摘要
目的：基于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）秀丽线虫病理模型，探讨牛蒡多糖在AD中的作用。方法：采用课题组自制的牛蒡多糖，不同浓度（62.5、125.0、250.0 μg/mL）作用于AD线虫病理株系（CL4176、CL2355、CL2006），研究其对线虫β淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）沉积、趋化行为、5-羟色胺敏感性、瘫痪、生长发育、运动能力、摄食能力各项行为学指标的影响，测定氧化应激与胆碱能神经元相关指标，荧光定量PCR检测线虫体内相关基因的表达水平。结果：牛蒡多糖具多重生物活性，可以减少Aβ蛋白的水平与沉积，降低5-羟色胺敏感性，强化线虫趋化行为和学习记忆能力，延迟瘫痪发生时间，促进发育，增加摆动与咽部震动频率，提高抗氧化酶活性，降低乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性。同时，其可降低age-1 和akt-1基因的表达，增强daf-16基因的表达，促进skn-1、gst-4、sod-1和sod-2表达，发挥抗氧化作用，减轻AD症状。此外，牛蒡多糖还抑制ace-1和ace-2基因表达，降低AChE活性。结论：牛蒡多糖可能通过调节age-1/akt-1/daf-16信号通路，降低氧化应激水平，同时抑制AChE活性，从而缓解并改善AD相关病理过程。
Abstract
Objective：This study aimed to investigate the therapeutic effect of burdock polysaccharide on Alzheimer’s disease（AD） using Caenorhabditis elegans（C. elegans）pathology model. Methods：Burdock polysaccharide made in our lab was used at varying concentrations（62.5，125.0，and 250.0 μg/mL）on transgenic C. elegans AD models（CL4176，CL2355，and CL2006 strains）to study the effects on nematode amyloid beta（Aβ）deposition，chemotaxis，5-hydroxytryptamine sensitivity，paralysis，growth and development， locomotor activity，feeding ability. Oxidative stress and cholinergic neuron-related indexes were measured，and the expression levels of related genes in nematodes were examined by RT -PCR. Results：Burdock polysaccharide exhibited multiple biological activities， thus reducing the level and deposition of Aβ protein，reducing 5-hydroxytryptamine sensitivity，strengthening nematode chemotaxis and learning memory，delaying paralysis，promoting development，increasing swing and pharyngeal vibration frequency，increasing antioxidant enzyme activity and reducing acetylcholinesterase（AChE）activity. Meanwhile，it reduced the expression of age-1 and akt-1 genes，enhanced the expression of daf-16 gene，promoted the expression of skn-1，gst-4，sod-1 and sod-2，exert antioxidant effects，and alleviated AD symptoms. Concurrently，it attenuated AD pathology by inhibiting ace -1/ace -2 expression，and reducing AChE activity. Conclusion：Burdock polysaccharide may alleviate and improve AD-related pathological processes by regulating the age-1/akt-1/daf-16 signaling pathway to reduce oxidative stress levels while inhibiting AChE activity.
