摘要
目的：探讨Zeste同源物增强子2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）对黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）/丝状肌动蛋白（filamentous actin，F-actin）/活性氧（reactive oxygen species，ROS）通路的调节作用，分析其对结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法：选取河北北方学院附属第一医院行CRC手术切除的患者50例，收集癌组织和癌旁正常组织标本，应用免疫组化法检测EZH2的表达水平，结合临床资料，分析EZH2的表达与临床病理参数及预后生存之间的关系；建立皮下移植瘤CRC裸鼠模型，分为阴性对照（EZH2 NC）组、EZH2过表达（EZH2 mimic）组、EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组，培育14 d后观察肿瘤生长情况。体外培养人CRC细胞系SW480、SW620细胞，采用脂质体转染的方法，将 SW480/SW620 细胞分为 4 组：EZH2 NC 组、EZH2 mimic 组、EZH2 NC+细胞松弛素 D 组和 EZH2 mimic+细胞松弛素D组。通过Western blot实验检测各组细胞中FAK/F-actin/ROS通路相关蛋白的表达情况，应用免疫荧光染色观察F-actin表达和分布，采用划痕、Transwell、CCK-8实验检测细胞迁移、侵袭及细胞活力。ChIP-qPCR实验检测局部FAK、 NADPH 氧化酶 2（NADPH oxidase 2，NOX2）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidaes 4，NOX4）在EZH2上的富集情况。结果：免疫组化检测结果显示，患者CRC组织较癌旁正常组织高表达EZH2（P< 0.05）；EZH2的表达水平与肿瘤的淋巴结转移及远处转移事件密切相关（P 均< 0.05）；生存分析结果显示，低表达 EZH2 CRC 患者的 5 年总生存率显著高于 EZH2 高表达患者（P< 0.05）。皮下移植瘤CRC裸鼠模型建立成功，EZH2 mimic组肿瘤体积明显大于EZH2 NC组（P< 0.05），细胞松弛素D干预后， EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组肿瘤体积分别较EZH2 NC组、EZH2 mimic组明显减小（P均 < 0.05），但两组间差异无统计学意义（P> 0.05）。EZH2 mimic 组EZH2、p-FAK、p-Paxillin、NOX2、NOX4和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）蛋白表达水平明显高于 EZH2 NC 组（P< 0.05），而 RUNX 家族转录因子 3（RUNX family transcription factor 3，RUNX3）蛋白表达水平稍低于 EZH2 NC 组（P< 0.05），且 F-actin 分布数量、迁移能力和细胞活力增加（P< 0.05）。 EZH2、p-FAK和p-Paxillin蛋白表达水平较未干预组差异无统计学意义（P> 0.05），NOX2、NOX4和p-JNK蛋白表达水平较未干预组则明显降低（P< 0.05），RUNX3蛋白表达水平较未干预组明显增加（P< 0.05），而干预的两组间差异无统计学意义（P> 0.05）； 此外，细胞松弛素D干预后F-actin分布数量、迁移能力和细胞活力均显著降低，而干预的两组间差异无统计学意义（P> 0.05）。 ChIP-qPCR实验结果显示，使用EZH2抗体后，FAK、NOX2、NOX4所富集的启动子含量均显著升高（P< 0.05）。结论：EZH2可通过上调FAK/F-actin/ROS通路活性进而促进CRC细胞的增殖、侵袭和转移。
Abstract
Objective：To explore the regulatory effect of the enhancer of Zeste homolog 2（EZH2）on the focal adhesion kinase （FAK）/filamentous actin（F-actin）/reactive oxygen species（ROS）pathway，and to analyze its effect on the proliferation，invasion，and metastasis of colorectal cancer（CRC）cells. Methods：Tissue samples from 50 patients undergoing CRC resection at the First Affiliated Hospital of Hebei North University were collected，including both cancer tissues and adjacent normal tissues. Immunohistochemistry was used to detect EZH2 expression，and clinical data were analyzed to determine the