摘要
目的：HE染色评估组织病理学特征、初筛实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR）阳性率高的标本，快捷、准确、经济地诊断肺结核。方法：回顾性分析189例肺肉芽肿疾病患者的临床资料和CT征象，采用苏木精-伊红 （hematoxylin-eosin，HE）染色对甲醛固定、石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）标本初筛后行Ziehl-Neelsen（Z-N） 抗酸染色和qPCR检测进一步验证。结果：189例标本根据CT征象可分为两组：周围型结节组多表现为肺门纵隔淋巴结肿大 （87/149，58.4%）、分叶征（66/149，44.3%）和毛刺征（63/149，42.3%）；中央型占位组主要征象为支气管阻塞（31/40，77.5%）、肺不张（29/40，72.5%）。这些征象与肿瘤性病变难以区分，常导致诊断延误。95例确诊肺结核标本的HE染色结果显示：坏死面积百分比≥25%（χ2 =41.649，P < 0.001）、肉芽肿最大直径≥8 mm（χ2 =8.071，P=0.004）与qPCR阳性结果呈正相关。二元Logistic回归分析显示，肺结核坏死面积百分比和肉芽肿最大直径是 qPCR 阳性的独立预测因子（OR=1.324，95%CI：1.202~1.460，P < 0.001；OR=0.265，95%CI：0.164~0.429，P < 0.001）。在肺结核FFPE标本中，坏死面积百分比检测qPCR阳性结果的曲线下面积、灵敏度、特异度分别为0.794、78.2%、78.9%，而肉芽肿最大直径检测qPCR阳性结果的曲线下面积、灵敏度、特异度则分别为0.600、88.5%和43.7%。结论：外周型结节CT征象表现为肺门及纵隔淋巴结肿大、分叶征和毛刺征时，更容易引起肺结核等肉芽肿性疾病的延误诊断；坏死面积和肉芽肿最大直径测量可提高qPCR检测的灵敏度，通过HE染色初筛选择优质标本进行检测，可提高结核病诊断的准确性。
Abstract
Objective：To screen specimens with high qPCR positive rates based on hematoxylin and eosin（HE）histopathological characteristics for the rapid，accurate，and economical diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods：A retrospective analysis was conducted on the clinical data and CT findings of 189 patients with pulmonary granulomatous disease. Formalin-fixed paraffin-embedded（FFPE）specimens were initially screened by HE staining，followed by Ziehl -Neelsen（Z -N）staining and qPCR assay for further verification. Results：Based on CT findings，189 specimens were divided into two groups：the peripheral nodular group predominantly showed hilar and mediastinal lymphadenopathy（87/149，58.4%），lobulation sign（66/149，44.3%），and spiculation sign （63/149，42.3%）；and the central occupancy group mainly exhibited bronchial obstruction（31/40，77.5%）and atelectasis（29/40， 72.5%）. These findings were often indistinguishable from neoplastic lesions，leading to delayed diagnoses. HE staining results from 95 confirmed pulmonary tuberculosis specimens revealed that the percentage of necrotic area ≥25%（χ2 =41.649，P < 0.001）and the maximum diameter of granulomas ≥8 mm（χ2 =8.071，P=0.004）were correlated with qPCR positivity. Binary logistic regression analysis showed that the percentage of necrotic area and the maximum diameter of granulomas in pulmonary tuberculosis were independent predictors of qPCR positivity（OR=1.324，95%CI：1.202-1.460，P < 0.001；OR=0.265，95%CI：0.164-0.429，P < 0.001）.In FFPE specimens of pulmonary tuberculosis，the area under the curve，sensitivity，and specificity of the necrotic area percentage for qPCR positive results were 0.794，78.2% and 78.9%，while for the maximum diameter of granulomas were 0.600，88.5%，and 43.7%， respectively. Conclusion：When CT findings of peripheral nodules show hilar and mediastinal lymphadenopathy，lobulation sign，and spiculation sign，they are more likely to delay diagnosis of granulomatous diseases such as pulmonary tuberculosis. The measurement of necrotic area and the maximum diameter of granulomas can improve the sensitivity of qPCR detection. Preliminary screening with HE staining to select high-quality specimens for testing can enhance the accuracy of tuberculosis diagnosis.
