摘要
人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）属肺炎病毒科偏肺病毒属，2001 年首次发现于荷兰。hMPV能够反复感染婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群，是引起严重急性下呼吸道感染的主要病原体之一。hMPV在全球范围内分布广泛，造成极大的社会负担。目前全球尚无获批上市的hMPV预防性疫苗，临床多为对症治疗。疫苗是预防hMPV感染、传播和避免严重感染症状的重要手段。近年来，国内外在hMPV疫苗研究中取得多项进展，多款疫苗进入临床研究阶段，处于临床前阶段的研究众多。文章阐述 hMPV 的病毒学特性、流行病学特征和感染宿主细胞的分子机制，详细介绍处于临床研究阶段 hMPV 疫苗的最新研究进展，并从不同技术路线角度介绍临床前阶段hMPV疫苗研发的推进情况，以期为 hMPV 疫苗的加速开发提供参考。
Abstract
Human metapneumovirus（hMPV）belongs to the genus Metapneumovirus of the family Pneumoviridae. It was first discovered in the Netherlands in 2001. hMPV can cause repeated infections in infants，the elderly and immunocompromised population，which is one of the major pathogens causing severe acute lower respiratory tract infections. hMPV has spread across the world，becoming a serious public health and financial burden. Vaccination is supposed to be one of the most important approaches to prevent the hMPV infection and transmission as well as to reduce the severeness of symptoms. Up to now，there is no approved hMPV preventive vaccine，and most clinical treatments are limited to symptomatic reduction. In recent years，significant progress has been made in the research on hMPV vaccines. Many vaccines have entered the clinical research stage，and there are also numerous studies in the preclinical stage. This review discusses the virological characteristics，epidemiological features and molecular mechanisms of the hMPV infection of host cells，introduces the latest clinical development of hMPV vaccines，and presents the preclinical research and development of the hMPV vaccine from the perspective of different technical strategies，hopefully providing references to accelerate the hMPV vaccine development.
Keywords
