摘要
目的：探究circ_0003633在肺腺癌细胞奥希替尼耐药中的作用。方法：通过对奥希替尼耐药细胞和敏感细胞进行 circRNA测序，筛选出在耐药细胞中显著高表达的circ_0003633，在奥希替尼耐药细胞中敲低circ_0003633的表达，通过CCK-8 实验、Transwell和集落形成实验研究circ_0003633在肺腺癌奥希替尼耐药细胞中的作用，利用RNA pulldown、转录组测序及生信分析筛选下游靶基因及信号通路。结果：circ_0003633在奥希替尼耐药细胞中显著高表达，敲低circ_0003633的表达可以显著增加奥希替尼耐药细胞对奥希替尼的敏感性，circ_0003633可以与RNA结合蛋白hnRNPA1结合并调控下游靶基因ALDOC 发挥生物学功能。结论：circ_0003633在奥希替尼耐药细胞中显著高表达，与hnRNPA1结合并调控下游靶基因ALDOC，激活 PI3K/AKT信号通路，促进肺腺癌细胞对奥希替尼的耐药，可作为逆转耐药的潜在靶点。
Abstract
Objective：To explore the role of circ_0003633 in osimertinib resistance of lung adenocarcinoma cells. Methods：By performing circRNA sequencing on osimertinib-resistant and sensitive cells，circ_0003633 was identified as significantly highly expressed in the resistant cells. The expression of circ_0003633 was knocked down in osimertinib-resistant cells，and its role in osimertinib-resistant lung adenocarcinoma cells was investigated through CCK - 8 assay，Transwell assay and colony formation assay. RNA pulldown assay，transcriptome sequencing and bioinformatics analysis were used to screen downstream target genes and signaling pathways. Results：circ_0003633 was significantly highly expressed in osimertinib-resistant cells. Knockdown of circ_0003633 enhanced the sensitivity of resistant cells to osimertinib. circ_0003633 bound to RNA-binding protein hnRNPA1 and regulated the downstream target gene ALDOC to exert its biological functions. Conclusion：circ_0003633 is highly expressed in osimertinib-resistant cells，binds to hnRNPA1，and regulates the downstream target gene ALDOC，thereby activating the PI3K/AKT signaling pathway to promote the resistance of lung adenocarcinoma cells to osimertinib. It may serve as a potential therapeutic target for reversing drug resistance.
Keywords
