⁃001）。
1.2.2 苏木素⁃伊红（hematoxylin⁃eosin，HE）染色
固定后的样本经脱水、透明、石蜡包埋后切片，脱蜡复水，苏木精染色5~10 min，盐酸酒精分化、流水返蓝，伊红复染1~3 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。
1.2.3 免疫组化染色
牙髓样品固定后制备石蜡组织块，切片，脱蜡脱水后进行免疫染色。在室温下使用 10%山羊血清封闭1 h，并在4℃下将切片与IL⁃1β、iNOS一抗孵育过夜，随后于室温环境下与二抗共同孵育 1 h， DAB显色，苏木精复染，脱水，中性树胶封片，晾干，光学显微镜下观察并记录。
1.2.4 THP⁃1的培养和处理
THP ⁃1 细胞中加入含 10%胎牛血清的 RPMI ⁃ 1640 完全培养液，并置于 5%CO2，95%相对湿度的 37℃培养箱中培养。用100 ng/mL佛波酯处理THP⁃1 细胞24 h得到M0巨噬细胞（M0组），再加入100 ng/mL LPS及20 ng/mL IFN⁃γ 诱导48 h，使M0巨噬细胞极化为M1巨噬细胞（M1组），弃原培养液，加入BA孵育24 h（M0+BA组、M1+BA组）。各组巨噬细胞按上述方法处理后，弃掉原培养液，PBS冲洗细胞2次以消除残留血清，再加入RPIM⁃1640培养液孵育48 h，收集 M0、M1、M1+BA 组上清液，3 000 r/min 离心 10 min，通过0.22 μm过滤器过滤后得到条件培养液。
1.2.5 CCK⁃8法检测细胞活力
细胞按5 000个/孔密度铺于96孔板，在完全培养液中培养 24 h 后，用不同浓度（12.5、25.0、50.0、 100.0、150.0 μmol/L）的 BA 处理细胞，分别处理 24、 48、72 h。在各个时间点，加入 100 μL 配制好的 CCK⁃8溶液，37℃孵育2 h。全自动酶联免疫吸附测定仪测定450 nm处的吸光度。
1.2.6 免疫荧光染色
接种THP⁃1细胞悬液于12 mm圆形爬片上（1× 104 个/孔），按前述方法诱导 M1 型极化，加入药物孵育，培养24 h，4%多聚甲醛固定30 min，1% Triton X⁃100工作液通透细胞膜10 min，山羊血清37℃恒温箱内封闭1 h。随后用稀释好的IL⁃1β、iNOS一抗在4℃下孵育过夜，再用荧光标记的二抗在室温下孵育1 h。DAPI染核，LEICA DM4000B显微镜观察处理后细胞的荧光。
1.2.7 hDPSC的分离及培养
选取本院口腔颌面外科根尖未发育完成的健康第三磨牙。用含有 1%青霉素⁃链霉素的 PBS 冲洗，无菌条件下取出牙髓，超净台内在 200 μL α⁃MEM 培养液中剪碎，加入 500 μL 3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和 200 μL 4 mg/mL 胰酶，在 37℃、5%CO2条件下消化20 min。加入完全培养液（含10%胎牛血清、1%青霉素⁃链霉素的α⁃MEM 培养液）终止消化。牙髓组织悬液离心弃除上清后，加入5 mL完全培养液，接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3 d换液。当细胞达到80%融合时，胰蛋白酶消化传代。本研究采用生长状态良好的第 3 代 hDPSC。
1.2.8 hDPSC的处理
α⁃MEM 培养液中加入 10% 胎牛血清，并加入 50 mmol/L VC、10 mmol/L β⁃GP 和 100 nmol/L 地塞米松配制成骨诱导培养液。将第 3~5 代的 hDPSC 接种于 6 孔板中，细胞贴壁后更换为条件培养液 （CM⁃M0、CM⁃M1、CM⁃M1+BA），并加入成骨诱导培养液进行矿化诱导，每3 d更换1次培养液。诱导培养7 d后进行ALP染色，21 d后提取总RNA、总蛋白或进行ARS染色。
1.2.9 实时逆转录聚合酶链反应（reverse transcription⁃ polymerase chain reaction，RT⁃PCR）