correlation between EZH2 expression and clinicopathological parameters as well as survival prognosis. A subcutaneous xenograft model using CRC nude mice was established， dividing the mice into the negative control（EZH2 NC）group，EZH2 overexpression（EZH2 mimic）group，EZH2 NC+cytochalasin D group，and EZH2 mimic+cytochalasin D group. After 14 days of cultivation，the tumor growth was observed. Human CRC cell lines SW480 and SW620 cells were cultured in vitro and divided into the same four groups using lipofection. Western blot was used to detect the expression of FAK，F-actin，and ROS pathway-related proteins. Immunofluorescence staining was used to observe F-actin expression and distribution. Wound healing，transwell，and CCK -8 assays were used to assess cell migration，invasion，and viability. ChIP -qPCR was used to detect the enrichment of FAK，NADPH oxidase（NOX）-2，and NOX4 on EZH2. Results：Immunohistochemistry analysis showed the expression levels of EZH2 were significantly higher in CRC tissues than in adjacent normal tissues（P< 0.05）. EZH2 expression levels were closely associated with lymph node metastasis and distant transfer events（all P< 0.05）. The analysis of follow-up data showed that the 5 - year overall survival rate of CRC patients with low EZH2 expression was significantly higher than that of patients with high EZH2 expression，with a statistically significant difference（P< 0.05）. The subcutaneous CRC xenograft model was successfully established，with the EZH2 mimic group showing significantly larger tumor volumes than that of the EZH2 NC group（P< 0.05）. Post cytochalasin D intervention，both EZH2 NC+cytochalasin D and EZH2 mimic+cytochalasin D groups showed significantly reduced tumor volumes compared with the untreated groups（P< 0.05），though no significant difference was noted between the two intervention groups（P> 0.05）. The expression levels of EZH2，p-FAK，p-Paxillin，NOX2，NOX4，and p-JNK proteins in the EZH2 mimic group were significantly higher than those in the EZH2 NC group（P< 0.05），while the expression levels of RUNX family transcription factor 3（RUNX3）protein were slightly lower than that in the EZH2 NC group（P< 0.05）. The number of F-actin distribution，migration ability，and cell viability increased in the EZH2 mimic group than in the EZH2 NC group. After the intervention of cytochalasin D，there was no significant