人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）是于2001年分离自呼吸道感染住院儿童鼻咽部分泌物的一种人类呼吸道病原体，据报道该病毒自1950 年以来在世界各地持续传播，是常见的呼吸道病原体之一[1-2]。hMPV的主要感染人群是儿童和老年人，成人和免疫功能低下人群也会感染，临床特征既包括轻微的呼吸道感染，也包括危及生命的严重细支气管炎和肺炎，发病机制未完全清楚[2]。目前，尚无针对 hMPV的疫苗和特效药物上市，多为对症治疗。
1 hMPV的病毒学和流行病学
hMPV 属副黏病毒科肺炎病毒亚科偏肺病毒属，与人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncy⁃ tial virus，RSV）属相同亚科不同属。hMPV为单股负链RNA病毒，病毒颗粒平均直径约为200 nm，病毒 RNA与核蛋白紧密结合，表面糖蛋白F、G和SH形成 13~17 nm的刺突[3]。根据G或F的序列，hMPV可分为A型和B型，并可细分为A1、A2、B1、B2 4个亚型。流行病学调查表明，不同型别hMPV可在同一地区同时传播，并且优势型别在1~3年内会发生变化[4]。仓鼠和非人灵长类动物的交叉中和抗体检测和比较结果显示，hMPVA型和B型的抗原性高度相关[5-6]。
由 hMPV 感染引起的最主要临床症状是上和/ 或下呼吸道感染，以下呼吸道感染最为常见，而且下呼吸道感染会加重肺炎、细支气管炎和急性哮喘[7]。据调查，1%的5岁以下儿童急性下呼吸道感染相关死亡归因于hMPV[8]。2018年，全球5岁以下儿童中约有1 420万例发生hMPV相关急性呼吸道感染，64.3 万例住院，1.61 万例死亡[8]。hMPV 的第 2 个主要感染人群是老年人，特别是虚弱、免疫抑制或患慢性心肺疾病的住院老年人。据报道，感染 hMPV 的老年患者中有 40%发生肺炎[9]。2009— 2019年，引起我国急性呼吸道感染的病毒中，hMPV 排名第 8，阳性率为 4.1%。数据回归分析发现， hMPV 和 RSV 的阳性率均呈现儿童⁃老年人模型，这与以往研究一致[10]。hMPV 与RSV、副流感病毒 （parainfluenza virus，PIV）、冠状病毒、甲型和乙型流感病毒等其他呼吸道病原体存在共同感染情况[11]。 hMPV较RSV流行高峰晚1~2个月。2023年春季，美国不同地区各类实验室自愿送检样本中，hMPV检出率出现明显高峰，约为20%，与RSV峰值接近[12]。
2 hMPV感染宿主细胞的机制
hMPV基因组RNA长约13 kb，除基因顺序和一些非结构基因的缺失，hMPV 和RSV 基因组非常相似（图1）[11]。hMPV基因组编码9个蛋白，N为核蛋白，P为核包膜磷酸化蛋白，M为非糖化基质蛋白，F 为融合蛋白，M2⁃1为转录延长因子，M2⁃2为RNA合成调节因子，SH为小疏水表面蛋白，G为主要黏附蛋白，L为主要聚合酶亚单位。F、G和SH为病毒表面糖蛋白。hMPV 与宿主细胞膜融合前，病毒表面糖蛋白与宿主细胞膜表面受体结合，但不是所有表面糖蛋白都是入胞必需的，G或SH缺失的突变体均可在仓鼠和非人灵长类动物模型中高效复制增殖， F可独立诱导融合，G和SH则不能，说明F在病毒感染中发挥关键作用。此外，RSV的F和G均可诱导中和抗体，而hMPV只有F能够诱导中和抗体[13]，表明hMPV F是疫苗和药物开发的重要靶点[14]。
图1hMPV和RSV的基因组
Figure1Genomic organization of hMPV and RSV
在入胞过程中，F最初被翻译为无活性前体F0，经蛋白水解获得融合能力。蛋白酶识别切割 RSV F0 前体 2 次，但 hMPV F0 前体仅被切割 1 次[15]。 hMPV F 切割产生的 F1 和 F2 亚基通过二硫键保持共价连接。成熟的hMPV F是一种亚稳态融合前构象（prefusion，Pre）的F1 + F2同源三聚体。接受激活信号后，高能状态的Pre F会发生三级结构重排，将 F1 亚基 N 端的疏水融合肽延伸并插入宿主细胞膜。然后，这种中间体自行收缩，拉近宿主细胞和病毒膜，发生膜融合，此时F呈高度稳定的融合后构象（postfusion，Post）[16]。