收集各组巨噬细胞（M0、M0+BA、M1、M1+BA）及 hDPSC 细胞（CM⁃M0、CM⁃M1、CM⁃M1+BA）。使用高纯总RNA快速提取试剂盒并根据说明书所示方法提取细胞总RNA并测定其浓度。将样品通过 Prime Script RT Master Mix 试剂盒逆转录成 cDNA 后，使用 SYBR1 Premix Ex TaqTM 试剂盒进行实时 RT⁃PCR，以人 GAPDH 为内参，采用 2-ΔΔCt方法进行数据分析，比较各组间基因表达情况。引物序列见表1。
表1RT⁃PCR 使用引物序列
Table1Primer sequences in RT⁃PCR
1.2.10 Western blot
从上述处理过的巨噬细胞及 hDPSC 中提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量样品蛋白浓度。样品经SDS⁃PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂牛奶在TBST（TBS含0.1% Tween⁃20）中封闭2 h。将膜与相应蛋白（IL⁃1β、LC3B、Beclin⁃1、 P62、COL⁃1、DSPP、OPN、ALP）一抗在 4℃ 下孵育过夜。用抗兔或抗鼠二抗孵育 1 h 后，使用 ImageQuant LAS4000系统扫描记录，最后使用Image J软件进行定量分析。
1.2.11 ALP染色
向 hDPSC 中加入上述条件培养液（CM ⁃M0、 CM⁃M1、CM⁃M1+BA）并加入成骨诱导培养液进行矿化诱导 7 d 后，采用 ALP 检测试剂盒检测 ALP 活性。将细胞浸于4%多聚甲醛中固定30 min，新鲜配制 BCIP/NBT 染色工作液并加入 6 孔板，每孔 1 mL 并轻轻摇晃充分覆盖细胞，避光染色 5~30 min，每 5 min检查显色情况。染色完成后用去离子水终止染色，并用显微镜及扫描仪记录结果。
1.2.12 ARS染色
各组细胞（CM⁃M0、CM⁃M1、CM⁃M1+BA）矿化诱导 21 d 后进行 ARS 染色，观察不同处理条件下 hDPSC钙盐沉积情况。细胞在4%多聚甲醛中固定 30 min后使用ARS染色液进行染色，7 min后用去离子水洗去多余染液，显微镜观察并拍照。
1.3 统计学方法
使用 GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析。每个实验均独立重复3次，定量数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析， Tukey HSD 法进行事后两两比较。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 人炎症牙髓组织中炎症因子的表达
HE 染色显示，炎症牙髓组织切片可见冠髓炎症坏死区域，而根髓部分组织形态未见明显变化，说明炎症尚未累及根髓。炎症牙髓组织的免疫组织化学染色显示，与健康根髓区域相比，冠髓部分炎症区周围IL⁃1β的表达明显升高（图1A）。免疫荧光染色结果显示，iNOS、IL⁃1β在冠髓炎症区表达升高（图1B、C）。
2.2 THP⁃1细胞活力测定
为了获取最佳 BA 作用浓度，采用 CCK⁃8 方法评价 BA 对 THP⁃1 活力的影响。如图2所示，12.5、 25.0、50.0 μmol/L的BA处理THP⁃1细胞24、48、72 h 后，细胞活性与对照组均无明显差异，表明50 μmol/L 的BA对THP⁃1细胞没有毒性作用，后续研究均采用该浓度BA处理细胞。
2.3 BA降低M1巨噬细胞的炎症水平
THP⁃1 细胞经诱导处理后，RT⁃PCR 检测相关炎症基因的表达。BA 对 M0 细胞的各基因表达无明显影响。与M0组相比，M1组的IL⁃1β、IL⁃8、IL⁃6 等相关炎症基因mRNA水平表达升高（图3A）。BA （50 μmol/L）孵育 24 h 后，IL⁃1β、IL⁃8 的 mRNA 水平明显下降，而 IL⁃6 的表达水平较 M1 组差异无统计学意义。免疫荧光染色及 Western blot 检测（图3B、C）结果显示，M1 组的 IL⁃1β表达较 M0 组明显升高，而加入 BA 后，IL⁃1β的表达明显下调。 RT⁃PCR 检测结果显示（图3A），与 M1 组相比，BA （50 μmol/L）孵育24 h可以显著降低iNOS（M1生物标志物）的表达，而与 M0 组相比，BA 对 M0 型巨噬细胞无明显影响。免疫荧光染色也得到了同样的结果（图3D）。