结核病（tuberculosis，TB）是结核分枝杆菌 （Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种空气传播疾病，通常会影响肺部，导致严重的咳嗽、发烧和胸痛[1]。尽管在疫苗接种、治疗和诊断方面取得了进展，但TB仍然是全球健康面临的巨大挑战[2]。早期诊断对于有效切断疾病传播和提高治疗效果至关重要[3-5]。
包括TB在内的肺肉芽肿类疾病的早期筛查主要依赖于胸部影像学检查，但部分病变并不典型，表现出多样性，与恶性肿瘤难以鉴别。因此，支气管内超声引导下经支气管针吸活检（endobronchial ultrasound ⁃ guided transbronchial needle aspiration， EBUS ⁃TBNA）、经皮肺穿刺活检（percutaneous nee⁃ dle lung biopsy，PNLB）或手术切除肺肉芽肿类标本在肺结核的诊断中具有重要意义。这些标本提供了详细的组织学信息，有助于识别结核特征性病变[6]。
对石蜡包埋（formalin⁃fixed paraffin⁃embedded， FFPE）标本进行抗酸染色是 TB 病理诊断的传统金标准之一[7-8]。该方法通过在显微镜下观察石蜡切片中抗酸杆菌的存在来确诊结核感染。它对样本质量要求较高，如果样本中细菌数量较少或细菌分布不均，可能会导致结果不可靠[9]。显微镜下观察染色阳性标本，很难区分 MTB 和非结核分枝杆菌 （nontuberculous mycobacteria，NTM），因为这两种分枝杆菌都耐酸且形态相似[10]。因此，抗酸染色在肺组织 FFPE 标本上的检测灵敏度和特异度非常低，其结果的判定也取决于技术人员的主观判断[11-12]。因此，在典型的TB诊断流程中，虽然抗酸染色通常作为初筛手段，但需要后续的分子检测技术复核以明确最终的诊断结果。
随着分子检测技术的发展，实时荧光定量PCR （real ⁃time fluorescent quantitative PCR，qPCR）被引入TB检测中[13]。针对仅存在于MTB中的插入元件 IS6110 靶基因的 qPCR 检测具有特异性高、检测周期短、能够区分混合感染、不需要生物安全 3 级设施、相对容易自动化操作等优点[14-16]。但在实际操作过程中，研究人员也发现并不适合所有类型的标本[17-18]，选择不恰当的蜡块检测将导致最终结果不可靠，造成诊断延迟，且由于其成本相对较高，增加了TB患者的经济负担。
HE 染色是组织病理学中最常用的方法，具有典型结核特征的标本可以通过常规HE染色进行可靠的TB推定诊断，观察组织切片，可以识别出TB的一些特征性病理改变，包括肉芽肿形成、干酪样坏死、朗汉斯巨细胞、纤维化等[19]。由于HE染色主要用于显示组织结构和炎症反应，而不是直接检测 MTB，在TB初始筛查中具有很高的敏感性[20]。且操作简单、成本低廉，适用于大规模筛查和初步诊断，在资源有限的环境中尤为实用，能够快速提供初步诊断信息，从而决定是否需要进一步检测。
基于上述背景，本研究选择189例因CT征象不典型、未取得呼吸道分泌物标本或分泌物标本MTB 检测结果为阴性而行EBUS⁃TBNA、PNLB或外科手术的肉芽肿疾病患者，采用 HE 染色对其进行初始筛查，筛选出149例具有TB典型特征的标本行Ziehl⁃ Neelsen（Z⁃N）抗酸染色和qPCR检测；同时，通过HE 染色观察TB标本的特征性病理改变，分析这些病理特征与 qPCR 结果之间的相关性。旨在通过 HE 染色筛选出具有典型 qPCR 阳性特征的标本，直接进行 qPCR 检测，从而简化诊断步骤，降低成本，提高诊断的准确性和效率，并提出一种快捷、准确、经济的TB诊断流程。
1 对象和方法
1.1 对象