difference in the expression levels of EZH2，p-FAK，and p-Paxillin proteins compared with the untreated group（P> 0.05），while the expression levels of NOX2，NOX4，and p-JNK proteins were significantly decreased（P< 0.05），and the expression levels of RUNX3 protein were significantly increased compared with the untreated group（P< 0.05）. There was no significant difference between the two intervention groups（P> 0.05）. In addition，the number of F-actin distribution，migration ability，and cell viability were significantly decreased in the intervention groups，with no significant difference between the two groups （P> 0.05）. The results of the ChIP-qPCR assay showed that after using the EZH2 antibody，the promoter contents enriched by FAK， NOX2，and NOX4 were significantly increased，respectively（P< 0.05）. Conclusion：EZH2 promotes the proliferation，invasion，and metastasis of CRC cells by upregulating the activity of the FAK/F-actin/ROS pathway.
Keywords
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的严重危害人类生命的消化系统恶性肿瘤[1]。CRC 在女性和男性中发病率分别位居第 2 位和第 3 位。尽管诊断和治疗方法有所改进提升，但40%~50%的 CRC 患者会出现肿瘤的复发转移进而导致预后不良[2]。因此，明确CRC发生和转移的分子机制，开发有效的 CRC 生物标志物和改进治疗策略是目前临床研究的重点。
Zeste同源物增强子2（enhancer of Zeste homolog2，EZH2）在细胞周期进程[3]、自噬和凋亡[4] 以及DNA 损伤修复[5] 中发挥重要作用，EZH2是多梳抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的核心成分。越来越多的证据表明EZH2与多种癌症相关，包括鼻咽癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌[6-8]。此外，EZH2 过表达提示肿瘤更具侵袭性，与预后不良有关[9-10]。
近年来，多项研究表明 EZH2 在 CRC 中的表达水平与肿瘤的进展密切相关。EZH2 的过表达与 CRC 的细胞增殖能力增强、侵袭转移倾向增加、化疗耐药性以及不良预后有关。EZH2在CRC中的作用机制被认为是通过沉默多个抑癌基因如钙黏蛋白E（E⁃cadherin，E⁃Cad）、周期蛋白依赖的激酶抑制剂（p16INK4a，p16）等，促进肿瘤细胞的表型转化，如从上皮型转化到间质型，从而增强了肿瘤的侵袭能力[11]。此外，EZH2 还能调节 Wnt/β⁃catenin、 MAPK和PI3K/AKT等信号通路，进一步影响肿瘤细胞的生物学活性[12-13]。在其他癌症中，EZH2的异常表达和功能失调同样与肿瘤的进展密切相关。例如在乳腺癌中，EZH2通过抑制雌激素受体α（estrogen receptor，ERα）信号通路，增强细胞的增殖和侵袭能力[14]；在前列腺癌中，EZH2 通过调节雄激素受体 （androgen receptor，AR）信号通路和促进上皮⁃间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT），增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[15]；在肺癌中，EZH2通过沉默抑癌基因和调节EMT相关基因，促进肿瘤的侵袭和化疗耐药性[16]。这些机制表明EZH2在多种癌症类型中具有广泛作用，是潜在的治疗靶点。
研究证实EZH2增加了整合素β1编码ITGB1的转录，从而激活下游效应物局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）。活化的FAK磷酸化转化生长因子β受体Ⅰ（transforming growth factor⁃β⁃receptorⅠ， TGF⁃βRⅠ），增强 TGF⁃βRⅠ与 TGF⁃βRⅡ的结合，激活转化生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β， TGF⁃β）信号通路[17]。FAK是整合素介导的细胞和细胞外基质（extracelluar matrixc，ECM）之间信号转导的重要介质，作为多种致癌酪氨酸激酶结合位点的支架蛋白，通过磷酸化调节桩蛋白（paxillin，PXN） 功能，诱导多种细胞过程，包括黏附、迁移、侵袭和转移[18-19]，促进丝状肌动蛋白（filamentous actin， F⁃actin）重新聚合，进而诱导氧化应激反应。活性氧 （reactive oxygen species，ROS）主要由线粒体产生，已被证明可以介导调节细胞生长、分化、增殖和凋亡所需的信号级联反应的激活[20]。