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种起病隐匿的神经退行性疾病[1]，病理学特征是老年斑沉淀[2]、神经纤维缠结并伴有神经元损伤[3]。 AD 病因复杂，发病机制仍不明确，学界提出六大假说：β淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）假说、神经炎症假说、Tau蛋白假说、线粒体功能障碍假说、氧化应激假说、胆碱能假说[4]。目前临床治疗药物只能缓解不能治愈疾病，且患者需长期服药，同时还存在一些明显的不良反应。因此，开发治疗 AD 的新药迫在眉睫。牛蒡是传统的中药，其瘦果和根皆可入药[5]，《本草纲目》记载其“久服轻身耐老”。牛蒡多糖是牛蒡根中的主要多糖成分[6]，现已发现在抗氧化、防衰老、抗炎、降血糖等方面均有一定功效[7]，结合 AD 发病机制的六大假说与牛蒡多糖已有研究，其可能具有缓解 AD 的潜力，但牛蒡多糖在神经退行性疾病中的研究较少。秀丽线虫是一种进化上高度保守、具有良好遗传和化学筛选适用性的模式生物，也被越来越多地应用于抗 AD 药物的研究和开发[8]。本研究采用课题组自制的牛蒡多糖，通过作用于 AD 秀丽线虫病理模型（CL4176、CL2355、 CL2006），发现牛蒡多糖对AD线虫模型具有显著疗效，明显改善AD症状，为AD的治疗提供了新思路并奠定了实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
课题组自制的牛蒡多糖（纯度≥99％，单糖组成：半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖）；5⁃羟色胺（上海阿拉丁公司）；左旋咪唑、丁二酮、NaCl、 MgSO4、KH2PO4、NaH2PO4、CaCl2（上海国药公司）；胰蛋白胨、胆固醇、甘油、NaClO（上海泰坦公司）；硫黄素T（上海BBI公司）；多聚甲醛（北京兰杰柯公司）； 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）检测试剂盒（南京建成公司）；活性氧（reactive oxygen species， ROS）检测试剂盒、PCR试剂盒（南京诺唯赞公司）； TRIzol（北京天根公司）；逆转录试剂盒（北京全式金公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌株和线虫培养
实验所用秀丽线虫株系的名称、基因型、表型见表1。秀丽线虫的生命周期分为胚胎期、幼虫期、成虫期，其中幼虫期分为L1~L4期[9]。秀丽线虫以大肠杆菌OP50为食物，所有线虫和大肠杆菌OP50 均购于美国线虫遗传中心。
表1秀丽线虫株系的名称、基因型和表型
Table1Names，genotypes，and phenotypes of C. elegans strains
1.2.2 药物配制及分组
将牛蒡多糖溶于超纯水，振荡，涡旋，使其充分溶解。线虫生长培养基（nematode growth medium， NGM）和含药NGM培养基、M9缓冲液、左旋咪唑溶液、5⁃羟色胺溶液按常规方法配制。
1.2.3 线虫同期化
在显微镜下观察线虫状态，当看到大部分虫体内有卵时，即可进行同期化。用 NaClO⁃NaOH 裂解液从线虫中获得同步的卵，然后移入 NGM 培养基，培养 12~14 h [10]。将同期至 L1 期的 CL2006、 CL4176、CL2122、CL2355、N2 线虫分为对照组和加药组，加药组的牛蒡多糖浓度分别为 62.5、125.0、 250.0 μg/mL。CL2006 线虫在 16℃下培养 48 h，后在 25℃下培养 36 h。CL4176 线虫在 16℃下培养 24 h，后在 25℃下培养 24 h。CL2122 和 CL2355 线虫在 16℃下培养 48 h，后在 25℃下培养 24 h。N2 线虫在20℃下培养48 h。
1.2.4 Aβ荧光定量实验
按 1.2.3 对 CL2006 线虫进行处理后，每管加入 150 μL 4%多聚甲醛固定液，在4℃下固定24 h。然后加入150 μL通透液，封口，37℃孵育24 h。M9溶液清洗3次，再用50%乙醇冲洗3次，加入200 μL硫磺素T染色剂[11]。后续继续用M9溶液冲洗至透明，加入1 000 μL M9溶液重悬线虫。制片后于荧光显微镜下拍照并记录Aβ斑块数量。每组测定30条线虫的Aβ斑块数量。整体实验重复3次。
1.2.5 趋化实验
