宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，起源于宫颈腺柱状上皮、鳞状上皮以及储备细胞，其恶性程度较高，呈浸润生长且易发生转移^[1]。已有大量研究表明肿瘤发生侵袭迁移与Wnt/β⁃catenin通路具有重要关系，该通路异常直接影响肿瘤的转移^[2]。 Wnt/β⁃catenin信号通路变化能够促进宫颈癌的发生发展^[3]，β⁃catenin作为转导途径的核心元件参与调节该通路^[4]，从而促进宫颈癌的发生发展^[5]。Wnt2B可以通过经典Wnt途径调节肿瘤的发生发展，Wnt/β⁃catenin通路激活后，胞浆中的β⁃catenin表达上调^[6]，GSK⁃3β作为 β⁃catenin上游重要的负性调控因子，其失活与β⁃catenin的表达呈正相关^[7]。

苦参碱（matrine）是一个四环的喹嗪啶类生物碱，广泛存在于豆科植物苦参、山豆根和苦豆子中^[8]。苦参碱具有广泛的药理作用，如抗炎、抗肝纤维化、镇痛和抗心律失常等，苦参碱制剂不良反应较少，应用广泛^[9]。已有研究表明其具有良好的抗肿瘤特性，参与调节肿瘤增殖、凋亡、血管生成、侵袭迁移等相关的多条信号通路^[10-14]。且有研究表明，苦参碱在人白血病细胞、乳腺癌以及人鼻咽癌细胞中，均可通过抑制Wnt/β⁃catenin信号通路的激活降低癌细胞生长活性和诱导其分化^[15]。故本研究将基于Wnt/β⁃catenin信号通路研究苦参碱抑制宫颈癌细胞系Caski细胞侵袭迁移的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞系Caski细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。苦参碱（上海源叶公司）；MTT、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、 DMEM高糖培养基（北京索莱宝生物科技有限公司）；Transwell小室（Millipore公司，美国）；基质胶 （Matrigel，BD公司，美国）；胎牛血清（fetal calf se⁃ rum，FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；MMP⁃9ELISA试剂盒、VEGF ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；RIPA裂解液、SDS⁃PAGE凝胶试剂盒、山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；TRIzol、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗β⁃catenin单克隆抗体、兔抗p⁃β⁃catenin单克隆抗体（Abcam公司，英国）。引物序列：GSK⁃3β上游5′⁃CACCTCTGGC⁃ TACCATCCTTAT ⁃ 3′，下游5′ ⁃ATTATTGGTCTGTC⁃ CACGGTCT ⁃ 3′；Wnt2B上游5′ ⁃ GTGTCCTGGCTG⁃ GTTCCTTA ⁃ 3′，下游5′ ⁃ AGCTGGTGCAAAGGAA ⁃AGAA⁃3′；GAPDH上游5′⁃AAGGCTGTGGGCAAGG⁃ 3′，下游5′⁃TGGAGGAGTGGGTGTCG⁃3′。

1.2 方法

1.2.1 MTT细胞增殖实验

取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，计数后配制成1.5×10⁵ 个/mL，以每孔100 μL加入96孔板中， 37℃、饱和湿度、5%CO₂细胞培养箱培养24h后，分别以0.1、0.2、0.4、0.8、1.6g/L终浓度加入苦参碱，每组设6个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，分别处理24、48、72h后，每孔加入20mL MTT溶液（5mg/mL），继续培养4h后，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO溶解MTT，于490nm处检测光密度 （optical density，OD）值，计算抑制率，抑制率=[（OD _空白组-OD _实验组）/OD _空白组]×100%。

1.2.2 细胞侵袭实验

将Transwell小室放入24孔板，4℃预冷后，上室加入1∶4稀释的Matrigel，待凝固后，上室加入无血清培养基配制的细胞悬液400 μL，下室加入20%FBS的培养基，待细胞沉降后上室分别加入0.4、0.8g/L终浓度苦参碱，每组设6个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24h后，取出小室，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后20℃预冷甲醇固定5min，用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，结晶紫染色5min，PBS漂洗，拍照，计数。

1.2.3 细胞迁移实验

将Transwell小室放入24孔板孔，上室加入无血清培养基配制的细胞悬液400 μL，下室加入20%FBS的培养基，待细胞沉降后上室分别加入0.4、0.8g/L终浓度苦参碱，每组设6个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24h后，取出小室，PBS漂洗后-20℃预冷甲醇固定5min，用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，结晶紫染色5min，PBS漂洗，于倒置显微镜观察拍照，统计细胞迁移率。