本团队在前期研究中已经证实 EZH2 在直肠癌组织中呈异常高表达，与 Runt 相关转录因子 3 （runt⁃related transcription factor 3，RUNX3）表达呈负相关，且二者在局部进展期直肠癌的一线化疗方案 XELOX新辅助化疗疗效评估中可作为重要的监测指标[21]，但EZH2的具体作用机制尚不明确。据此，本研究通过分析 EZH2 通过调控 FAK/F⁃actin/ROS 通路活性进而对结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移的影响，从而为结直肠癌的靶向治疗提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 样本收集
选取2017年1月—2018年12月河北北方学院附属第一医院收治的50例行CRC手术的患者。纳入标准：①确诊为CRC，且术前未行放化疗、免疫治疗；②手术中可获取癌组织（癌灶中心处）和癌旁正常组织（距离癌组织>10 cm且经病理证实为正常组织）；③年龄35~80周岁；④具有基本理解和表达能力；⑤自愿加入研究，且具有完整的病例资料及随访信息。排除标准：①合并其他癌症或患有严重心、脑、肺部疾病；②认知障碍或精神疾病的患者； ③已入组类似研究者。本研究获得河北北方学院附属第一医院伦理委员会的批准与监督（批准号： 2024063）。
1.1.2 实验动物
SPF 级 6~8 周龄健康 BALB/c⁃nu 裸鼠 24 只，体重16~20 g，雌性，购自河南斯克贝斯生物科技有限公司。实验期间自由进食和饮水，动物房恒温 24℃，相对湿度60%。BALB/c⁃nu 裸鼠饲养于河北北方学院附属第一医院动物实验室。在本研究中实验步骤严格遵守3R原则。本研究已通过河北北方学院实验动物福利伦理审查（ 伦理批号： K2021019）。
1.1.3 细胞与试剂
人CRC 细胞系SW480细胞和SW620细胞购自中国科学院（上海）细胞库。封闭山羊血清（北京 Solarbio 公司）；DAB 显色剂、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司）；EZH2抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，Gemini 公司，美国）；DMEM培养基、青霉素⁃链霉素（10 000 U/mL）、无血清培养基、Opti⁃MEM 减血清培养基（赛默飞世尔科技公司，美国）；RIPA 裂解液、CCK⁃8 试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；PVDF 膜 （Millipore公司，美国）；BCA蛋白质定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；细胞松弛素D（F⁃actin 抑制剂）、抗荧光淬灭封片剂（MedChemExpress 公司，美国）；EZH2 抗体、DAPI、Triton X⁃100（Sigma⁃ Aldrich 公司，美国）；p⁃FAK 抗体、p⁃Paxillin 抗体、 NOX2 抗体、NOX4 抗体、RUNX3 抗体、p ⁃JNK 抗体、GAPDH 抗体（Abcam 公司，美国）；罗丹明⁃鬼笔环肽染色液（北京索莱宝科技有限公司）；激光共聚焦显微镜（Leica 公司，德国）；Transwell 小室 （Corning 公司，美国）；EZH2 过表达载体和空载体 （GenePharma 公司，希腊）；编码 EZH2 的慢病毒表达载体（pLVX ⁃Puro）和空载体对照（Invitrogen 公司，美国）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
SW480 细胞和 SW620 细胞在含有 10% FBS 和 1%青霉素⁃链霉素的 DMEM 培养基中培养，置入 37℃、5% CO2的加湿培养箱中，每 24 h 更换 1 次培养基。待细胞密度>70%时，用0.25%胰蛋白酶进行传代。下述实验均采用第3代细胞进行实验。
1.2.2 免疫组化检测
收集人体结直肠癌组织和癌旁标本组织，先经 10%福尔马林溶液固定48 h，然后依次进行组织脱水、透明、浸蜡处理，将蜡块切成 6 μm 厚的切片，置于 65℃烤箱中烤片 1 h。接着二甲苯脱蜡 15 min，乙醇梯度性脱水（100%乙醇浸泡 10 min，95%乙醇浸泡 10 min，80%乙醇浸泡 10 min），然后用 1×PBS 缓冲液冲洗 10 min，一共冲洗 3 次，采用离心机， 100 r/min 10℃，离心 10 min。后加入 3% H2O2室温孵育10 min，然后1×PBS缓冲液冲洗后甩干水分，加入5%山羊血清（山羊血清+PBS），37℃封闭15 min。进行一抗二抗孵育及DAB溶液显色，将切片置于显微镜下观察染色合适即可停止染色，清水冲洗5 min。进行苏木精复染，自来水冲洗5 min，1%盐酸酒精分化3 s，自来水冲洗5 min，脱水透明后滴加适量中性树胶封片。使用Image J软件对免疫组化图像进行鉴定和分析，并计算结直肠癌和癌旁标本组织的阳性率。评价标准：深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。