对南京医科大学附属脑科医院（南京市胸科医院）2020年1月—2022年12月189例经EBUS⁃TBNA、 PNLB或外科手术的肉芽肿疾病患者的临床和影像学资料进行回顾性分析，从病理科获得组织蜡块用于本研究。纳入标准：胸部CT提示肺部异常，但缺乏典型 TB 表现（TB 的典型胸部 CT 表现包括斑块、空洞影、结节、树芽征、纤维条纹、继发性支气管扩张、多发钙化、空洞形成，而继发性支气管扩张、多发性钙化、空洞形成等好发于上叶尖段或后段及下叶背段，多种形态的病变共存）[21]，与肿瘤不能鉴别者；临床表现无典型的 TB 症状如咳嗽、咳痰、咯血及发热等；缺乏痰、肺泡灌洗液等呼吸道分泌物 MTB 检测或检测结果为阴性。组织标本来源于 EBUS⁃TBNA、PNLB 或外科手术。本研究经南京医科大学附属脑科医院（南京胸科医院）伦理委员会批准（2024⁃KY026⁃01），符合赫尔辛基宣言及其后来的修正案。
1.2 方法
1.2.1 Z⁃N抗酸染色
石蜡包埋组织切片厚度为 4 μm，在 37℃下贴片、干燥、烘烤，二甲苯脱蜡2次，每次5 min，去离子水冲洗2 min；37℃石炭酸红染色液染色30 min，染色过程中观察染色液的液位；去离子水冲洗2 min； 5%盐酸乙醇分化液分化2~3 s，直至切片无色；去离子水冲洗 2 min；美蓝溶液重新染色 20 s；去离子水冲洗2 min；常规脱水、干燥、封片。阳性染色结果为 MTB 呈鲜红色，细长状，微弯曲的杆状或念珠菌样堆状或散在分布，红细胞呈粉红色，细胞核和背景呈浅蓝色。
1.2.2 HE染色初筛和评估
两名病理医生检查HE染色切片，评估7个组织病理学参数：干酪样坏死面积百分比（坏死的脱细胞粉红色区域伴有核团状碎片≥25%或<25%），每切片肉芽肿的数目和大小（最大直径≥8 mm或<8 mm），融合性肉芽肿（多个大小较一致的肉芽肿结节呈融合性生长），离散性肉芽肿（边界分明，大部分上皮样组织细胞与肉芽肿形状一致），上皮样组织细胞带（上皮样组织细胞聚集在坏死的外层），分别评估并记录肉芽肿周围淋巴细胞聚集和朗汉斯巨细胞 （图1）。
使用 Image J 软件对 HE 染色后的切片进行分析。将图像导入软件，利用软件测量工具，在适当放大倍数下，选取需要测量的染色区域进行自动计算并记录相关数据。对于复杂的组织结构，两位资深病理医生采用手动勾勒边界的方式进行精准测量，以确保获取准确的染色面积数据。
图1qPCR阳性病例的病理组织学特征（HE，×200）
Figure1Histopathological parameters of qPCR positive samples（HE，×200）
1.2.3 qPCR检测
按照说明书，用 E.Z.N.A. FFPE DNA 试剂盒 （Omega Bio⁃Tek公司，美国）提取DNA，然后用MTB 复合体核酸检测试剂盒（厦门致善公司）检测。本试剂盒采用 qPCR 法检测 MTB 特异性插入序列 IS6110 基因。将两端标记有荧光发光基因和淬灭基因的寡核苷酸探针加入PCR系统中，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的产物，同时实时监测荧光值变化，通过有无扩增信号来判断是否存在 MTB。PCR 反应条件为：37℃10 min；95℃ 10 min； 95℃ 10 s，71℃ 15（s 每个循环下降1度），78℃ 15 s， 10 个循环；95℃ 15 s，61℃ 15 （s 收集荧光信号）， 78℃ 15 s，45次循环。
结果判断：若检测样本的靶基因在用于检测 MTB 基因的 6 ⁃羧基荧光素（6 ⁃ carboxyfluorescein， FAM）通道中有明显的S型扩增曲线，所得Ct值≤25，则判定为阳性，若Ct值>25或无扩增信号，则判定为阴性。
1.3 统计学方法
采用SPSS25.0软件进行统计学分析，进行卡方检验（校准卡方检验）和二元Logistic回归分析，受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC） 曲线分析曲线下面积（area under curve，AUC）、诊断灵敏度和特异度。采用四格表进行Kappa同一性检验，计算灵敏度、特异度、阳性预测值（positive pre⁃ dictive value，PPV）、阴性预测值（negative predictive value，NPV）。Kappa值≤0.20、>0.20~0.40、>0.40~0.60、 >0.60~0.80和>0.80分别被认为是轻微、一般、中等、实质性一致和几乎完全一致。 P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床特征