图1人炎症牙髓中炎症因子的表达
Figure1Expression of inflammatory factors in human dental pulp
图2CCK⁃8法测定THP⁃1细胞活力
Figure2The viability of THP ⁃1 cells was determined by CCK⁃8
2.4 BA增加THP⁃1来源M1巨噬细胞的自噬
利用Western blot检测自噬相关标志物LC3B⁃Ⅱ、 Beclin⁃1及P62的表达，与M1组相比，BA诱导后的 M1 组细胞 LC3B⁃Ⅱ和 Beclin⁃1 的表达增加，P62 的表达减少（图4A），提示BA处理后MI巨噬细胞自噬增加。
2.5 BA 对 THP⁃1 来源 M1 巨噬细胞炎症的抑制作用与自噬激活有关
采用自噬抑制剂 3⁃MA 确定 BA 对 THP⁃1 来源的 M1 型细胞的炎症抑制作用是否依赖于 BA 的自噬激活作用。3⁃MA 通过抑制Ⅲ类 PI3K 来抑制自噬。通过Western blot检测3⁃MA预处理后的自噬抑制效果，如图4B所示，M1+3⁃MA+BA组中，3⁃MA显著抑制了 LC3B⁃Ⅱ和 Beclin⁃1 的表达并增加 P62 的表达，表明经过 3⁃MA 预处理后的巨噬细胞自噬通量明显受阻，BA 的自噬激活作用受到影响。再用 RT⁃PCR 检测 IL⁃1β及 IL⁃8 的 mRNA 表达水平，与 M1+BA组相比，3⁃MA的加入抵消了BA的炎症抑制作用（图4C）。Western blot 结果也同样表明，3⁃MA 通过阻断自噬逆转了 BA 对 IL⁃1β表达的影响（图4B）。
2.6 BA 处理的 THP⁃1 来源 M1 巨噬细胞培养液上清对hDPSC成牙/骨分化的影响
为了进一步探索BA能否通过影响巨噬细胞的生物学表现间接影响 hDPSC 的功能，将 M0、M1、 M1+BA 3 组细胞按上述方法培养后分离上清得到 CM，并用其处理hDPSC，判断hDPSC的成牙/骨能力是否出现变化（图5A）。在成骨诱导培养液中培养7 d 后，采用 ALP 染色观察 hDPSC 的成骨分化情况。如图5B 所示，与 M0 组相比，CM ⁃M1 减少了 hDPSC的ALP染色，而BA治疗可以抵消M1巨噬细胞 CM 对 hDPSC 成牙/骨分化的抑制作用。成骨诱导培养液中培养21 d后的ARS染色结果显示，CM⁃ M1+BA组相较于CM⁃M1组观察到更多的钙盐沉积 （图5C），BA的加入可以逆转CM⁃M1的影响。进一步用RT⁃PCR观察了BA处理的M1巨噬细胞对hDP⁃ SC成牙/骨分化的影响，CM⁃M1组的ALP、RUNX2和 DSPP的表达量较CM⁃M0组明显降低，而BA的加入可明显增加这些基因的表达（图5D）。Western blot 检测结果显示，与 CM ⁃M1 组相比，BA 可以增加 ALP、OPN、DSPP和COL⁃1的蛋白表达（图5E）。
图3BA对THP⁃1来源M1型巨噬细胞炎症的抑制作用
Figure3The inhibitory effect of BA on M1⁃derived macrophages
3 讨论
口腔细菌侵入牙本质往往会引起牙本质⁃牙髓复合反应。致病微生物侵入牙本质时，hDPSC通过定向迁移至受损区域，分化为成牙本质细胞，形成三期牙本质以抵御有害的外部刺激，保护牙髓组织[17]。提高牙本质⁃牙髓复合体的防御能力，特别是提高hDPSC的修复再生潜能，或将成为逆转炎症进程的重要治疗策略[18]。本课题组的前期研究显示BA 有效促进LPS诱导的炎症hDPSC成牙/骨分化，提示 BA可能有效修复早期不可逆牙髓炎的牙髓[16]。对于牙髓炎的治疗往往包含两个方面，一是炎症的控制，二是组织功能的恢复。巨噬细胞作为免疫系统的第一道防线，能提呈抗原并释放大量炎症因子，在免疫反应的启动和调节中发挥重要作用[5，19-20]。