1.2.4 ELISA实验

取对数生长期细胞，加入0.4、0.8g/L终浓度苦参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24h后，收集无血清培养基，参照ELISA试剂盒说明书检测培养基中MMP⁃9、VEGF含量。

1.2.5 qRT⁃PCR实验

取对数生长期细胞，加入0.4、0.8g/L终浓度苦参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24h后，加入1.5mL TRIzol于冰上吹打细胞，室温静置5min，13 000r/min离心5min，吸取上清，加入氯仿，静置离心，吸取上清加入异丙醇，静置离心，弃去上清，75%乙醇清洗沉淀，离心弃上清，保留沉淀干燥，用DEPC水溶解。然后按照TaKaRa反应试剂盒依次经过去除基因组DNA反应、反转录反应和qPCR进行扩增，扩增程序为：95℃ 10min预变性；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s 40个循环。2^-ΔΔCt计算基因的表达量，其中ΔΔCt=（待测样品目的基因的Ct平均值-待测样本看家基因的Ct平均值）-（对照样品目的基因的Ct平均值-对照样本看家基因的Ct平均值）。

1.2.6 Western blot实验

取对数生长期细胞，加入0.4、0.8g/L终浓度苦参碱，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24h后，加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至匀浆后，4℃ 放置30min，13 000r/min离心10min，取一部分上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度，另取部分上清加入4×上样缓冲液，煮沸变性后，加到4%浓缩胶浓缩， 10%分离胶分离，再经过转膜、封闭，4℃孵育一抗 （其中β⁃catenin抗体以1∶2 500稀释，p⁃β⁃catenin抗体以1∶1 000稀释），室温孵育二抗，ECL发光液显色，X医用胶片显影、定影等步骤，最后进行拍照分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，所有数据均以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD⁃t 检验，P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 苦参碱对Caski细胞增殖的影响

随着苦参碱浓度的不断升高，Caski细胞增殖抑制率呈逐渐增大的趋势。在苦参碱浓度＞0.1g/L时，相同浓度下，对Caski细胞的抑制率随作用时间的延长而逐步增大（图1），显示苦参碱对Caski增殖抑制作用具有时间、浓度的依赖性。

2.2 苦参碱对Caski细胞侵袭的影响

随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞侵袭的数量逐渐减少，且与空白组相比，0.4、0.8g/L处理组差异均具有统计学意义（P ＜0.01，图2）。

2.3 苦参碱对Caski细胞迁移的影响

随着苦参碱处理浓度的升高，Caski细胞迁移的数量逐步减少，且与空白组相比，0.4、0.8g/L处理组差异均具有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01，图3）。

2.4 苦参碱对Caski细胞MMP⁃9、VEGF含量的影响

随着苦参碱处理浓度的升高，Caski细胞上清培养液中MMP⁃9、VEGF含量均逐步降低，与空白组相比，0.4、0.8g/L处理组差异均具有统计学意义（P ＜ 0.05，P ＜0.01，表1）。

2.5 苦参碱对Caski细胞GSK⁃3β、Wnt2B mRNA表达的影响

随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞内GSK⁃3β mRNA表达量逐渐增加，Wnt2B mRNA表达量逐渐减少，与空白组相比，0.4、0.8g/L处理组差异均具有统计学意义（P ＜0.05，P ＜0.01，图4）。

与空白组相比，* P ＜0.05，**P ＜0.01，n=3。

2.6 苦参碱对Caski细胞β⁃catenin蛋白及其磷酸化的影响

随着苦参碱处理浓度的逐步升高，Caski细胞内 β⁃catenin蛋白含量逐渐减少，p ⁃β⁃catenin（phospho S37）蛋白含量逐渐增多，且与空白组相比，0.4、0.8g/L处理组差异均具有统计学意义（P ＜0.01，图5）。

3 讨论

大量研究表明苦参碱具有显著的抗癌作用，其可抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、阻止血管生成、侵袭、迁移，且其不良反应小^[16]，目前，苦参碱在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中的作用已有大量研究，表现出良好的抗癌作用^[17-19]。但苦参碱对宫颈癌抗癌作用的研究报道较少，本研究选取人宫颈癌细胞系Caski细胞为对象进行研究，发现随着浓度的升高，苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用显著升高，与空白对照组相比，差异具有统计学意义，在相同浓度下随着时间的增加，苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用显著升高，提示苦参碱对Caski细胞的增殖抑制作用也具有剂量、时间依赖性。