在我国，肺癌的发病率和病死率均居于恶性肿瘤首位[1]，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是所占比例最高的组织亚型[2]。奥希替尼，一种第 3 代、不可逆的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）⁃酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI），选择性抑制 EGFR 敏感突变和 T790M 耐药突变，已被推荐为 LUAD 的标准疗法[3]。FLAURA 试验证明，相比第 1 代 EGFR⁃TKI，奥希替尼显著延长了EGFR突变阳性的晚期肺癌患者的无进展生存期（progression free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）[4]。然而，最初对奥希替尼有反应的患者在经历10.0~18.9个月的治疗后会逐渐出现获得性耐药，致使肿瘤再次进展[5]。已知的各种耐药机制包括 EGFR 依赖性机制如 G719X、G796X、C797S 等突变[6]，EGFR 非依赖性机制如组织学表型转化、旁路途径激活（Met 扩增、 HER2扩增、IGF1R 激活）、NRAS/KRAS 突变和致癌融合基因（RET、ALK、BRAF）[7]。然而，仍有 40%~50%的耐药机制尚不清楚[8]。因此，明确奥希替尼耐药机制对于完善治疗策略和改善预后至关重要。
环状RNA（circRNA）是一种独特的具有闭环的 RNA分子，由前体 mRNA 的反向剪切形成[9]，可以作为癌基因或抑癌基因调节各种癌症的发生发展，并通过不同的分子机制参与抗癌药物耐药性，包括微小 RNA（micorRNA，miRNA）海绵作用、蛋白质相互作用以及转录或转录后调控[10]。例如， circ_0000199 通过干扰 mir ⁃ 206/613 主导的 PI3K/ AKT/mTOR 信号通路促进三阴性乳腺癌的化疗耐药[11]，circ_PPAPDC1A 通过海绵 miR⁃30a⁃3p/IGF1R 通路促进非小细胞肺癌奥希替尼耐药[12]。在人体不同组织中发现了多种类型的 circRNA，表现出高丰度、显著稳定性和组织特异性表达的独特特征。这些特性，加上其在血浆等液体活检样本中的可检测性，使circRNA 成为癌症诊断和预后生物标志物的理想选择[13]。
本课题组前期对奥希替尼敏感细胞和耐药细胞进行 circRNA 测序，筛选出差异倍数高的 circ_ 0003633，并进行 qRT⁃PCR 验证，明确 circ_0003633 在奥希替尼耐药细胞中上调，且目前尚无关于circ_ 0003633的生物学功能研究及其参与奥希替尼耐药相关报道。本研究旨在揭示circ_0003633在肺腺癌细胞奥希替尼耐药中的作用，期望其能在今后临床治疗过程中成为逆转耐药的潜在靶点。
1 材料和方法
1.1 材料
HCC827、H1975 细胞（上海中科院细胞所）； HCC827/OR、H1975/OR由本课题组诱导；磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol3⁃ kinase，PI3K）抗体 （CST 公司，美国）；蛋白激酶 B（protein kinase B， AKT）抗体（武汉爱博泰克有限公司）；醛糖还原酶C （aldolase C）抗体（武汉爱博泰克有限公司）；Tubulin 抗体、β⁃actin抗体（武汉三鹰有限公司）；CCK⁃8试剂盒（Cat：K1018，APExBio 公司，美国），SYBR Green qPCR 试剂盒（Cat：AG11705，湖南艾克瑞生物有限公司）；ECL发光液、BCA蛋白含量检测试剂盒（合肥白鲨有限公司）；脱脂奶粉（武汉翌圣生物科技有限公司）；辣根过氧化物标记的鼠、兔二抗（武汉三鹰有限公司）；奥希替尼（MCE生物科技公司，美国）。
1.2 方法
1.2.1 核质分离
用PBS将细胞清洗2遍，用胰酶进行消化，消化后收集细胞进行离心，结束后弃掉上清，向每个离心管中加入300 μL 10%NP⁃40裂解液，裂解20 min 后，逐一滴加入1 mL的蔗糖buffer（10%NP⁃40裂解液体积的1.5倍），4℃、3 500 g离心10 min，吸取上清（胞质）转移至新的离心管中；使用含 0.5 mol/L EDTA的PBS进行清洗，4℃、3 500 g离心10 min，重复2次，弃掉上清，获得的沉淀即为核沉淀，分别向细胞核和细胞质的管中加入1 mL TRIzol，按照提取 RNA 的方法进行 RNA 提取，使用 qRT⁃PCR 对核质进行检测。
1.2.2 CCK⁃8实验
将瞬时转染24~48 h后的细胞消化后吹匀，取少量进行细胞计数，根据计数结果，按照每孔2 000个细胞种入96孔板中，每组4个复孔；根据计算公式配置成细胞悬液，每孔200 μL细胞悬液加入96孔板中，然后6 h后细胞贴壁，按照RPMI1640∶CCK⁃8=9∶1配置好混合试剂，弃掉培养基，每孔加入100 μL混合试剂，放入培养箱等待2 h后，使用分光光度计测量450 nm 处的吸光度值，连续5 d在同样的时间点进行测定。