在研究期间，189 例患有肺肉芽肿疾病的患者接受了支气管镜检查或外科手术，年龄24~80岁，中位年龄为61岁。男119例（63.0%，119/189），女70例 （37.0%，70/189），男性患者比例高于女性。
观察并记录了189例患者的胸部CT表现，根据胸部 CT 表现分为两个亚组，即周围型结节组（n= 149）和中央型占位组（n=40）。94/189例（49.7%）的病灶位于TB的典型发病部位，73/189（38.6%）的患者病灶出现在多个节段，符合TB特征，但TB常见的 CT 表现如空洞（7/189，3.7%）、局限性支气管扩张 （10/189，5.3%）、卫星灶（0/189，0%）、树芽征（0/189， 0%）却很少见。而肺门纵隔淋巴结肿大的比例很高 （111/189，58.7%）。
两种不同亚组之间，周围型结节组多表现为肺门纵隔淋巴结肿大（87/149，58.4%），其次为分叶征 （66/149，44.3%）和毛刺征（63/149，42.3%），部分患者可伴有胸膜凹陷征（41/149，27.5%）和胸腔积液 （35/149，23.5%）；少数病例有肺不张（22/149， 14.8%）、支气管阻塞（16/149，10.7%）、局限性支气管扩张（10/149，6.7%）及血管集束征（4/149，2.7%）；中央型占位组的表现主要为支气管阻塞（31/40， 77.5%）、肺不张（29/40，72.5%），部分患者有肺门纵隔淋巴结肿大（24/40，60.0%），少数患者有毛刺征 （4/40，10.0%）及分叶征（3/40，7.5%）。这些特征往往让医生忽视了某些TB征象，如病变位于TB好发区、多节段分布等，从而优先考虑肿瘤性疾病（表1）。
表1患者胸部CT特征
Table1Chest CT features of patients
*：Predilection sites were apical⁃posterior segment of the upper lobe and the dorsal segment of the lower lobe.
2.2 HE染色初筛结果
189 例肺肉芽肿疾病患者中，周围型结节组以外科手术为主 128 例（128/149，85.9%），其次为 PNLB（21/149，14.1%）；中央型占位组以EBUS⁃TBNA 为主（31/40，77.5%），少数为PNLB（9/40，22.5%）。
采用 HE 染色进行组织病理学初筛，149 例 （78.8%，149/189）具备典型的结核性标本特征，包括干酪样坏死的肉芽肿，或存在上皮样细胞/多核巨细胞，判定为疑似结核感染，待进一步验证。其余 40例分别为非结核感染性肉芽肿：异物肉芽肿2例 （5.0%，2/40），反应性多核巨细胞增生11例（27.5%， 11/40），胆固醇结晶形成5例（12.5%，5/40），其他急慢性非特异性炎22例（55.0%，22/40）（图2）。
2.3 Z⁃N抗酸染色与qPCR法检测MTB与临床诊断的比较
表2总结了 149 例通过 HE 初筛、疑似为 TB 标本，经Z⁃N抗酸染色和qPCR检测的结果。根据病理检测结果，Z⁃N抗酸染色和qPCR均为阳性结果确诊 54例；在这两项检测之一为阴性的患者中，临床医生结合患者的影像学特征、临床表现、既往经验判断以及患者对诊断性抗结核治疗反应良好的原则确诊TB 41例。临床最终确诊95例TB阳性、54例TB阴性。
以临床诊断作为参考标准，从诊断效率来看， qPCR 检测的灵敏度、特异度、PPV、NPV 分别为 80.0%、96.3%、97.4%和 73.2%，高于 Z⁃N 抗酸染色 （分别为 56.8%，42.6%，63.5%和 35.9%），各组数据之间的差异均有统计学意义（P <0.001）。qPCR检测与临床最终确诊结果的一致性（kappa=0.71）较高。