图4BA的抗炎作用与自噬激活作用有关
Figure4The anti⁃inflammatory effect of BA is related to the activation of autophagy
本研究从控制炎症、改善功能的角度出发，探讨BA在炎症状态下对巨噬细胞生物学行为的调控作用及机制。BA处理THP⁃1来源的M1型巨噬细胞后，利用RT⁃qPCR、Western blot、免疫荧光等技术发现 BA 可以降低 M1 型巨噬细胞 IL⁃1β和 IL⁃8 的表达，这与之前的研究结果保持一致[21-22]。此外，BA 处理可以降低M1巨噬细胞iNOS的表达，表明BA能抑制巨噬细胞的 M1 型极化，与 Xu 等[23] 的结论相同。本研究注意到 BA 具有自噬调节的作用，这与 Wang 等[24] 的研究结论相似。LC3B⁃Ⅱ、Beclin⁃1 上调和P62蛋白下调等自噬标志物的表达变化证实， BA 可显著增强自噬活性。当使用 3⁃MA 阻断自噬后，BA的抗炎效应被显著抑制，提示其治疗作用可能通过激活自噬而实现。除此之外，提取 BA 处理后的M1巨噬细胞上清液并加入hDPSC，ALP染色与 ARS 染色显示，与 CM⁃M1 组相比，经 BA 处理的 M1 巨噬细胞上清液可以明显增强 hDPSC 矿化能力。 RT⁃qPCR、Western blot 检测发现，CM⁃M1+BA 组成牙/骨相关基因 ALP、RUNX2、DSPP、OPN 和 COL ⁃1 表达上调，证明BA可以通过影响M1型巨噬细胞的生物学行为间接影响hDPSC的成牙/骨分化能力，有助于hDPSC在炎症环境下发挥积极作用，与前期研究相互印证[16]。
图5BA处理的THP⁃1来源的M1巨噬细胞对hDPSC成牙/骨分化的影响
Figure5Effect of BA⁃treated THP⁃1⁃derived M1 macrophages on osteogenic/odontogenic differentiation of hDPSC
在牙髓炎病理进程中，巨噬细胞的生物学行为对炎症转归具有关键调控作用。牙髓暴露后，M1型巨噬细胞迅速募集并启动促炎反应以清除病原体，但过度的M1极化会导致组织损伤[20，25]。巨噬细胞在炎症组织中发挥不同功能的同时表现出不同表型，可分化为 M1 型促炎表型和 M2 型抗炎表型[20]。本研究发现 BA 可有效抑制 M1 极化，但其对 M2 极化的促进作用仍需深入探讨。值得注意的是，近期研究揭示 M2 巨噬细胞外泌体可通过递送 IL⁃10、 TGF⁃β等修复性细胞因子，协同增强hDPSC介导的功能性牙本质复合体再生[26]，这为后续研究 BA 的免疫代谢调控机制提供了重要方向。
近年来，一些研究表明自噬在炎症环境下的牙本质⁃牙髓复合体中发挥作用[27]。有研究指出，LPS 可以促进细胞外基质DSPP和牙本质基质酸性磷蛋白1表达上调，增强成牙细胞分化能力，其机制与增强自噬有关[28-29]。本研究通过 Western blot 技术对常见的自噬相关蛋白进行检测，证明 BA 对巨噬细胞的抗炎作用同样与其自噬激活作用相关。研究表明，BA 可通过 AMPK/mTOR 通路调节细胞自噬[30]，AMPK是调控自噬启动和自噬体形成的中心通路，当细胞内ATP生成减少时，AMPK被激活，可抑制mTORC1并磷酸化ULK1来促进自噬[31]。同时，BA 通过 AMPK/PGC⁃1α增强 NIX 介导的线粒体自噬，调控新的线粒体产生，在炎性疾病中起关键作用[32]。BA调控牙髓炎自噬的机制有待进一步研究。