RSV 和 hMPV 的 F 约有 30%的序列同源性，至少2个RSV F的抗原位点与hMPV F相同（Site Ⅲ 和 Site Ⅳ），但诱导的抗体应答不同。人血清中RSV的中和活性主要是由Pre F 特异性抗体介导的，而大多数 hMPV 的中和活性由 Pre F 和 Post F 抗体共同介导。RSV Pre F的免疫效果优于Post F，但hMPV Pre F 是否优于Post F尚无结论。研究表明，在受感染或接种疫苗的人群和小鼠中，RSV Pre F特异性抗体更普遍，而hMPV Pre F特异性抗体水平低于Post F[17]。
3 临床阶段hMPV疫苗研究进展
目前，尚无hMPV疫苗上市[2]，现有6款疫苗进入临床阶段，分别为：RSV 和 hMPV 联苗 IVX⁃A12，hMPV和PIV 3型联苗mRNA⁃1653，RSV和hMPV联苗 mRNA ⁃ 1365，RSV、hMPV 和 PIV 联苗 SP0256， RSV 和 hMPV 联苗 VXB ⁃ 241，以及减毒活疫苗 rHMPV⁃Pa。
3.1 IVX⁃A12
IVX⁃A12的设计基于蛋白质双组分病毒样颗粒 （virus⁃like particle，VLP）I53⁃50，两种VLP分别展示 RSV Pre F 抗原（DS ⁃Cav1）和 hMPV Pre F 抗原[18]。 IVX⁃A12临床Ⅰ期试验（NCT05664334）的主要目的是评估单次接种不同剂量和比例的两种VLP，以及含或不含MF59®的安全性和免疫原性，受试人群为健康老年人。中期数据显示，所有剂量组耐受性良好，无论是否有佐剂，均可诱导针对RSV和hMPV的免疫反应，抗原间无免疫干扰。IVX⁃A12 诱导的 hMPV⁃A 和 hMPV⁃B 最高中和抗体几何平均滴度分别约为 3 300 assay units/mL和23 900 assay units/mL，而安慰剂组分别约为900 assay units/mL和11 500 assay units/mL。受试者将继续接受随访，获得6个月的免疫原性数据[19]。Ⅱ期临床试验（NCT05903183）的目的为评估健康老年人接种单剂次含或不含MF59® IVX⁃A12的安全性和免疫原性，并考察长期安全性和免疫持久性[20]。目前，该试验结果尚未公布。
3.2 mRNA⁃1365
mRNA⁃1365采用mRNA技术路线，处于Ⅰ期临床试验（NCT05743881）招募阶段，主要考察安全性与免疫原性，受试人群为5~24月龄婴儿，目前尚未公布试验结果[21]。
3.3 SP0256
SP0256 是针对老年人设计的 mRNA 呼吸道病毒联合疫苗，抗原主要包括 RSV、hMPV 和 PIV。目前，该疫苗开展的RSV和hMPV联合疫苗的临床试验（NCT06134648、NCT06237296 和 NCT06583031） 尚在进行中，研究不同抗原剂量、脂质纳米颗粒组分和接种剂次等对安全性和有效性的影响[22-24]。
3.4 VXB⁃241
VXB⁃241 在抗原设计中将Ⅰ型人类免疫缺陷病毒 gp41蛋白七肽重复序列的1区和2区组成分子钳，与重组病毒糖蛋白结合，以代替C端跨膜/细胞质区，形成包括病毒融合蛋白在内的六螺旋束，从而将病毒糖蛋白三聚体限制于 Pre[25]。目前，该疫苗已开展Ⅰ期临床试验（NCT06556147），研究不同剂量抗原的安全性和免疫原性，结果尚未公布。
3.5 其他
有研究小组致力于开发hMPV减毒活疫苗，首先构建了遗传稳定的减毒活疫苗骨架rHMPV⁃SHs，后将其中的P替换为禽偏肺病毒（avian metapneumovi⁃ rus，AMPV）相应基因，获得减毒活疫苗 rhMPV⁃Pa。但由于疫苗在hMPV 血清阴性儿童中过度减毒，研究终止（NCT01109329）[28]。
4 临床前hMPV疫苗研究进展
目前已进入临床阶段的hMPV疫苗主要包括蛋白重组疫苗和mRNA疫苗，另有一些相同技术路线的疫苗正在研发中，其他技术路线研发的多款疫苗也在临床前研发阶段。这些疫苗均为潜在的候选疫苗。
4.1 hMPV减毒活疫苗