图2189例肺肉芽肿病例经HE染色初筛情况（HE，×100）
Figure2Initial screening results of HE staining for 189 cases of pulmonary granulomatous diseases（HE，×100）
2.4 qPCR阳性组的组织病理学特征
基于 HE 染色的 qPCR 阳性和阴性组的组织病理学特征（表3），发现坏死面积百分比≥25%（χ2 = 41.649，P <0.001）、肉芽肿最大直径≥8 mm（χ2 = 8.071，P=0.004）与qPCR阳性的相关性更高，差异有统计学意义（表3，图3）。其他病理特征如融合性肉芽肿、离散性肉芽肿、上皮样组织细胞带、淋巴细胞聚集和朗汉斯巨细胞对qPCR结果无显著影响。因此，测量和计算坏死面积百分比和肉芽肿最大直径有助于预测qPCR结果。
表2与临床诊断相比，Z⁃N 抗酸染色和qPCR检测的灵敏度、特异度、PPV、NPV和一致性
Table2Sensitivity，specificity，PPV，NPV，and agreement of Z⁃N staining and qPCR detection compared with clinical diagnosis
Z⁃N：Ziehl⁃Neelsen staining；qPCR：real⁃time fluorescent quantitative PCR；+：positive result；-：negative result；PPV：positive predictive value； NPV：negative predictive value.
表3qPCR阳性组与阴性组的组织病理特征比较
Table3Comparison of histopathologic parameters between qPCR positive and negative groups
2.5 组织病理学特征与qPCR诊断敏感性的相关性分析
为进一步证实组织病理特征对qPCR结果的影响，进行了相关分析（图4）。坏死面积百分比和肉芽肿最大直径与 qPCR 阳性结果有显著相关性 （OR=1.324，95%CI：1.202~1.460；OR=0.265，95%CI： 0.164~0.429）。Hosmer⁃Lemeshow 检验结果吻合较好（χ2 =10.227，P>0.05）。这些结果表明，这两种组织病理学特征可能对TB诊断有辅助作用。
2.6 坏死面积百分比及肉芽肿最大直径的检测效率分析
如图5所示，坏死面积百分比的AUC 为0.794，灵敏度为 78.2%，特异度为 78.9%，95%CI 为 0.717~0.871（P <0.001）。肉芽肿最大直径的 AUC 为0.60 0，灵敏度为 88.5%，特异度为 43.7%，95%CI 为 0.505~0.694（P=0.036）。以上结果表明，坏死面积百分比和肉芽肿最大直径对qPCR阳性具有较高的诊断效能，可作为qPCR检测TB的辅助诊断指标。
图3测量并计算每张HE切片中坏死面积百分比以及肉芽肿最大直径
Figure3Measurement and calculation of necrotic area percentage and the maximum diameter of granu⁃ lomas on each HE piece
3 讨论
不典型的CT特征常引起肺部肉芽肿性感染的延误诊断[22]。招募的 189 例经 EBUS⁃TBNA、PNLB 或外科手术的肉芽肿疾病患者，因放射学表现呈现出分叶征、毛刺征、肺门及纵隔淋巴结肿大等提示恶性肿瘤的特征，而感染相关的其他显著征象如条索影、卫星灶、树芽征、钙化等并不明确，而被首先怀疑为肺癌，诊断过程中缺少呼吸道分泌物的MTB 检测结果或检测结果为阴性；其中，40例为中央型肿块，事先完成了支气管镜检查和PNLB，另外149例患者中，21例行PNLB，其余接受了外科手术治疗。