1.2.3 慢病毒感染
慢病毒颗粒使用 Lenti⁃X HT 包装系统制备。将细胞以4×105 个/孔的数量接种于添加了 10% FBS 的DMEM的6孔板中。培养24 h后，细胞汇合度约为 50%~70%，将培养基换成900 μL无血清DMEM。慢病毒在 Opti⁃MEM中连续稀释，以获得10~100的不同MOI。每孔加入总共100 μL 稀释的慢病毒并培养24 h，更换培养基并培养72 h，含嘌呤霉素的培养基用于选择转导细胞。EZH2 mimic组使用EZH2过表达慢病毒感染SW480细胞与SW620细胞。
将 SW480、SW620 细胞分为 4 组：EZH2 NC 组， EZH2 mimic组，EZH2 NC+细胞松弛素D（0.1 μg/mL） 组，EZH2 mimic+细胞松弛素D（0.1 μg/mL）组。
1.2.4 裸鼠模型建立及分组
将 24 只 6~8 周龄健康裸鼠随机分成 EZH2 NC 组、EZH2 mimic 组、EZH2 NC+细胞松弛素 D 组和 EZH2 mimic+细胞松弛素D组，每组各6只。取转染 3代后的SW480细胞150 μL（含1×107 个细胞）接种于裸鼠左侧腋下。自接种当日起每天观察裸鼠状态及肿瘤生长情况。裸鼠一般状况良好，在接种后 14 d观察到注射部位皮下有直径2~3 mm的肿瘤，表示接种成功[22]。每天观察裸鼠状态、死亡情况及肿瘤生长情况，测量皮下移植瘤的最大长径（a）和横径 （b），计算移植瘤的体积。
1.2.5 Western blot检测
用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液从SW480 细胞中提取总蛋白，然后用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。使用 10% SDS⁃PAGE 对蛋白质进行分离，将分离的蛋白质转移到 PVDF 膜上，用 5%脱脂牛奶封闭后，用稀释的一抗EZH2抗体（1∶1 000）、 p ⁃FAK 抗体（1∶1 000）、p ⁃Paxillin 抗体（1∶1 000）、 NOX2抗体（1∶5 000）、NOX4抗体（1∶1 000）、RUNX3 抗体（1∶1 000）、p⁃JNK 抗体（1∶1 000）和 GAPDH 抗体（1∶1 000）分别 4℃孵育过夜，TBST 洗涤 3 次，加入相应二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次。使用ECL 系统检测蛋白表达，Image J 软件进行灰度值分析，计算蛋白的表达量。
1.2.6 免疫荧光染色
SW480细胞培养24 h，PBS洗涤3次后，室温下 4%多聚甲醛中固定15 min，然后使用0.5% TritonX⁃ 100通透15 min。加入提前配制好的鬼笔环肽染色工作液，室温孵育30 min后，PBS清洗3次，用DAPI 溶液复染细胞核，滴加抗荧光淬灭封片剂封片，置于激光共聚焦显微镜下观察并分析荧光图像。
1.2.7 细胞划痕实验
将 SW480 细胞和 SW620 细胞接种于 96 孔板上，待细胞密度达 90%时，使用无菌枪头在细胞层上划痕，PBS 清洗 3 次后，去除划下的细胞，加入无血清培养基，置于 37℃、5% CO2的培养箱中培养，在 0、48 h 置于显微镜下观察并拍照，划痕宽度用 Image J软件计算。
1.2.8 Transwell实验
细胞饥饿12 h后，将各组转染后的SW480细胞和 SW620 细胞以 5×104 个/孔加入含有 200 μL 无血清培养基的 Transwell 小室中，下室加入 600 μL 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，37℃孵育 48 h 后，用棉签去除上室内残留的细胞，膜下表面细胞用 2%结晶紫染色。在显微镜下取 5 个不同视野进行拍照，并计数膜下表面的细胞数量，取平均值。
1.2.9 CCK⁃8实验
将 SW480 细胞和 SW620 细胞以 2×103 个/孔的浓度培养于96孔板中，并置于培养箱中培养。在0、24、48 h分别向每孔加入10 μL CCK⁃8溶液，避光孵育4 h。使用全自动酶标仪测量450 nm处的光密度 （OD）值。
1.2.10 ChIP⁃qPCR实验
ChIP⁃qPCR程序根据试剂制造商提供的说明进行。用1%甲醛固定SW480细胞以交联染色质。然后通过超声处理将染色质碎裂。使用 IgG、EZH2 的ChIP级抗体富集蛋白质染色质片段。洗涤以去除非特异性结合和污染物后，洗脱并纯化染色质片段。然后使用基于 GEO 数据库的 ChIP⁃seq 数据设计的引物，对纯化的 DNA 片段进行靶向特定基因组区域的 qPCR。这种方法允许定量纯化的 DNA 片段中靶基因区域的富集。引物序列如下：FAK （forward）：5′ ⁃ CCATGCCCTCGAAAAGCTATG ⁃ 3′， FAK（reverse）：5′ ⁃ TGACGCATTGTTAAGGCTTCT ⁃ 3′；NOX2（forward）：5′⁃TCCGCATCGTTGGGGACTG⁃ GA⁃3′，NOX2（reverse）：5′⁃CCAAAGGGCCCATCAA⁃ CCGCT⁃3′；NOX4（forward）：5′⁃TATCCAGTCCTTCC⁃ GTTGG⁃3′，NOX4（reverse）：5′⁃CCAATTATCTTCTG⁃ TATCCCATCTG⁃3′。
