急性T细胞淋巴细胞白血病（T⁃cell acute lym⁃ phoblastic leukemia，T⁃ALL），是恶性程度较高的血液病^[1]，由于逐渐累积的基因突变破坏了正常的胸腺细胞发育过程，包括细胞生长、增殖、存活和分化的正常控制，导致T细胞祖细胞发生转化^[2]。染色质解旋酶DNA结合蛋白4（recombinant chromodo⁃ main helicase DNA binding protein 4，CHD4），属于核小体重构和组蛋白脱乙酰酶复合体的重要成员之一^[3]，涉及许多致癌过程，与表观遗传密切相关，包括控制细胞周期进展，加速实体肿瘤转移，发动和维持多种肿瘤抑制基因沉默等^[4-6]。CHD4在T细胞发育过程中积极参与转录激活和抑制^[7]，CHD4可能对于T⁃ALL的发生发展很重要，但是具体的影响以及作用机制目前还不清楚。因此，本研究通过流式细胞技术检测和CCK⁃8检测探讨干扰CHD4基因表达对T⁃ALL细胞增殖和凋亡的影响，通过构建人CHD4基因启动子重组质粒，进一步探讨CHD4基因的转录调控，为了解T⁃ALL的发病机制提供新视角。

1 材料和方法

1.1 材料

T ⁃ALL细胞（Jurkat）和人胚胎肾T细胞（HEK 293T）均购于中国科学院上海细胞库。pGL3⁃Basic、内参报告基因质粒pRL⁃TK由本实验室保存。基因组DNA提取试剂盒、感受态大肠埃希菌（北京天根公司）。DMEM培养基、RPMI⁃1640培养基、青霉素和链霉素（Multicell公司，美国），进口胎牛血清（Sci⁃ en Cell公司，美国）；细胞凋亡检测试剂盒（杭州联科生物公司），细胞周期检测试剂盒、CCK⁃8检测试剂盒（南京福麦斯公司）；流式细胞仪（BD Biosciences公司，美国）；限制性内切酶 KpnⅠ、BglⅡ、T4DNA连接酶（Thermo Fisher公司，德国）；rTaq DNA聚合酶、DNA聚合酶TaKaRa LA Taq and GC buffer、双荧光素酶报告检测试剂盒、实时定量PCR试剂盒（TaKa⁃ Ra公司，日本）；5000DNA标准参照物、2000DNA标准参照物、核心启动子区NF⁃κB转录因子结合位点突变质粒pGL⁃mNF⁃κB（北京擎科公司），NF⁃κB表达质粒pcDNA3⁃NF⁃κB（吉凯基因）；质粒提取试剂盒、切胶回收试剂盒（Omega公司，美国），TRIzol、 Lipofectamine^TM 3000（Invitrogen公司，美国）；双荧光素酶报告分析系统（Promega公司，美国）；CHD4、 GAPDH和NF ⁃κB兔单克隆抗体（Abcam公司，美国）；ECL化学发光试剂盒（Biosharp公司，美国）， PVDF（聚偏氟乙烯）膜（GE Healthcare公司，美国）； EZ⁃Magna CHIP tm A试剂盒（Millipore公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

Jurkat细胞用RPMI 1640培养基，HEK293T细胞用DMEM培养基培养，两种培养基均含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及1%青霉素 （100U/mL）⁃链霉素（100mg/mL）溶液。两种细胞均置于具有一定湿度、37℃、5%CO₂的细胞培养箱中。所有实验均在细胞生长对数期进行。

1.2.2 流式细胞技术

流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡百分率。经qRT ⁃PCR分析确定siRNA ⁃CHD4转染Jurkat细胞24h后敲低效率最高，所以转染24后收集细胞，PBS洗涤3次，加入V⁃APC和7⁃AAD各5 μL，室温避光15min，使用流式细胞仪检测。细胞周期检测：采用细胞周期检测试剂盒，细胞转染siRNA⁃CHD4 24h后收集，95％乙醇4℃固定过夜，PBS洗涤3次，PI染色，37℃水浴30min，流式细胞仪检测。