MTB 是全世界最常见的肺肉芽肿病因，但一些组织病理学检测结果发现，肉芽肿和坏死也在其他许多疾病中发现，包括异物、结节病、真菌感染等[23]，此外，根据呼吸系统病理标本的检查及取材规范，肺组织活检和穿刺标本应全部取材，手术切除标本中，较小的病灶尽量完整切除；对于较大的病变，要从病变中心及边缘多部位取材，以全面反映病变情况[24]，每一个病例需制作2~10个对应的甲醛固定、石蜡包埋标本。然而MTB在每个石蜡标本间、甚至同一个石蜡标本的不同切片间的分布并不均匀，因此，在每个病例的数张切片中初筛疑似TB感染的标本，针对性进行后续 qPCR 检测，对提高 TB 的诊断效率和准确性尤为重要。
图4组织病理学参数与qPCR结果相关性分析的森林图
Figure4Forest plot for the correlation analysis between histopathological parameters and qPCR results
图5坏死面积百分比和肉芽肿最大直径检测qPCR阳性结果的ROC曲线分析
Figure5ROC curve analysis of the diagnostic efficacy for positive qPCR result by the percentage of necrotic area and the maximum diameter of granulomas
既往研究显示，MTB 分泌蛋白 Ag85B 在 TB 的干酪样坏死灶及周围分布更广，分子检测技术同样对肉芽肿中干酪样坏死组织的MTB 遗传物质更敏感，即使菌量少或包裹在坏死组织中，也能通过扩增技术被检出[25-26]。以上报道表明，肉芽肿伴随广泛的干酪样坏死是MTB富集区，选择特征性FFPE标本，或许可以提高检测的灵敏度。因此，本研究首先通过 HE 染色初筛 149 例具有典型 TB 肉芽肿性炎症特征的标本蜡块，进行 Z⁃N 抗酸染色和 qPCR 分子检测。
Z⁃N抗酸染色是重要的TB诊断工具，可快速提供结果，特别是对于微生物负荷高、传播风险大和需要快速开始治疗的患者具有十分重要的意义[27-28]。然而，本研究结果和既往研究报道一致[29]，Z⁃N 抗酸染色的灵敏度（56.8%）和特异度（42.6%）有限。抗酸杆菌在染色标本中出现的概率与患者痰液中的杆菌数量呈正比，如果每毫升低于1 000个，发现抗酸杆菌的概率将低于 10%[30]。为提高这些测试的灵敏度，可能需要在几个临床标本上重复这些测试，导致资源、时间和人力的浪费。Z⁃N抗酸染色阳性标本在显微镜下很难区分MTB感染和非MTB感染，因为两者都耐酸且形态相似，这可能导致Z⁃N抗酸染色出现一定比例的假阳性结果，特异度降低。
qPCR分子检测在TB诊断中显示出更高的灵敏度、特异度和与临床诊断的一致性。世界卫生组织等认为PCR技术的出现，提高了TB的诊断率，具有检测限低（每毫升 10~1 000个菌落形成单位），诊断时间短（2~6 h）等优点[31-32]。qPCR可针对性检测仅存在于 MTB 中的插入元件 IS6110 靶基因，对 TB 检测的特异性强，能够筛选出Z⁃N抗酸染色不能区别的染色阳性但非TB感染。本研究中2例石蜡组织 Z⁃N抗酸染色阳性，而qPCR阴性，最终通过其他实验室试剂盒鉴定为NTM感染，1例为Chelonae 分枝杆菌亚种，另1例为鸟分枝杆菌。虽然分子技术检测TB有效和直接，但成本较高[33]。另有其他研究认为，qPCR 的特异性强，但可能不够敏感，其可靠性受到一些组织学特征的影响[34-35]。本研究中，在经 HE 染色筛选后具有典型病理特征的标本检测中， qPCR特异度较高，为96.3%，灵敏度也达到80.0%，高于既往 qPCR 技术在肉芽肿 FFPE 组织中灵敏度为26.3%~77.63%的报道[36-38]。