1.2.3 集落形成实验
取各组处于对数生长期的细胞，胰酶消化后进行计数，配制成细胞悬液，按照每孔500个细胞加入 6 孔板中，每孔加入 2 mL 完全培养基，6 孔板置于 37℃、5%CO2培养箱中培养2周。当出现肉眼可见的克隆时，甲醇固定15 min，用0.1%结晶紫（Sigma⁃ Aldrich公司，美国）染色30 min后进行计数。
1.2.4 Transwell实验
将瞬时转染 24~48 h 后的细胞消化后吹匀，计数后制成细胞悬液，上室每孔300 μL细胞悬液，下室加入含10%胎牛血清的条件培养基，37℃培养箱孵育24 h后，取出小室，用甲醇固定15 min，用0.1% 结晶紫（Sigma⁃Aldrich 公司，美国）染色30 min后用棉球擦去内表面细胞，置于显微镜下观察计数。
1.2.5 实时定量PCR（qRT⁃PCR）
总 RNA 提取用 TRIzol 试剂（TaKaRa 公司，日本）提取，用 NanoDrop2000（Thermo Fisher 公司，美国）分析 RNA 浓度。使用 PrimeScriptTM RT 试剂盒 （TaKaRa公司，日本）进行反转录，采用SYBR qPCR Master Mix（湖南艾克瑞生物公司）进行 qRT⁃PCR。相对表达量采用 2-ΔΔCT法计算。所用引物序列见表1。
1.2.6 慢病毒感染
分别构建circ_0003633敲降和过表达慢病毒载体（上海吉玛基因），将待感染细胞铺到6 cm培养皿中，待细胞汇合度达 60%~70%时，加入 1 mL 病毒液，再加入3 μL聚凝胺，37℃孵育48 h后换液，继续培养，嘌呤霉素筛选后进行后续实验。
表1PCR引物序列
Table1Primer sequences for PCR
1.2.7 Western blot
将转染48 h后的细胞消化后离心，用PBS重悬后再次离心后弃上清，加入细胞裂解液裂解30 min，使用BCA法测定总浓度，然后在SDS⁃PAGE凝胶电泳中分离蛋白质样品并湿转到PVDF 膜上，之后用 5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，封闭结束后孵育一抗（抗体稀释比1∶1 000），4℃摇床过夜，第2天TBST洗膜后与二抗（抗体稀释比1∶10 000）室温孵育1 h，最后使用ECL发光液在凝胶成像系统中进行曝光。
1.2.8 RNA pulldown
RNA pulldown实验参考PierceTM磁性RNA⁃蛋白 pulldown试剂盒说明书，首先RNA探针（50 pmol）和磁珠（50 μL）结合，然后再进行RNA⁃蛋白绑定、洗脱，洗脱结束后加入蛋白上样缓冲液进行后续实验。
1.2.9 银染
银染实验参考试剂盒说明书，按照固定、30%乙醇洗脱、水洗涤、增敏、水洗涤、银染、水洗涤、显色、终止、水洗涤步骤进行。
1.3 统计学方法
实验数据使用GraphPad Prism软件进行统计分析和绘图。所有数据经正态性检验后以均数±标准差（）表示。两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间样本差异使用单因素方差分析，P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 circ_0003633在奥希替尼耐药细胞中高表达
本课题组前期在奥希替尼敏感的EGFR19外显子缺失突变的肺腺癌细胞系HCC827和EGFR21外显子 L858R 突变以及 T790M 突变的肺腺癌细胞系 H1975中通过奥希替尼药物浓度递增成功诱导了奥希替尼耐药细胞株 HCC827/OR 和 H1975/OR，显微镜下均可观察到同亲本细胞不同的形态，与亲本细胞相比，耐药细胞更加扁平并伸出伪足（图1A）。分别检测HCC827、HCC827/OR和H1975、H1975/OR细胞对奥希替尼的半抑制浓度（IC50值），相比亲本细胞，耐药细胞的 IC50值显著升高（图1B）。本课题组前期对 HCC827、HCC827/OR 和 H1975、H1975/ OR细胞进行了circRNA 测序，发现与HCC827细胞相比，circ_0003633 在 HCC827/OR 细胞中显著高表达，测序结果已发表[14]。针对测序结果筛选出的 circ_0003633进行进一步研究，通过qRT ⁃PCR 验证 circ_0003633在耐药细胞系中显著高表达（图1C）。
2.2 验证circ_0003633的环状结构