按 1.2.3 对 CL2122、CL2355 线虫进行处理后，在培养基中心滴加在 M9 溶液中浸泡 2 h 的线虫约 100条。吹干后，在一端滴加1 μL 趋化剂（1%丁二酮或0.1 mol/L NaCl）和1 μL 0.25 mol/L左旋咪唑，在另一端滴加 1 μL M9 溶液和 1 μL 0.25 mol/L 左旋咪唑。将其置于25℃培养箱中1.5 h，记录每个培养基上线虫总数以及趋化圈中线虫数量[12]。整体实验重复3次。
趋化指数=（丁二酮或NaCl侧线虫数-对照侧线虫数）/培养基上线虫总数。
1.2.6 5⁃羟色胺敏感性测定
按1.2.3对CL2122、CL2355线虫进行处理后，每个浓度挑取约100条线虫到NGM培养基上，然后滴加 5 mg/mL 5⁃羟色胺溶液。3 min后评估线虫状态（活跃或瘫痪），并记录未瘫痪的线虫数。计算每个浓度未瘫痪的线虫数占总数的百分比[13]。实验重复3次。
1.2.7 瘫痪实验
按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理，每 4 h 评分，根据NGM培养基上的铂金环不活动或线虫腹部存在群集卵的情况，评估线虫是否瘫痪[14]，并记录未瘫痪的线虫数直至所有线虫均瘫痪。每组50条左右。实验重复3次。
1.2.8 体长和体宽测定
按 1.2.3 对 N2 线虫进行处理，加入左旋咪唑溶液麻醉线虫，待线虫不动时，于荧光显微镜下拍照并用Image J软件测量线虫体长和体宽[15]。每组测量30条线虫体长和体宽。实验重复3次。
1.2.9 摆动次数的测定
按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理，然后在平板上滴加适量 M9 缓冲液，待线虫恢复一段时间后开始计数，观察20 s内线虫摆动的次数[16]。线虫身体偏离中轴线摆向一侧后，再次回到中线时记 1 次。每组记录30条线虫的摆动次数。实验重复3次。
1.2.10 咽部震动次数的测定
按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理后，于体视显微镜下观察 20 s 内线虫咽部震动次数，每组记录 30条线虫的咽部震动次数[17]。实验重复3次。
1.2.11 线虫体内SOD活性、MDA和ROS含量以及 AChE活性测定
按1.2.3对CL4176线虫进行处理后，加入PBS并进行超声破碎，制备 10％线虫组织匀浆，取 0.1 mL 组织匀浆，按SOD、MDA试剂盒说明书操作，随后将样品置于酶标仪中，调定波长至550 nm测定吸光度。另取 1 μL 组织匀浆，按 BCA 试剂盒说明书操作，进行蛋白定量。取0.05 mL组织匀浆，按AChE试剂盒说明书操作，随后将样品置于酶标仪中，调定波长至412 nm测定吸光度。于荧光显微镜上拍照并用Image J软件对ROS进行定量[18]。实验重复3次。
1.2.12 基因表达定量分析
按 1.2.3 对 CL4176 线虫进行处理后，加入 1 mL TRIzol试剂和200 μL氯仿替代品，涡旋振荡并静置 10 min。加入400 μL异丙醇，并用70%乙醇溶液洗涤沉淀。获取纯化的RNA后，使用FastKing一步法除基因组cDNA 第一链合成预混试剂盒，进行逆转录反应。最后，采用荧光染料法开展实时荧光定量 PCR实验。实验重复3次。实验中使用的引物序列详见表2。
1.3 统计学方法
实验结果用SPSS 25.0进行统计分析。数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用方差分析，两两比较采用 SNK⁃q 检验。采用log⁃rank检验对线虫的瘫痪时间进行组间差异分析。P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 牛蒡多糖减轻线虫体内 Aβ的沉积，改善线虫对挥发性物质趋化的记忆，并改善Aβ蛋白引起的线虫神经元功能障碍
与对照组相比，加药组线虫体内 Aβ含量均显著减少。由此说明，牛蒡多糖可以减轻 Aβ沉积 （图1A、B）。
表2PCR引物序列
Table2Primer sequences for PCR
与对照组相比，加药组CL2355株系的线虫对丁二酮和 NaCl 的趋化性都得到了明显改善，而 CL2122株系的线虫趋化性未见明显改变（图1C、D）。由此说明，牛蒡多糖对Aβ蛋白诱导的神经毒性具有保护作用，并能缓解 Aβ蛋白表达引起的趋化性缺陷，恢复由Aβ蛋白引起的学习和记忆障碍。
图1牛蒡多糖对线虫体内Aβ沉积、趋化性和5⁃羟色胺敏感性的影响
Figure1Effects of burdock polysaccharide on Aβ deposition，chemotaxis，and 5⁃hydroxytryptamine sensitivity in C.elegans