IL⁃1β在炎症发展过程中起到关键作用[33]，并与牙髓炎疼痛密切相关[34]。本研究中，RT⁃PCR、Western blot以及免疫荧光结果均显示BA可以降低M1型巨噬细胞的IL⁃1β水平，而IL⁃6的mRNA水平无明显改变，这与Xu等[23] 的结果不同。Wang等[35] 通过Meta 分析指出，在部分实验结果中黄酮类药物可降低血清IL⁃6水平，但黄酮类药物组与阳性组相比，IL⁃6水平降低的效果不显著。这可能与以下原因有关： ①检测时间节点的选择不同，炎症组织中，IL⁃6可由 IL⁃1β及 TNF⁃α激活诱导产生[36]，炎症期间 IL⁃6 的升高可能导致负反馈循环，最终导致抑制或终止反应[37]；②尽管IL⁃6被广泛认为是炎症状态的生物标志物，但有研究显示，IL⁃6在许多情况下可调节参与组织修复的 M2 型巨噬细胞的产生，而不是促炎的 M1 型巨噬细胞[38]；③LPS 刺激后，巨噬细胞 IL ⁃6mRNA可通过与RNA结合蛋白（如Arid5a）相结合而稳定，保护其免受核酸酶降解，从而表达更持久[39]。炎症组织中炎症因子的表达及相关信号通路错综复杂，因此有必要检测更多上下游相关因子以明确 BA在牙髓炎中的具体作用机制。
目前氢氧化钙因其具有促矿化及抗菌能力，被视为比较和评价新型盖髓产品的金标准，但长期随访观察发现，氢氧化钙用于直接盖髓治疗的成功率随时间下降[40]。新型盖髓材料具有更好的封闭性和生物相容性，可大大提高盖髓成功率[41]，但椅旁操作时间较长且成本较高。BA具有调控炎症、促进矿化形成的作用，价格相对低廉，有望作为新型盖髓剂应用于临床。目前已有多项研究将BA与多种新型药物释放载体材料如水凝胶[42]、纳米纤维支架[43] 相结合，并证实了其调节炎症和组织再生的效果。水凝胶与不同的光引发剂结合，可在精准给药的同时缩短操作时间[44-45]，为BA应用于牙髓腔内作为活髓保存药物提供了新思路，但其具体效果、机制及如何应用于临床尚需进一步探索与研究。
综上所述，BA可以降低M1型巨噬细胞相关炎症因子的表达，并且可以抑制巨噬细胞的 M1 型极化，间接影响 hDPSC 的成牙/骨分化能力，有助于 hDPSC在炎症环境下发挥积极作用，这一作用可能与BA对巨噬细胞的自噬激活作用相关。
利益冲突声明：
所有作者声明本研究不存在任何利益冲突。
Conflict of Interests：
All authors declare that there is no conflict of interests in this study.
作者贡献声明：
崔闯负责研究概念化、方法学设计、实验实施及论文初稿撰写，参与数据分析与稿件修订。孙思怡、秦梓一、沙颖共同承担数据收集、统计分析、结果验证及图表制作工作。徐海、江飞提供技术指导与研究可行性验证，参与实验设计及稿件修订。张光东主导研究整体设计，稿件提交及学术通信，全程监督研究进程与论文质量。
Author’s Contributions：
CUI Chuang contributed to study conceptualization， methodology design，experimentation，and drafting the initial manuscript；participated in data analysis and manuscript revision. SUN Siyi，QIN Ziyi，and SHA Ying collectively respon⁃ sible for data collection，statistical analysis，result validation， and preparation of figures and tables. XU Hai and JIANG Fei provided technical guidance and feasibility validation for the research；participated in experimental design and manuscript revision. ZHANG Guangdong led the overall research design，managed manuscript submission and academic correspondence， and oversaw the entire research process and manuscript quality.