1.3 统计学方法
数据分析采用SPSS 19.0软件，服从正态分布或近似正态分布的数据以均数±标准差（）表示，两组间差异采用 t 检验进行分析，多组之间比较采用单因素方差分析，计数资料以频数（百分比）形式表示，组间比较采用卡方检验（当理论频数<5时，使用 Fisher确切概率法），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EZH2在人CRC组织中的表达及与临床病理特征之间的关系
免疫组化结果显示，EZH2 在 CRC 癌组织中的阳性表达率为 72.00%（36/50 例），明显高于癌旁正常组织38.00%（21/50例）（图1），采用R×C列联表卡方检验分析显示：EZH2 在癌组织与癌旁组织中的表达分布存在显著差异（χ2 =9.180，P<0.05）。进一步通过R×C列联表分析发现，EZH2的表达状态（阳性/阴性）与肿瘤的淋巴结转移、远处转移均存在统计学关联（P<0.05）。此外，高表达EZH2的CRC患者5年生存率（41.38%）明显低于低表达EZH2的患者（58.62%）（P<0.05，表1）。
图1CRC患者癌旁组织（A）和癌组织（B）中EZH2的表达
Figure1Expression of EZH2 in adjacent normal tissues（A） and tumor tissues（B）of CRC patients
表1EZH2表达水平与CSC患者临床病理特征之间的关系
Table1Correlation between EZH2 expression levels and clinicopathological features of CSC patients
2.2 裸鼠肿瘤生长情况
相对于 EZH2 NC 组，EZH2 mimic 组中 EZH2 的相对蛋白表达量显著升高（P=0.007）。裸鼠荷瘤实验结果显示，EZH2 mimic 组肿瘤体积明显大于 EZH2 NC 组（P=0.002），经细胞松弛素 D 干预的肿瘤体积较之前明显减小，但两组间差异无统计学意义（P=0.063），提示 EZH2 促进肿瘤的生长 （图2）。
图2EZH2对裸鼠肿瘤生长的影响
Figure2Effect of EZH2 on tumor growth in nude mice
2.3 各组 SW480 细胞中 EZH2、p⁃FAK 和 p⁃Paxillin 蛋白表达情况
Western blot 结果显示，EZH2 mimic 组 EZH2、 p⁃FAK 和 p⁃Paxillin 蛋白表达水平明显高于 EZH2 NC 组，差异有统计学意义（P 均 <0.001）。加入细胞松弛素 D 干预后，EZH2 NC+细胞松弛素 D 组和 EZH2 mimic+细胞松弛素 D 组 EZH2、p⁃FAK 和 p⁃Paxillin蛋白表达水平较未加细胞松驰素D差异无统计学意义（P>0.05），EZH2 mimic+细胞松弛素D 组 EZH2、p⁃FAK 和 p⁃Paxillin 蛋白表达水平明显高于 EZH2 NC+细胞松弛素 D 组，差异有统计学意义 （P均<0.01），提示EZH2可活化磷酸化的FAK 通路 （图3）。
2.4 免疫荧光染色观察F⁃actin表达和分布
免疫荧光染色结果显示：EZH2 mimic组F⁃actin 分布数量明显多于EZH2 NC组，差异有统计学意义 （P<0.01），加入细胞松弛素D干预后，EZH2 NC+细胞松弛素 D 组和 EZH2 mimic+细胞松弛素 D 组 F⁃ actin分布数量较未加细胞松驰素D明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），但两组间差异无统计学意义（P>0.05），EZH2 NC+细胞松弛素 D 组和 EZH2 mimic+细胞松弛素 D 组 F⁃actin 分布数量较之前明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），表明 EZH2 可促进F⁃actin重新聚合（图4）。
2.5 细胞划痕实验检测各组SW480细胞和SW620 细胞的迁移能力
细胞划痕实验结果显示：EZH2 mimic组SW480 细胞划痕距离明显比 EZH2 NC 组窄（P<0.05），加入细胞松弛素D干预后，EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组细胞划痕距离较未加细胞松驰素D明显变宽（P<0.05），两组间差异无统计学意义（P>0.05）。SW620细胞中也得到类似结果。上述结果提示EZH2可促进SW480和SW620 细胞的迁移能力（图5）。
图3EZH2对FAK/F⁃actin通路相关蛋白的影响
Figure3Effect of EZH2 on the FAK/F⁃actin pathway related proteins
图4EZH2对SW480细胞F⁃actin的影响
Figure4Effects of EZH2 on F⁃actin in SW480 cells