为了进一步研究 circ_0003633 的相关特性，利用生物信息学方法（circBase 和 CIRCpedia）进行分析，发现circ_0003633是1个796 nt的circRNA，位于 3号染色体，即位于RYK 基因位点，由其7~13号外显子背向剪切形成（图2A）。使用专门设计用于验证 circ_0003633 环形结构的发散和收敛引物，仅在 cDNA中成功扩增，而发散引物在gDNA无法检测到相应的条带，证实了 circ_0003633 的环状结构（图2B）。同时，使用RNase R外切酶消化细胞的RNA也证实了circ_0003633含有circRNA结构，比线性亲本基因 RYK 具有更强的抵抗 RNase R 外切酶的作用 （图2C）。此外，通过核质分离实验（图2D）和FISH实验（图2E）检测了circ_0003633的亚细胞定位。结果显示circ_0003633在细胞质和细胞核中均有分布。
图1circ_0003633在耐药细胞中高表达
Figure1circ_0003633 is highly expressed in drug⁃resistant cells
图2验证circ_0003633的环状结构及亚细胞定位
Figure2Verify the ring structure and subcellular localization of circ_0003633
2.3 circ_0003633促进耐药细胞增殖迁移及对奥希替尼耐药
为了研究circ_0003633对肺腺癌奥希替尼耐药性的影响，设计了特异性小干扰序列（si⁃RNA）。转染 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞，qRT⁃PCR 检测细胞中 circ_0036333 的敲降效率，差异有统计学意义 （图3A）。si⁃circ_0003633⁃1#敲降效率最高，后续实验用1#小干扰序列进行。发现在奥希替尼耐药细胞中敲低 circ_0003633 的表达，耐药细胞对奥希替尼的IC50下降40%（图3B）。CCK⁃8实验结果表明，敲低 circ_0003633 后，HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞的增殖能力都显著下降，敲低 circ_0003633 并联用奥希替尼后，细胞的增殖能力进一步下降（图3C），随后集落形成实验也和 CCK⁃8 实验结果一致 （图3D）。Transwell实验可以反映细胞的迁移能力，与转染si⁃NC的细胞相比，敲低circ_0003633后两株细胞的迁移能力都下降，联用奥希替尼后，细胞的迁移能力进一步下降（图3E）。
接着，构建了 circ_0003633 的全长质粒转染细胞，并通过qRT⁃PCR 检测过表达效率，其结果差异有统计学意义（图4A）。随后，集落形成实验表明，过表达 circ_0003633 后细胞的增殖能力上升，联用奥希替尼后，细胞集落形成的数量并无明显差异 （图4B）。Transwell实验结果表明，与转染空载的细胞相比，过表达 circ_0003633 的细胞迁移能力明显增加，过表达联用奥希替尼后，对细胞的迁移能力并无影响（图4C）。
2.4 circ_0003633 与 hnRNPA1 蛋白相互作用并参与细胞对奥希替尼的耐药过程
为了进一步分析circ_0003633可能的的下游调控机制，使用靶向circ_0003633的生物素标记探针，进行RNA pulldown实验来寻找与circ_0003633结合的蛋白。通过对银染和质谱结果的分析，发现了其中一种RNA结合蛋白hnRNPA1（图5A），利用West⁃ ern blot 对产物进行验证（图5B），这些结果表明 circ_0003633 与 hnRNPA1 结合。Western blot 实验表明敲低 circ_0003633 并没有从蛋白水平改变 hnRNPA1的表达，这说明hnRNPA1与circ_0003633 的结合并不影响hnRNPA1的表达（图5C）。
基于以上实验，进一步分析hnRNPA1对奥希替尼耐药性的影响。设计了hnRNPA1的小干扰序列并利用qRT⁃PCR和Western blot验证敲降效率，结果显示hnRNPA1明显被敲低（图6A、B）。si⁃hnRNPA1⁃1#的敲降效率高，后续实验用 1#小干扰序列进行。在 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞中转染 si⁃NC、 si⁃hnRNPA1⁃1#，CCK⁃8和集落形成实验结果显示，与si⁃NC组相比，敲低hnRNPA1后抑制细胞的增殖，联用奥希替尼后，抑制作用更加显著（图6C、D）， Transwell 实验结果显示，与 si ⁃ NC 组相比，敲低 hnRNPA1 后抑制细胞迁移能力，联用奥希替尼后，细胞的迁移能力进一步下降（图6E）。