不表达 Aβ的对照线虫 CL2122 未瘫痪率为 67.1%，而对照组 CL2355 线虫未瘫痪率仅为 27.6%。与对照组相比，加药组的 CL2355 线虫未瘫痪率显著升高，而 CL2122 线虫未出现明显变化 （图1E）。由此说明，牛蒡多糖可有效减轻 Aβ蛋白引起的 5⁃羟色胺敏感性，改善线虫的神经元功能障碍。
2.2 牛蒡多糖延缓线虫瘫痪进展并促进生长发育
与对照组相比，加药组线虫发生瘫痪的时间均显著后延（图2A）。由此说明，牛蒡多糖可以延缓 Aβ蛋白诱导的瘫痪进展。与对照组相比，加药组中 125.0 μg/mL牛蒡多糖处理后线虫的体长显著增加，加药组线虫的体宽均有明显增加（图2B~D）。由此说明，牛蒡多糖可促进线虫的生长发育。
图2牛蒡多糖对线虫瘫痪进展和生长发育的影响
Figure2Effects of burdock polysaccharide on the progression of paralysis and growth of worms
2.3 牛蒡多糖提高线虫运动能力与摄食能力
与对照组相比，加药组线虫在20 s内的摆动次数显著增加（图3A），说明牛蒡多糖可显著提高线虫的运动能力。
与对照组相比，加药组中 125.0 和 250.0 μg/mL 牛蒡多糖处理的线虫在 20 s 内的咽部震动次数显著增加（图3B），说明其可显著提高线虫的摄食能力。
2.4 牛蒡多糖提高线虫体内SOD活性，降低MDA、 ROS和AChE水平
SOD对机体的氧化与抗氧化平衡具有至关重要的作用，能清除超氧化阴离子自由基，保护细胞免受损失。与对照组相比，加药组线虫的SOD活性均有一定程度的增加（图4A），由此说明，牛蒡多糖可以通过促进抗氧化酶的表达，降低氧化应激水平。
氧化应激可增加Aβ聚集，加重AD病情。MDA 和ROS均为氧化应激的产物。与对照组相比，加药组线虫的 MDA 活性均有一定程度的降低（图4B）， 62.5、125.0 μg/mL牛蒡多糖处理后线虫的ROS含量显著降低（图4C、D），由此说明，牛蒡多糖可以减轻氧化损伤，具有保护作用。
在大脑认知过程中，胆碱能系统发挥着至关重要的作用，而 AD 患者主要受影响的神经递质是乙酰胆碱（acetyl choline，ACh）[19]。据报道，ACh 含量会随着年龄增长而降低，且 AD 患者下降幅度更大。进一步研究表明，AD 患者体内 AChE 活性升高，当 AChE 过度水解 ACh，导致 ACh 含量降低，与之相关的学习、记忆等生理过程就会出现障碍[20]。本研究测定了CL4176线虫体内AChE活性，与对照组相比，加药组线虫体内 AChE 活性显著降低（图4E）。由此说明，牛蒡多糖通过降低AChE活性，从而对AD相关病理过程具有缓解作用。
图3牛蒡多糖对CL4176线虫运动能力和摄食能力的影响
Figure3Effects of burdock polysaccharide on motility and feeding ability of CL4176 worms
图4牛蒡多糖对CL4176线虫体内SOD、MDA、ROS和AChE水平的影响
Figure4Effects of burdock polysaccharide on SOD，MDA，ROS，and AChE levels in CL4176 worms
2.5 牛蒡多糖对线虫体内daf⁃16等基因表达的影响
鉴于上述结果显示125.0 μg/mL牛蒡多糖药效最好，后续实验选用 125.0 μg/mL 牛蒡多糖处理 CL4176线虫后，对影响氧化应激和AChE活性的相关基因表达水平进行检测。结果表明，与对照组相比，125.0 μg/mL 牛蒡多糖处理后 Aβ、ace⁃1、ace⁃2、 akt⁃1、age⁃1 表达量显著降低，daf⁃16、skn⁃1、sod⁃1、 sod⁃2和gst⁃4基因的表达量显著增加（图5）。
图5牛蒡多糖对CL4176线虫体内基因表达的影响
Figure5Effects of burdock polysaccharide on gene expression in CL4176 worms
3 讨论
从天然中草药中开发抗AD的创新药物是治疗 AD 的有效策略之一。本研究以 AD 秀丽线虫病理模型为研究对象，对牛蒡多糖的神经保护作用及其机制进行探究。首先对线虫体内的Aβ沉积进行测定，发现牛蒡多糖可以显著降低线虫体内的 Aβ含量。通过5⁃羟色胺实验发现，牛蒡多糖可以减轻Aβ 表达引起的5⁃羟色胺敏感性。5⁃羟色胺是一种重要的神经递质，在调节线虫的嗅觉学习、产卵、运动行为中起重要作用[21]。外源 5⁃羟色胺可以抑制秀丽线虫的运动，导致线虫瘫痪[22]。神经元中Aβ过表达可增强CL2355株系线虫对外源性5⁃羟色胺的敏感性，促进瘫痪的发生[23]。通过趋化实验发现，与不表达Aβ蛋白的对照线虫CL2122株系相比，表达Aβ 蛋白的线虫CL2355株系对丁二酮和NaCl的趋化性显著降低。而牛蒡多糖作用于CL2355线虫可以有效缓解 Aβ蛋白表达诱导的趋化行为缺陷，恢复由 Aβ蛋白引起的学习和记忆障碍。通过瘫痪实验发现，牛蒡多糖能够延迟线虫发生瘫痪的时间，提示其具有治疗 AD 的潜力，而靶向 Aβ的抗 AD 药物被认为是最有希望起到延缓AD病理进程的药物[24]。