2.6 Transwell 实验检测各组 SW480 细胞和 SW620 细胞迁移能力
Transwell实验结果显示：EZH2 mimic组SW480 细胞迁移数目明显多于 EZH2 NC 组（P<0.05），加入细胞松弛素D干预后，EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组细胞迁移数目较来前细胞松驰素D明显减少（P<0.05），两组间差异无统计学意义（P>0.05）。SW620细胞中也得到类似结果实验结果表明 EZH2 可促进 SW480 细胞和 SW620细胞的迁移能力（图6）。
图5EZH2对SW480细胞和SW620细胞迁移能力的影响
Figure5Effect of EZH2 on the migration ability of SW480 cells and SW620 cells
2.7 各组 SW480 细胞中 NOX2、NOX4、RUNX3 和 p⁃JNK蛋白表达情况
Western blot 结果显示：EZH2 mimic 组 NOX2、 NOX4和p⁃JNK蛋白表达水平均明显高于EZH2 NC 组，但RUNX3蛋白表达水平降低差异均有统计学意义（P均 <0.05）。加入细胞松弛素D干预后，EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D 组NOX2、NOX4和p⁃JNK蛋白表达水平较未加细胞松驰素 D 明显降低，RUNX3 蛋白表达水平明显增加，差异均有统计学意义（P 均 <0.05），而 EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组两组间则差异无统计学意义（P>0.05）。表明EZH2 可通过 F⁃actin 诱导氧化应激反应进而促进细胞增殖和RUNX3降解（图7）。
2.8 CCK⁃8检测SW480细胞和SW620细胞活力
CCK⁃8实验结果显示细胞培养24 h和48 h后， EZH2 mimic 组 SW480 细胞活力明显高于 EZH2 NC 组，差异有统计学意义（P<0.05）；加入细胞松弛素D干预后，EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+ 细胞松弛素D组48 h细胞活力较24 h明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），而EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组两组间则差异无统计学意义（P>0.05）；EZH2 mimic 组 SW620 24 h细胞活力明显高于EZH2 NC组，且随着时间的延长，差异增大（P<0.05）；加入细胞松弛素D干预后，48 h EZH2 NC+细胞松弛素D组和EZH2 mimic+ 细胞松弛素D组细胞活力较24 h明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），而EZH2 NC+细胞松弛素D 组和EZH2 mimic+细胞松弛素D组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。实验结果表明 EZH2 可促进 SW480细胞和SW620细胞活力（图8）。
图6EZH2对SW480细胞和SW620细胞迁移能力的影响
Figure6Effects of EZH2 on the migration ability of SW480 cells and SW620 cells
2.9 ChIP ⁃ qPCR 实验检测 FAK、NOX2、NOX4 在 EZH2上的富集
ChIP⁃qPCR 实验结果显示，与使用 IgG 抗体相比，使用 EZH2 抗体后富集 FAK、NOX2、NOX4 启动子含量升高（P<0.01），表明 EZH2 可以富集在 FAK、NOX2、NOX4的启动子上（图9）。
3 讨论
CRC是全球第3大最常见的癌症类型，也是导致癌症相关死亡的第2大常见原因[23]。近年来，有效的癌症筛查和预防措施的发展成功地改善了局部CRC治疗结果，但远处转移到重要器官和术后复发是导致CRC患者死亡的主要原因。
EZH2是一种组蛋白甲基转移酶，是PRC2在靶基因启动子处的H3K27me3活性所必需的酶，导致表观遗传沉默。在许多实体瘤中，EZH2 表达或活性升高是疾病进展和转移的标志[24-26]。EZH2可以激活 Smad3 介导的 TGF⁃β信号通路[27]，TGF⁃β通过整合素β3 或β1 激活 FAK。FAK 和 Src 在基质金属蛋白酶的产生和F⁃actin重新聚合中发挥关键作用，导致肿瘤侵袭[28]。Paxillin 是局灶黏附凋亡相关因子（factor⁃related apoptosis，FAs）的主要成分，可在其第118位酪氨酸残基处被FAK磷酸化，在细胞外信号转导到细胞内反应中起重要作用，由整合素与 ECM 结合触发，参与细胞内信号级联反应，这些途径的激活最终导致 F⁃actin 重新聚合和细胞黏附、扩散和迁移。F⁃actin作为细胞的关键结构网络，具有高度动态性，支持细胞的生长、增殖、迁移和存活等[29-30]。F⁃actin还可以诱导氧化应激反应[31]，细胞代谢过程中产生的 ROS 在凋亡组织中积累并触发 JNK 的激活[32-33]，进而促进细胞增殖。相关研究表明，氧化应激反应可以抑制人结肠癌细胞RUNX3的激活[34]，RUNX3作为肿瘤抑制因子，不仅参与肿瘤形成，在细胞生长、胚胎发育、免疫调节等方面也发挥着关键作用[35-36]。