2.5 circ_0003633/hnRNPA1共同调节ALDOC 的表达并参与奥希替尼的耐药过程
为了更好地研究circ_0003633参与奥希替尼耐药进展的详细机制，对敲低了 circ_0003633 的奥希替尼耐药细胞进行 RNA 测序分析。根据 RNA⁃seq 结果，选择表达变化前7位的基因进行进一步研究，通过 qRT ⁃PCR 在 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞中验证7个基因的表达变化，在敲低circ_0003633后的 2株细胞中只有ALDOC同时降低（图7A）。Western blot 分析表明，敲低 circ_0003633 后 ALDOC 的蛋白水平也明显下降（图7B），这与qRT⁃PCR结果一致。稳转细胞中结果与瞬时转染一致（图7C）。基于以上结果，选择ALDOC作为下游靶基因。ENCORI网站预测显示，无论是肺鳞癌还是肺腺癌，hnRNPA1与 ALDOC之间相互作用呈正相关（图7D），随后在2株细胞系中敲低 hnRNPA1，进行 qRT ⁃PCR 和 Western blot 实验，结果显示 ALDOC 随着 hnRNPA1 蛋白和 mRNA水平的下降而下降（图7E、F）。
为了探究 circ_0003633 通过哪些通路发挥作用，根据 RNA⁃seq 结果进行 GO 功能富集分析，发现与 PI3K/AKT 信号通路密切相关（图8A），通过 Western blot 进行验证，结果发现敲低 circ_0003633 后 PI3K/AKT 通路中的关键蛋白 p⁃PI3K、p⁃AKT 都明显下降，联用奥希替尼后，p⁃PI3K、p⁃AKT的蛋白表达进一步下降，而 PI3K 和 AKT 蛋白水平无明显变化（图8B）。
为了继续研究ALDOC在奥希替尼耐药细胞中的作用，在 HCC827/OR 和 H1975/OR 细胞中敲低 ALDOC，并利用qRT⁃PCR验证敲降效率，si⁃ALDOC⁃1# 敲降效率最高（图9A），后续实验用1#小干扰序列进行。CCK⁃8和集落形成实验结果表明，敲低ALDOC 后，耐药细胞的增殖能力下降，在敲低ALDOC联合奥希替尼作用下，细胞增殖能力进一步下降（图9B、 C）。Transwell 实验结果显示，与对照组相比，敲低 ALDOC后细胞迁移能力下降，联用奥希替尼后，迁移能力进一步下降（图9D）。
3 讨论
EGFR突变存在于40%~60%的东亚LUAD患者中[15]。靶向EGFR突变的小分子EGFR⁃TKI改善了这些患者的预后和治疗结果。奥希替尼是一种不可逆的第 3 代 EGFR ⁃ TKI，已被批准用于 EGFRT790M 阳性且既往 EGFR ⁃TKI 进展的患者[16]。此外，奥希替尼作为EGFR突变的晚期非小细胞肺癌 （non⁃small cell lung cancer，NSCLC）的一线治疗显示出良好疗效。然而，获得性耐药的出现是不可避免的[17]，而耐药机制尚未完全阐明，因此了解奥希替尼获得性耐药的机制具有重要意义。
图3敲低circ_0003633后对奥希替尼耐药细胞增殖、迁移及奥希替尼敏感性的影响
Figure3The effect of knockdown of circ_0003633 on the proliferation，migration and osimertinib sensitivity of osimertinib⁃ resistant cells
图4过表达circ_0003633后对耐药细胞的影响
Figure4Effect of overexpression of circ_0003633 on drug⁃resistant cells
图5circ_0003633与hnRNPA1结合
Figure5circ_0003633 binds to hnRNPA1
图6hnRNPA1促进耐药细胞增殖迁移
Figure6hnRNPA1 promoted the proliferation and migration of drug⁃resistant cells
图7circ_0003633与hnRNPA1共同影响ALDOC表达
Figure7circ_0003633 and hnRNPA1 jointly affected the expression of ALDOC