通过测定不同浓度牛蒡多糖处理后线虫的体长和体宽、摆动频率和咽部震动频率，发现牛蒡多糖能够显著促进线虫的生长发育，提高线虫的运动能力和摄食能力。对线虫体内 SOD 活性、MDA 和 ROS含量进行测定，发现牛蒡多糖可减少Aβ转基因线虫体内ROS的形成，提高其抗氧化能力，其保护作用可能通过促进抗氧化酶的表达，降低氧化水平。
AD患者受影响的神经递质主要为ACh，患者体内 AChE 活性升高，导致 ACh 含量降低[25]。测定 CL4176线虫体内AChE活性，结果表明牛蒡多糖能够降低线虫体内AChE的活性。
AD具有多种典型的病理标志，其中Aβ沉积是重要标志之一；而在 Aβ沉积过程中，AChE 发挥着关键作用。因此，本研究对Aβ基因和编码AChE的 ace⁃1、ace⁃2 基因[26] 的表达情况进行了定量分析。 PI3K⁃AKT 是 AD 发病过程中典型的信号通路。已有研究证实，该通路能够通过干预细胞凋亡、自噬过程以及调节氧化应激水平，来缓解 AD 的相关症状。其中，PI3K属于丝氨酸/苏氨酸激酶，age⁃1基因编码的是哺乳动物PI3K催化亚基的同源物。有研究指出，age⁃1 基因发生突变时，会致使线虫出现 dauer期滞留、脂肪储存增加以及寿命延长等现象。 age⁃1 会募集 akt⁃1 并使其磷酸化，从而激活 akt⁃1，而活化后的 akt⁃1 会进一步对胰岛素信号通路的 DAF⁃16转录因子进行磷酸化修饰，抑制其向细胞核内转位，最终抑制相关基因的表达[27]。基于上述机制，对线虫体内age⁃1、akt⁃1以及daf⁃16基因的表达情况进行测定。AD患者的大脑中存在大量氧化应激反应，该反应产生的ROS等有害物质会对神经细胞造成损伤。SKN⁃1作为一种重要的转录因子，在线虫中能够被氧化应激信号激活，随后进入细胞核调控一系列抗氧化基因的表达[28]。基于此，测定了线虫体内skn⁃1以及sod⁃1、sod⁃2、gst⁃4这3个抗氧化基因的表达[29]。结果表明，牛蒡多糖处理与 age⁃1/ akt⁃1/daf⁃16 信号通路相关基因的表达变化存在紧密关联性。具体而言，牛蒡多糖能够显著降低age⁃1 和akt⁃1的表达量，并促进daf⁃16的表达。同时，skn⁃1、gst⁃4、sod⁃1和sod⁃2的表达也显著增加，协同发挥抗氧化作用，有效降低Aβ蛋白水平，减轻Aβ沉积，缓解 AD 相关症状。此外，牛蒡多糖可以显著抑制 ace⁃1和ace⁃2基因的表达，降低AChE活性，维持神经递质平衡。本研究首次将牛蒡多糖与AD联系在一起，并基于AD秀丽线虫病理模型开展实验，为牛蒡多糖在神经退行性疾病领域的研究进行了实验性的开拓，具有一定的应用价值。
利益冲突声明：
所有作者声明无利益冲突。
Conflict of Interests：
All the authors declared no conflict of interests.
作者贡献声明：
裴雨晴、邵歆迪、朱煜洁、成飞负责研究构思、实验方法设计、实验操作、论文初稿撰写及修订；周珈珲、麻瑞莹、陈菲菲、朱欣童、李鑫颖负责实验操作、协助数据分析、参与论文修订；施萱、李露娜、徐纯钰、张亦唐、周思玥负责采集和分析数据、统计分析；申丽、李华玲负责研究课题监管与指导、资金支持、论文审阅与修订。
Author’s Contributions：
PEI Yuqing，SHAO Xindi，ZHU Yujie，and CHENG Fei were responsible for research conception，experimental method design，experimental operation，and writing and revising the first draft of the thesis；ZHOU Jiahui，MA Ruying，CHEN Feifei， ZHU Xintong，and LI Xinying were responsible for experimental operation，assisting in data analysis，and participating in the thesis revisions；SHI Xuan，LI Luna，XU Chunyu，ZHANG Yitang，and ZHOU Siyue were responsible for collecting and analyzing the data，and statistical analysis；SHEN Li and LI Hualing were responsible for supervising and guiding the research topic，financial support，and reviewing and revising the thesis.