1.2.3 CCK⁃8增殖分析

将Jurkat细胞以4×10³ 个/孔铺于96孔板，每组5个复孔，加10 μL CCK⁃8试剂，在5％CO₂、37℃条件下孵育2h后用酶标仪测量每个孔在450nm波长下的吸光度值，相同条件下连续测量4d。

1.2.4 CHD4基因候选启动子区生物信息学分析及克隆

CHD4基因候选启动子区生物信息学分析：从NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/） GenBank中获取人CHD4基因序列（编号：NC_ 000012.12）。利用UCSC网站（http：//genome.ucsc.edu/）进行对比，取转录起始位点上游2 000bp，下游100bp通过Neural Network Promoter Prediction （http：//fruitfly.org/cgi bin/seq_tools/promoter.pl）进行预测；再使用JASPAR（jaspar.genereg.net/）数据库5.0版对CHD4基因核心启动子的转录因子结合位点进行预测。

引物设计：以预测的CHD4基因候选启动子序列为模板，用Prime5.0设计引物，再对该区域5′侧翼区截短序列设计引物。上下游引物5′端分别加入限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ的酶切位点及保护碱基。共用下游引物：5′ ⁃GGAAGATCTGAGGGGC⁃ GTCTCTTTG⁃3′。上游引物分别是P1（pGL⁃1974/+117）：5′⁃CGGGGTACCAGTATCATCTTCCAGCCTC⁃ TAGA⁃3′；P2（pGL⁃918/+117）：5′⁃CGG GGTACCTGT⁃ GGGGCGACAGTAGGG⁃3′；P3（pGL⁃428/+117）：5′⁃ CGG GGTACCAGGGTTAGTTGCAAAAGGTCTG ⁃ 3′； P4（pGL ⁃233/+117）：5′ ⁃CGG GGTACCTGCCCAGGT⁃ GACGCGCGCGC⁃3′；P5（pGL⁃13/+117）：5′⁃CGG GGTACCGCCGGAGCCATTTTCCCC⁃3′（下划线部分为限制性酶切位点，斜体部分为保护碱基）。引物合成由上海英骏公司完成。

Jurkat细胞全基因组DNA提取：Jurkat细胞全基因组DNA提取按照基因组DNA提取试剂盒的说明书操作。

质粒构建：以Jurkat细胞全基因组DNA为模板，根据TaKaRa LA TaqandGC buffer催化酶说明书条件进行催化扩增，条件如下：94℃ 1min；94℃ 30s， 60℃ 30s，72℃ 2min，30个循环。用1%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。切胶回收试剂盒回收琼脂糖电泳产物。回收产物与pGL3⁃Basic载体均用限制性内切酶KpnⅠ、BglⅡ在37℃水浴条件下进行双酶切1h，酶切产物用切胶回收纯化试剂盒纯化，纯化产物用T4DNA连接酶在37℃水浴中连接30min。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，转化条件为4℃ 3min，42℃水浴1min 20s，4℃ 30min。取转化好的菌液加入1mL不含氨苄青霉素的LB培养液，置于37℃摇床倒置扩增1h，将扩增好的菌液涂于含有氨苄青霉素的固体LB培养板，于37℃、 5%CO2培养箱中倒置培养过夜。在长出菌落的LB板上挑取单克隆菌落，加入含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床倒置扩增3h，以扩增后的菌液为模板进行PCR扩增，PCR反应条件同前。用1%琼脂糖凝胶对PCR产物电泳30min，选取阳性菌液进行测序，将经测序鉴定正确的菌液加入含氨苄青霉素的LB培养液中于37℃摇床扩增过夜，扩增后的菌液用质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒标记为P1（pGL⁃1974/+117）。以构建成功的质粒序列为模板，共用同一下游引物，上游引物分别为P2~P5进行PCR，构建CHD4基因候选启动子区5′ 侧翼区截短序列质粒，方法同上。