circRNA是封闭的内源性非编码RNA（non⁃cod⁃ ing RNA，ncRNA），是共价封闭的连续环，没有5′帽结构和3′聚腺苷化的尾部，由于其结构的原因，它比线性RNA更稳定。长期以来，circRNA被认为是基因组中异常RNA剪接或噪声的低丰度副产物[18]。然而，越来越多的证据表明circRNA在癌症的发生、发展以及耐药中发挥重要作用[19]。本研究针对课题组前期测序结果筛选出在耐药细胞中高表达的 circ_0003633 进行进一步的生物学功能和机制研究。在奥希替尼耐药细胞中敲低circ_0003633的表达可以增加耐药细胞对奥希替尼的敏感性，同时抑制耐药细胞的增殖和迁移。
为了进一步探究circ_0003633对肺腺癌细胞奥希替尼耐药的潜在分子机制，设计了生物素标记的 circ_0003633 探针，通过 RNA pulldown 实验联合质谱发现了能够与 circ_0003633 相互作用的蛋白 hnRNPA1，并且circ_0003633与hnRNPA1结合并不影响hnRNPA1的表达[20]。hnRNPA1是一种来自异质核核糖核蛋白（hnRNP）家族的RNA结合蛋白，是该家族中最丰富和最普遍表达的成员，已被证明参与驱动恶性转化的多个分子事件[21] 和耐药[22]。敲低hnRNPA1后，耐药细胞的增殖和迁移能力下降，联合奥希替尼后，细胞的增殖和迁移能力进一步下降。接着通过 RNA 测序寻找下游靶基因，并通过 qRT⁃PCR、Western blot分析表明，敲低circ_0003633 后，ALDOC 的 mRNA 和蛋白表达显著下降。敲低 hnRNPA1后，ALDOC的mRNA和蛋白表达也显著下降，说明 ALDOC 受 circ_0003633 和 hnRNPA1 的共同调节。ALDOC是醛醇酶家族成员之一，近年来研究表明ALDOC的异常表达和易位促进了肿瘤的进展和相关信号转导[23]。在耐药细胞中敲低ALDOC后发现细胞的增殖和迁移能力下降，联合奥希替尼后，细胞的增殖和迁移能力进一步下降。最后，将RNA测序结果进行GO功能富集分析，发现与PI3K/AKT信号通路密切相关，已有多个报道证明，circRNA 可以通过激活 PI3K/AKT 信号通路促使肿瘤耐药的发生[11-12]，进一步 Western blot 实验验证发现敲低 circ_0003633后p⁃PI3K、p⁃AKT的表达水平下降，联合奥希替尼后p⁃PI3K、p⁃AKT的表达水平进一步下降。说明 circ_0003633 可能通过激活 PI3K/AKT 信号通路参与耐药发生。
图8circ_0003633通过PI3K/AKT信号通路发挥作用
Figure8circ_0003633 exerted its effect through the PI3K/AKT signaling pathway
图9ALDOC促进耐药细胞增殖迁移
Figure9ALDOC promoted the proliferation and migration of drug⁃resistant cells
综上所述，circ_0003633促进了肺腺癌奥希替尼耐药细胞的增殖、迁移及耐药，其发挥作用的可能机制是 circ_0003633 与 hnRNPA1 结合促进 ALDOC 的表达，并激活PI3K/AKT信号通路，这将为逆转奥希替尼耐药提供新的靶点。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
The authors declare no competing interests.
作者贡献声明：
张鸽负责细胞实验以及论文撰写；陈昕负责RNA测序、验证实验和论文修订；顾婧瑶负责生信分析和论文修订；王朝霞负责实验设计、论文修订及定稿和资金支持。
Author’s Contribution：
ZHANG Ge was responsible for cell experiments and paper writing；CHEN Xin was responsible for conducting RNA se⁃ quencing，performing verification experiments，and revising the manuscript；GU Jingyao was responsible for bioinformatics anal⁃ ysis and thesis revision；WANG Zhaoxia was responsible for the experimental design，revision and finalization of the paper，as well as financial support.