基因敲除是构建减毒活疫苗的常见方法，可以通过转染缺失部分片段的hMPV cDNA基因组构建 hMPV 减毒活病毒。在实验小鼠模型体内，与野生型rhMPV⁃WT相比，缺失G蛋白的突变体rhMPV⁃ΔG 明显减毒，无临床症状出现，但可诱导中和抗体[29]。
不同hMPV毒株的体外融合性和体内致病表型具有一定差异，所以遗传骨架的选择也是构建减毒活疫苗需要考虑的因素之一。Dubois等[30] 以不同患者来源的hMPV毒株为骨架构建SH或G缺失病毒。在细胞和人气道上皮模型中，不同骨架突变体的感染能力和生长能力不同。在小鼠模型中，ΔSH⁃C⁃85473对 hMPV的攻击具有显著保护作用，并可诱导对异源毒株的交叉保护，是一种有希望的减毒活疫苗。
4.2 hMPV重组蛋白疫苗
包膜病毒最具免疫原性的蛋白是表面膜蛋白，决定了病毒的宿主细胞特异性，hMPV 的表面膜蛋白 F在入胞过程中发挥关键作用，并且序列保守，被应用于多个重组蛋白候选疫苗的研究。
RSV 和 hMPV F 的序列和结构相似度很高，以往研究发现，添加二硫键可将RSV和Bovine RSV F 稳定于Pre构象，提高中和滴度，尤其是引入单体间二硫键（interprotomer disulfide bonds，IP⁃DS）。Stew⁃ art⁃Jones等[31] 将该设计应用于hMPV，构建了一系列突变体（表1，序号1~5）。小鼠免疫原性研究结果表明，无论Pre 或Post 构象，含IP⁃DS 的突变体诱导的中和滴度更高。在恒河猴模型中，含IP⁃DS突变的抗原免疫动物血清对B2亚型中和水平更高[31]。Ou 等[32] 和Kwong等[33] 继续以中和滴度最高的Pre构象突变体v3⁃B为基础，通过加入更多IP⁃DS和其他突变提高免疫原性（表1，序号6~10）。比较突变体免疫小鼠的血清中和活性发现，含3个二硫键的突变体诱导高水平中和抗体，且无脯氨酸突变体诱导的抗体水平更高，v3⁃BΔ12DS454诱导的小鼠中和抗体水平最高，具有成为候选疫苗的潜力[32-33]。
设计稳定的hMPV Pre F方案时，参考RSV的经验，首先，阻断弗林样蛋白酶有效切割，并增强蛋白表达。其次，添加二硫键、填充空腔和引入脯氨酸固定转折；此外，通过改变某些位点氨基酸的极性增强稳定性。基于以上策略设计单点和多点突变 （表2），比较表达量、聚集状态、热稳定性和免疫原性等，获得最佳突变体DS⁃CavEs2，其与针对Pre F的单克隆抗体MPE8的亲和程度未受影响，而且主要诱导融合前特异性抗体[15]。综上，具有稳定Pre结构的 DS⁃CavEs2将有助于hMPV疫苗的研发。
hMPV F0的激活仅需蛋白酶切割1次，而RSV F0要被切割2次。Bakkers等[34] 认为类似RSV的2次切割可能促进hMPV F0的激活，研究模拟分析F0，确定第2切割位点。结果表明，2次切割获得的稳定 hMPV Pre F 三聚体能够诱导高水平抗体和交叉中和抗体反应，几乎完全保护 hMPV 对棉鼠的攻击。高度稳定的双切割 hMPV Pre F 三聚体成为有吸引力的候选疫苗。
VLP由病毒结构蛋白组成，保留真实病毒空间构象。虽然VLP缺失基因组，但可有效诱导体液和细胞免疫反应。研究采用杆状病毒系统构建 hMPV F 和流感病毒Matrix 1的VLP能够诱导小鼠特异性体液和细胞免疫反应，具有一定保护作用[35]。另有研究将人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的Gag蛋白与hMPV F融合构建VLP，在小鼠中，与 hMPV F 相比，hMPV⁃F⁃Gag VLP 的免疫原性更强，中和抗体水平更高。基于 VLP 技术的 hMPV 疫苗在动物模型研究中取得了一定进展，为疫苗的研发提供了新思路。
表1突变体构建过程
Table1The construction process of mutants
*：v4⁃A was derived from A1 NL/1/00，and v4⁃B was derived from B2 CAN98⁃75，respectively. **：Original design of v4 involved A140C⁃A147C， A63C⁃K188C，and K450C⁃S470C；cryo⁃EM defined model delineated 60C⁃A63C and 182C⁃K188C（with A140C，A147C，K450C，S470C）
