结直肠癌是世界上最常见的癌症之一，也是与癌症相关死亡的第二大原因^[1]。近年来，尽管发达国家的结直肠癌发病率已开始下降，但发展中国家的结直肠癌发病率仍保持急剧上升的态势^[2]。外科手术是目前结直肠癌的主要治疗手段，但术后往往因发生转移或复发而影响预后^[3-4]。远处转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，肝脏是结直肠癌患者最常见的转移位点^[1]。辅助放化疗可以降低术后复发率和转移率、提高患者的长期生存率。伊立替康（CPT⁃11）是一种选择性拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，临床上广泛应用于肿瘤治疗，包括转移性结直肠癌复发患者以及恶化病例的治疗。有研究报道，CPT⁃ 11可抑制食管癌EC109细胞增殖并具有放射增敏作用^[5]，而有关伊立替康联合X线的联合应用对人结肠癌细胞系HCT⁃116的作用研究尚未曾报道，故本实验研究CPT⁃11对人结肠癌细胞系体外增殖以及放射敏感性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

HCT ⁃116细胞购自中国科学院上海细胞所， CPT ⁃ 11、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐 （MTT）、普通RIPA裂解液和AO染色液均购自北京索莱宝科技有限公司，RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，兔抗p53、p21及内参GAP⁃ DH抗体购自美国Immunoway公司；CO₂恒温培养箱购自美国Thermo Forma公司，酶标仪购自美国BIO⁃ RAD公司，全自动蛋白质印迹定量分析系统购自美国Protein Simple公司，荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 HCT⁃116细胞的体外培养及传代

HCT⁃116细胞培养于含10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基中，加入100U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，于37℃、5%CO₂ 的饱和湿度培养箱中传代培养。用倒置显微镜观察细胞生长状况，每3d传代1次，选对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT实验

常规消化对数期细胞后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液配制单细胞悬液，以每孔2 000个细胞密度接种到96孔板，每孔体积为200 μL。贴壁后，用不同浓度CPT⁃11（10、20、30、40、50 μg/mL）作用24h或单次不同剂量X线（3、6、9、12、15Gy）照射，每个剂量组3个复孔。继续培养48h，每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4h，终止培养。每孔加150 μL DMSO并振荡10min。在酶标仪490nm波长处测定各孔吸光度值。细胞增殖抑制率=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。

1.2.3 克隆形成实验

常规消化对数期细胞后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液配制单细胞悬液，以每孔1 000个细胞密度接种到6孔板，每孔体积为200 μL。贴壁后，6Gy X线照射（照射组）或预先用10 μg/mL浓度CPT⁃11作用24h后联合6Gy X线照射（联合处理组），继续培养10d后，加入5mL甲醇固定10min。加入适量0.1%结晶紫染色15min，在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。计算公式为：克隆形成率=（克隆形成平均数/接种细胞数）×100%。实验重复3次。

1.2.4 蛋白提取和全自动蛋白表达定量分析

常规收集3组细胞，并用预冷PBS洗1遍，每瓶细胞加入200 μL RIPA裂解液于冰上裂解10min。将裂解后的样品12 000 g 离心5min，取上清，BCA法测蛋白浓度。按照Wes标准流程上机检测，终浓度为1mg/mL。

1.2.5 AO/EB实验

常规消化对数期细胞后，接种到6孔板。贴壁后，6Gy X线照射（照射组）或预先用10 μg/mL浓度CPT ⁃11作用24h后联合6Gy X线照射（联合处理组）。继续培养24h后，加入5mL甲醇固定10min。加入AO/EB工作液，室温避光染色20min，倒置荧光显微镜下计数并拍照。吖啶橙可透过正常细胞膜，故细胞核呈绿色荧光；对于凋亡细胞，因染色质固缩或断裂形成凋亡小体，表现为黄绿色荧光。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组细胞增殖率比较采用广义线性模型分析，以剂量作为自变量，试验组别作为分组因素，剂量和组别的乘积作为交互因素，对不同试验组别得到的两条直线的斜率进行比较，若交互项有统计学意义，说明自变量剂量对结果变量细胞增殖率的影响在不同组别中有差异。以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CPT⁃11对HCT⁃116细胞增殖的抑制作用

采用MTT法检测10~50 μg/mL的CPT⁃11作用HCT⁃116细胞后的增殖情况，结果显示在此范围内呈剂量依赖性抑制细胞增殖（图1）。根据以往的研究，CPT⁃11对HCT⁃116细胞的IC₂₀ 为9.64 μg/mL，为避免CPT⁃11的毒性作用，本实验选择10 μg/mL进行后续研究。