本研究以此为切入点，将149例标本分为qPCR 阳性组和阴性组，回顾性观察了两组HE染色结果，并总结了它们的组织病理学特征，分析 qPCR 灵敏度得以提高的具体原因，例如彻底干酪样坏死面积百分比（有核破裂碎片、无细胞的粉红色坏死区域面积≥25%，或坏死面积<25%），每张切片的肉芽肿数量和大小（最大直径≥8 mm或最大直径<8 mm）、是否有融合性肉芽肿（合并肉芽肿的相邻边界）、是否有离散肉芽肿（界限清楚，大部分上皮样组织细胞符合肉芽肿的形状）、坏死外层是否伴有上皮样组织细胞聚集带、肉芽肿周围是否有淋巴细胞层、是否有朗汉斯巨细胞等。本研究结果表明：当标本的干酪样坏死面积百分比≥25%（χ2 =41.649，P <0.001），肉芽肿最大直径≥8 mm（χ2 =8.071，P=0.004）时，更常提示为 qPCR 阳性。通过二元 Logistic 回归分析和 ROC 曲线分析 AUC，这两个因素对 qPCR 阳性结果的诊断都具有较高的灵敏度，提示它们对 qPCR 检测TB可能有一定的辅助诊断价值。这可能是因为随着疾病进展而形成肉芽肿，MTB具有高活性和高复制能力，导致典型的干酪样坏死和肉芽肿形成，此时细菌代谢活跃且载量高，所以更容易通过qPCR检测到。但本研究没有观察到qPCR检测结果与两个因素之间的线性关系。此外，肉芽肿最大直径≥ 8 mm对TB的预测特异度（43.7%）低于干酪样坏死面积百分比≥25%（78.9%），这提示其单独应用的参考价值有限，可能需结合干酪样坏死面积或坏死类型等指标进行综合判断。
由此可见，出于成本和时间效益考虑，可以广泛使用常规HE染色辅助TB诊断。HE染色对TB初筛的灵敏度高（149/189，78.8%），特异度差（95/189， 50.3%）。但是，如果它与特异度高而灵敏度较差的 qPCR 检测一起使用，可以成为一个方便的诊断工具。选择HE染色中具有干酪样坏死面积百分比≥25 %和肉芽肿最大直径≥8 mm等病理特征的蜡块进行 qPCR 检测，能够弥补 qPCR 检测灵敏度低的缺点，且更具成本、时间效益。
基于以上观察结果，同样提示在临床操作中，新鲜手术标本的取材应尽可能保留坏死物质。若病灶异质性明显，则需多点取样，避免漏检；组织固定也需及时，离体组织需在30 min之内用10%中性甲醛固定，防止细胞内的溶酶体酶释放破坏MTB结构，如细胞壁破裂、DNA/RNA降解，影响后续检测。
本研究考察了 FFPE 组织 HE 染色的定量病理特征与MTB qPCR 检测灵敏度之间的关系，能够有效指导临床工作中对疑似TB标本进行合理取材，以及通过HE染色初筛适合的标本进行qPCR检测，更为经济、可靠、迅速地诊断TB。本研究存在一定局限性，标本采集方法不同，灵敏度和特异度存在差异，需要进一步扩大样本量来验证本研究的结果。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
All of the authors have no conflict of interests to declare.
作者贡献声明：
沈丽华负责初稿撰写、数据整理。张倩倩负责方法学、数据整理。金晓燕负责软件分析、数据整理。胡慧娣、董燕负责软件分析。邹珏负责验证、监督、调查、数据整理、撰写与审阅初稿。
Author’s Contributions：
SHEN Lihua was responsible for data collection and writing， including the original draft as well as review and editing. ZHANG Qianqian contributed to methodology and data cura⁃ tion. JIN Xiaoyan handled software analysis，and data collection. HU Huidi and DONG Yan contributed to software analysis. ZOU Jue was involved in conceptualization，data curation，validation， supervision，investigation，writing and reviewing the original draft.