肿瘤发生侵袭迁移是恶化的标志，抑制肿瘤的侵袭迁移可以有效降低病死率^[20]。本研究发现苦参碱可有效抑制Caski细胞的侵袭迁移，并表现出一定的剂量依赖性。近年来研究发现，Wnt/β⁃ catenin通路与多种肿瘤的侵袭迁移相关，该通路可影响肿瘤胞外基质的降解、血管生成以及细胞迁移黏附，本研究发现苦参碱可以抑制Caski细胞分泌MMP⁃9、VEGF，MMP⁃9具有降解胞外基质，促进细胞侵袭的作用。VEGF通过诱导血管内皮细胞增殖、迁移促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞的迁移提供通道^[21-22]，大量研究表明基质金属蛋白酶家族 （matrix metalloproteinase，MMP）作为肿瘤侵袭转移的促进因子与Wnt/β⁃catenin信号通路密切相关^[23-24]。 MMP作为Wnt信号通路下游的直接靶点，β⁃catenin与膜型基质金属酶⁃1（membrane type1matrix metal⁃ loproteinases，MT1⁃MMP）的共同作用可促进细胞的迁移、侵袭和转移^[25]，Zhang等^[26] 发现VEGF启动子上游具有Wnt信号通路调节序列，Wnt信号通路可明显上调VEGF的表达，故本研究推测苦参碱抑制Caski细胞侵袭迁移通过抑制经典的Wnt/β⁃catenin信号通路实现。Wnt2B是Wnt信号通路的胞外信号，与Wnt受体结合后可激活该通路，本研究发现苦参碱可抑制Caski细胞Wnt2B mRNA的表达，因此，苦参碱可能首先通过抑制Wnt2B分泌使Caski细胞Wnt信号通路整体处于低活性状态。研究显示Wnt信号通路的调节关键在于β⁃catenin的稳定，当β⁃ catenin水平低下时，Wnt通路关闭，反之，Wnt通路开启^[27]；而维持β⁃catenin稳定的关键蛋白是GSK⁃ 3β，在没有Wnt信号刺激的情况下，胞质内的GSK⁃ 3β能与其他蛋白例如结肠腺瘤性息肉病（adenoma⁃ tous polyposis coli，APC）蛋白、轴蛋白（axin）等以复合物的形式磷酸化β⁃catenin氨基末端Ser/Thr位点，使β⁃catenin泛素化降解，维持细胞内β⁃catenin的低水平状态。β⁃catenin处于低水平状态，Wnt通路关闭。在有Wnt信号刺激的情况下，由细胞分泌的Wnt2B蛋白与细胞表面受体卷曲同源物（frizzled， FZD）和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related protein，LRP5/6）结合后，即触发细胞内的信号转导：细胞内蛋白散乱蛋白 （dishevelled，Dsh）被活化，继而活化的Dsh与Axin及Frat1相结合，后两者与GSK⁃3β和APC形成复合物，T细胞淋巴瘤的原癌基因1（frequently rear⁃ ranged in advanced T cell lymphomas⁃1，FRAT1）介导GSK⁃3β从Axin上脱离，不能磷酸化β⁃catenin。本研究发现苦参碱可诱导Caski细胞内GSK⁃3β mRNA的表达，与空白对照组相比，随着苦参碱浓度的升高，药物处理组GSK⁃3β mRNA表达越来越多。随着Caski细胞内GSK⁃3β表达量的增多，其与更多的 β⁃catenin结合，打破胞内β⁃catenin磷酸化平衡反应，使更多β⁃catenin磷酸化降解，正如本研究所显示随着苦参碱处理浓度的增高，Caski细胞内β⁃catenin含量减少，p⁃β⁃catenin含量增多。大量β⁃catenin被苦参碱诱导降解，导致β⁃catenin在细胞内积累受阻，抑制β⁃catenin转移到细胞核与转录因子TCF相结合，在其他因子的辅助下协同激活靶基因如VEGF、 MMP等侵袭迁移相关因子的表达。

综上，苦参碱可通过抑制Caski细胞Wnt/β⁃ catenin通路中Wnt2B mRNA表达以及β⁃catenin蛋白含量，降低Caski细胞MMP⁃9、VEGF的分泌，进而抑制Caski细胞的侵袭迁移。

参考文献