表2DS⁃CavEs2构建过程
Table2The construction process of DS⁃CavEs2
hMPV F 的大多数抗原位点同时存在于 Pre 和 Post，稳定的Post F也是可行的抗原。Pilaev等[36] 构建多个 hMPV Pre F 和 Post F 突变体（表3），比较两种构象作为候选苗抗原的潜力。在小鼠模型中，铝佐剂组只有 T160N、A185P、A125C/I260C 和 454 ⁃ HQWH⁃457诱导产生了中和抗体，且水平接近，使用病毒感染小鼠后均未检测到病毒滴度，研究认为，Pre F的混合物与Post F相比未表现出明显优势[36]。
多数研究中的F为Pre和Post的混合物，为获得完全的hMPV Post F 三聚体，55℃加热F，使所有蛋白转化为Post。热处理蛋白免疫小鼠产生的血清能够有效中和毒株，而且增强免疫后产生了稳定的 IgG1 和 IgG2a/2b 水平，平衡的 Th1/Th2 免疫应答。竞争分析显示，抗体靶向hMPV F的Site Ⅲ和Ⅳ[37]。研究发现了 hMPV F 的新特征，这可能为疫苗的研发提供新的重要信息。
4.3 hMPV重组载体疫苗
重组载体疫苗是将编码病原体有效免疫原的基因插入载体基因组中，载体进入宿主细胞后，表达大量抗原，诱导特异性T细胞反应，增强人体对疾病的免疫力。重组载体疫苗的研发对生物安全要求很高，通常选择非致病性或低致病性的病毒或细菌作为载体。hMPV载体疫苗研究中涉及PIV和流感病毒等载体。
表3构建的突变体
Table3The mutations constructed
Chan等[38] 首先以hMPV A2型CAN97⁃83 F为抗原骨架，进行密码子优化和引入提高Pre F稳定性的突变，然后，插入F和HN基因替换hPIV3相应基因的 Bovine PIV3 载体，共获得 8 个重组子（表4）。动物实验结果表明，重组子与野生型hMPV免疫仓鼠的中和抗体水平差异无统计学意义；攻毒实验中，重组子免疫动物的鼻甲中未检测到感染性 hMPV，但对肺部感染，突变体 3、6 和 7 无明显保护作用，其余突变体引发的保护作用明显。减毒且安全的 B/hPIV3⁃hMPV F 系列载体疫苗有可能成为潜在的候选疫苗[38]。
有研究以流感病毒为载体，将 hMPV F 基因插入NS1基因，构建重组子rFLU⁃hMPV/F⁃NS。动物实验中，初次免疫和加强免疫 rFLU⁃hMPV/F⁃NS 均可诱导高水平抗体和细胞因子。rFLU⁃hMPV/F⁃NS有显著保护作用，小鼠肺组织病理变化轻，病毒滴度低。综上，rFLU ⁃ hMPV/F ⁃NS 是一种很有前景的 hMPV候选疫苗[39]。
4.4 hMPV嵌合疫苗
hMPV和RSV的主要抗原均为F，而且共享部分抗原位点，有些抗体已鉴定具有交叉中和能力。将 RSV F的主要保护性位点移至hMPV F可产生携带两种病毒抗原位点的嵌合蛋白，同时诱导针对两种病毒的免疫反应。McLellan等[40] 设计了多个RSV F 取代hMPV F site φ的蛋白，经亲和力和表达水平比较，筛选获得Chimera1嵌合蛋白。然后优化Chime⁃ ra1 的氨基酸，构建 RSV F 和 hMPV F 间盐桥，提高表达水平，并保持 Pre 表位的完整性。其次，参考 hMPV 重组蛋白抗原设计原则优化突变方案（表5），进一步提高蛋白表达水平和热稳定性。获得的 DS⁃CavEsP 与 D25（RSV Pre F 特异性抗体）的亲和力和RSV Pre F PRDM相当，与MPE8（hMPV/RSV 交叉反应抗体）的亲和力和 DS ⁃ CavEs2 相当，与hMPV F Site Ⅲ、Ⅴ或Ⅰ特异性中和抗体的亲和力和 DS⁃CavEs2相当[40]。
表4B/hPIV3⁃hMPV F的突变设计
Table4The mutation design of B/hPIV3⁃hMPV F
4.5 hMPV表位疫苗