2.2 单次不同剂量X线照射对HCT⁃116 细胞增殖的影响

对于经10 μg/mL CPT⁃11预处理24h的HCT⁃ 116细胞和对照HCT⁃116细胞分别给予3、6、9、12、 15Gy X线照射，恢复24h后，采用MTT法检测细胞增殖情况，发现联合处理组增殖抑制率大于照射组，差异有统计学意义（F=55.34，P< 0.001）。随着照射剂量的增加，联合处理组的增殖抑制作用更加明显，差异有统计学意义（P< 0.05，图2）。

2.3 CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞克隆形成的影响

通过克隆形成实验，检测对照组、照射组和联合处理组集落形成情况，结果与对照组相比，照射组和联合处理组的集落形成数量都明显减少，差异有统计学意义（P< 0.01）；且联合处理组的集落形成数量少于照射组（P< 0.05，图3）。

2.4 CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞凋亡的影响

与对照组相比，照射组和联合处理组的凋亡率均升高，差异有统计学意义（P< 0.05），且联合处理组的凋亡率更高，明显大于照射组（P< 0.05，图4）。

2.5 CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞p21、p53 表达的影响

X线照射后，恢复6h，与对照组相比，照射组和联合处理组的p21和p53蛋白均升高，差异有统计学意义（P< 0.05），且联合处理组的p21和p53蛋白水平高于照射组（P< 0.05，图5）。

3 讨论

CPT⁃11是喜树碱（camptothecin，CPT）的一种水溶性半合成衍生物。因为CPT⁃11的广泛抗肿瘤活性，临床上用于肺癌、胃癌、卵巢癌和淋巴癌等多种肿瘤的治疗^[6]。在DNA复制以及转录过程中，其通过与拓扑异构酶⁃1（Topo ⁃1）结合，共同形成DNA Topo⁃1复合物。在此过程中，CPT⁃11及活性代谢产物（SN⁃38）可以通过与该复合物结合，从而阻断DNA复制而达到抗肿瘤作用^[7-8]。目前，CPT⁃11已获批用于转移性结直肠癌的辅助治疗，而以往的多项研究也发现其联合放疗时能增加放疗效果^[5，9-11]。在伊立替康联合放疗治疗小细胞肺癌脑转移患者的报道中，其可显著降低患者的病死率，改善患者的生存状况^[11]，并且该治疗方法的有效性和安全性均较高，可有效提高疾病控制率，减少不良反应，提高患者的耐受程度。此外，CPT⁃11可有效抑制放疗早期宫颈癌细胞的增殖，提高放疗诱导的癌细胞凋亡率，结果显示宫颈肿瘤50%消退时间明显缩短，肿瘤体积缩小^[9]。大多数放疗增敏剂的作用机制是，通过抑制细胞增殖并诱导凋亡来增强放射线对细胞的杀伤作用，故本研究进一步探讨CPT⁃11联合X线照射对人结肠癌细胞HCT⁃116增殖和凋亡的影响。

CPT⁃11的主要不良反应是骨髓抑制和胃肠道不良反应，呈剂量依赖性，严重的腹泻反应限制了其临床应用。本研究结果显示，在10~50 μg/mL范围内，CPT⁃11呈浓度依赖的方式抑制HCT⁃116细胞增殖，与以往研究报道一致。为进一步研究CPT⁃11联合X线照射对HCT⁃116细胞的放疗增敏效果，本研究选择10 μg/mL的CPT⁃11处理，约为CTP⁃11对HCT⁃116细胞的IC₂₀浓度，毒性较轻。在MTT实验和克隆形成实验中，与对照组和照射组相比，联合处理组增殖率明显提高，且随着照射剂量的增加，联合处理组的增殖抑制作用更加明显。CPT⁃11在较低浓度下即具有增殖抑制和放射增敏作用，提示其临床应用中可采用低浓度CPT⁃11联合X线照射来提高结直肠癌的治疗效果，既可以减轻不良反应，还可以减轻患者负担、提高生存率。

放射治疗引起肿瘤细胞DNA损伤进一步引起凋亡，是肿瘤治疗的基本策略。为进一步研究CPT⁃ 11联合X线照射对HCT⁃116细胞凋亡的影响，AO/EB染色结果显示联合处理组细胞凋亡率显著提高， Western blot检测其p21和p53蛋白水平也高于照射组，进一步提示应用CPT⁃11可增加HCT⁃116对X线照射的敏感性，诱导其凋亡。p53是细胞内重要的抑癌基因，广泛参与DNA损伤修复、细胞周期调控和凋亡等过程，对维持基因组的完整性和稳定性至关重要^[12]。本研究中，HCT⁃116细胞接受电离辐射及CPT⁃11处理后时，p53能被迅速激活进而促进多种重要下游靶基因如p21的激活，从而促进凋亡的发生。

综上所述，CPT⁃11可抑制食管癌HCT⁃116细胞增殖并具有放射增敏作用，同时诱导凋亡，为临床上结肠癌的治疗提供一定的理论基础。

参考文献