图7EZH2对ROS通路相关蛋白的影响
Figure7Effect of EZH2 on ROS pathway⁃related proteins
图8EZH2对SW480细胞（A）和SW620细胞（B）活力的影响
Figure8Effects of EZH2 on SW480（A）and SW620 cell（B）viability
本研究发现EZH2的高表达参与结直肠癌的发生发展，其表达水平与肿瘤的淋巴结转移和远处转移密切相关；此外，通过生存分析示，EZH2 的高表达提示患者预后不良。
本研究的重点是 EZH2 在 CRC 增殖、侵袭和转移中的作用。通过建立裸鼠皮下移植瘤模型观察肿瘤生长情况发现，与EZH2 NC组相比，EZH2 mimic 组肿瘤体积明显较大，经细胞松弛素D干预后肿瘤体积明显减小，说明 EZH2 促进了肿瘤生长。通过对 SW480 细胞转染后进行不同干预后检测发现， EZH2 mimic 组 EZH2、p ⁃ FAK、p ⁃ Paxillin、NOX2、 NOX4 和 p ⁃JNK 蛋白表达水平明显高于 EZH2 NC 组，RUNX3蛋白表达水平稍低于EZH2 NC组，F⁃actin 分布数量增加。细胞松弛素D干预后，EZH2、p⁃FAK 和 p⁃Paxillin 蛋白表达水平无明显改变，但 NOX2、 NOX4和p⁃JNK蛋白表达水平较无细胞松弛素D干预组明显降低，而RUNX3蛋白表达水平明显增加，且干预的两组间则差异无统计学意义，以上结果表明EZH2可能通过上调FAK/F⁃actin/ROS通路活性，诱导RUNX3的降解进而发挥促肿瘤生长的作用。
图9ChIP⁃qPCR检测EZH2富集到的FAK（A）、NOX（2 B）、NOX（4 C）启动子情况
Figure9ChIP⁃qPCR detection of FAK（A），NOX（2 B），and NOX（4 C）promoters enriched by EZH2
细胞划痕、Transwell迁移和CCK⁃8实验结果显示，与EZH2 NC组相比，EZH2 mimic组两种细胞的迁移能力和细胞活力均有增加，细胞松弛素D干预后，迁移能力和细胞活力降低，说明 EZH2 可促进 SW480 细胞和 SW620 细胞的迁移能力和细胞活力。本研究表明，EZH2可能通过上调FAK/F⁃actin/ ROS通路活性进而促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移（图10）。
本研究结果与既往文献中关于EZH2在其他类型癌症中的作用机制基本一致。如Zhou等[37] 在乳腺癌中发现 EZH2 通过上调 FAK 和 Src 的活性，促进细胞迁移和侵袭。另一研究显示，EZH2 在肝癌中通过激活 TGF⁃β信号通路，促进 EMT 和肿瘤转移[38]。然而，本研究还发现了一个新的机制，即 EZH2 通过上调 ROS 水平，间接抑制 RUNX3 的激活，从而促进CRC细胞的增殖和侵袭。这一发现扩展了对EZH2在CRC中作用机制的理解，并为未来的治疗提供了新的靶点。
图10EZH2靶向FAK/F⁃actin/ROS通路机制示意图
Figure10Schematic diagram of the mechanism of EZH2 targeting FAK/F⁃actin/ROS pathway
基于 EZH2 在 CRC 中的重要作用，开发针对 EZH2的抑制剂可能成为一种新的治疗策略。已有研究表明，EZH2抑制剂在多种癌症模型中显示出良好的抗肿瘤效果。例如，EZH2抑制剂Tazemetostat在临床试验中已经显示出对某些实体瘤的疗效[39]。未来的研究可以进一步验证这些抑制剂在CRC中的应用效果，并探讨其与现有治疗方法的联合应用潜力。此外，EZH2的表达水平也可能成为CRC患者的预后标志物，有助于早期诊断和个体化治疗方案的选择。
尽管本研究表明 EZH2 通过 FAK/F ⁃actin/ROS 通路在CRC中发挥重要作用，但仍有许多问题需要进一步探讨。首先，需要更详细地阐明 EZH2 如何上调ROS水平，以及这一过程的具体分子机制。其次，EZH2是否还有其他下游靶点，这些靶点在CRC 中的作用也值得进一步探讨，这也是本课题组未来的研究方向。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
All authors declare no conflict of interest.
作者贡献声明：
刁庆飞进行数据分析和结果解读，并撰写手稿。张昊、杨春白雪、樊建春、武雪亮和路永刚招募患者，并收集患者样本和数据。韩磊申请了资助，并对本研究进行设计和监督。
Author’s Contributions：
DIAO Qingfei conducted data analysis and interpretation of results，and wrote the manuscript. ZHANG Hao，YANG Chun⁃ baixue，FAN Jianchun，WU Xueliang，and LU Yonggang recruit⁃ ed patients and collected patient samples and data. HAN Lei applied for funding and designed and supervised this study.