以表位预测为代表的免疫信息学技术为疫苗研发提供了新思路，动态模拟和免疫模拟等也为疫苗设计提供了验证方法。从F、G、SH、M和M2中筛选CTL、CD4+ T细胞和B细胞线性表位，分析其抗原性、潜在毒性、致敏性、与人源蛋白的同源性，以及不同亚型间的保守性。经计算，预测的疫苗可在人体内稳定存在，且与免疫受体紧密结合，具有诱导强烈体液和细胞免疫反应的潜力。构建多表位 mRNA 疫苗，免疫模拟表明该疫苗可作为预防hMPV感染的候选疫苗[41]。
表5DS⁃CavEsP构建过程
Table5The construction process of DS⁃CavEsP
5 小结与展望
全球范围内 hMPV 感染的流行形势仍非常严峻，其主要优势亚型的转化并没有规律的循环模式。疫苗是公认的预防hMPV感染的有效措施，可以降低发病率、病死率，并且可有效降低病毒的传播，但目前仍未有 hMPV 疫苗上市。由于 hMPV 可反复引起呼吸道感染，难以形成持久免疫；易感人群复杂，包括儿童和老年人，感染风险、免疫水平和并发症等方面均存在明显差异，理论上需采取不同的疫苗设计策略；这些因素成为疫苗研发过程中的挑战。目前，国外已有多款hMPV疫苗进入临床试验阶段，多种技术路线设计的hMPV疫苗临床前研究也在快速推进中。我国国内尚无hMPV疫苗临床试验注册，临床前阶段的研究正在逐步开展。同时，国外还有很多相关专利尚未进入中国，我国在该领域内的发展空间巨大。随着hMPV病毒学研究的深入，以及疫苗研发策略的不断拓展，包括抗原优化和结构改造、新佐剂应用等，hMPV疫苗领域也即将迎来突破性进展。
利益冲突声明：
虽然本研究的作者隶属北京安百胜生物科技有限公司和江苏瑞科生物技术股份有限公司，且受到公司资金的相关支持，但资助方未参与研究的设计，文献的收集分析和论文的撰写。所有作者均声明，除上述情况外，没有任何与本文相关的经济、个人或其他利益冲突。
Conflict of Interests：
The authors of this study are affiliated with Beijing Abzymo Biosciences Co.，Ltd. and Jiangsu Recbio Technology Co.，Ltd.， and the research was supported by funding from these compa⁃nies. However，the funding organizations did not participate in the study design，literature collection and analysis，or the writ⁃ ing of the manuscript. All authors declare that there are no eco⁃ nomic，personal，or other conflicts of interest related to this manu⁃ script，except for the aforementioned.
作者贡献声明：
辛亮负责构思文章的主题，进行文献检索与总结，设计文章整体框架，撰写大部分内容。张岭负责关键研究的分析，协助撰写部分背景和结论。杨克俭负责审阅文章，深度分析，协助修改文章的最终版本。
Author’s Contributions：
XIN Liang conceived the topic of the article，conducted literature review and summary，designed the overall framework of the article，and wrote the majority of the content. ZHANG Ling analyzed key studies and contributed to writing parts of the background and conclusion sections. YANG Kejian reviewed the article，conducted in ⁃depth analysis，and assisted in revising the final version of the manuscript.