1.2.5 基因敲低分析

双链siRNA的设计与合成由广州锐博生物科技有限公司完成，siRNA序列和阴性对照序列如下： siRNA⁃CHD4：5′⁃GCATGTCCTTACTAGAATT⁃3′（正义链），5′ ⁃ TAATTCTAGTAAGGACATGC ⁃ 3′（反义链）；siRNA⁃NF⁃κB：5′⁃GCACCTAGCTGCCAAAGAA⁃ 3（′ 正义链），5′⁃TTCTTTGGCAGCTAGGTGC⁃3（′ 反义链）；阴性对照：5′⁃UUCUCCGAACGUGUCACGUTT⁃ 3′（正义链），5′⁃ACGUGACACGUUCGGAGAATT⁃3′ （反义链）。

1.2.6 瞬时转染

Jurkat细胞以2×10 ⁵ 个/孔铺12孔板，12h后以500ng/mL siRNA或表达质粒转染细胞，转染24h后收取RNA，48h后收取蛋白质。启动子双荧光素酶检测，转染前18h将生长状态良好的细胞置于96孔板（1×10⁴ 个/孔），使用Lipofectamine^TM 3000将100ng CHD4启动子荧光素酶报告质粒和4ng pRL⁃TK质粒共同转染细胞。18h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。

1.2.7 免疫印迹法（Western blot）

用8%~12%的SDS⁃PAGE电泳分离总蛋白，在转移缓冲液中将样品电转移到PVDF（聚偏氟乙烯） 膜上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭PVDF膜2h， CHD4、GAPDH、NF⁃κB抗体在摇床上孵育目的条带4℃过夜。TBST缓冲液充分洗涤条带3次，将这些条带与相应的二抗在室温下孵育2h，TBST缓冲液充分洗涤条带3次后用电化学发光检测系统观察条带。

1.2.8 实时定量聚合酶链反应（qRT⁃PCR）

用TRIzol法提取总RNA，用Prime Script RT Master Mix Perfect Real Time Kit系列逆转录试剂将RNA逆转录为cDNA，以该cDNA为扩增模板，用实时定量PCR试剂盒进行qRT⁃PCR扩增。引物序列： GAPDH 5′ ⁃ GATCATCAGCAATGCCTCCT ⁃ 3′（正义链），5′⁃TGAGTCCTTCCACGATACCA⁃3′（反义链）； CHD4 5′ ⁃CAAAATGGCGGGAGTTCAGTA ⁃3′（正义链），5′⁃CTCTCCACCACAGCTACCG⁃3（′ 反义链）；NF ⁃ κB 5′ ⁃ AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG ⁃ 3′（正义链），5′ ⁃TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT ⁃3′（反义链）。qRT⁃PCR扩增条件：94℃ 预变性5min；90℃ 变性15s，60℃退火15s，72℃ 延伸1min，循环40次； 72℃ 延伸5min。反应仪器为Step One Plus Quanti⁃ tative Realtime PCR System。记录各反应孔对应C_t 值以计算mRNA相对表达量。内参基因为GAPDH，目的基因为人CHD4，CHD4mRNA的相对表达量 （2^-ΔΔCt）=CHD4mRNA拷贝数/GAPDH mRNA拷贝数；ΔΔCt=（Ct _{刺激组CHD4}-Ct _{刺激组GAPDH}）-（Ct _{对照组CHD4}-Ct _{对照组GAPDH}）。设对照组mRNA相对表达量为1。

1.2.9 双荧光素酶活性测定

收集96孔培养板中的细胞，弃去原培养基，用1×PBS洗涤3次，弃去PBS加入1×裂解缓冲液，室温振荡30min充分裂解细胞。按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，每孔取20 μL裂解液，分别加入20 μL底物缓冲液和20 μL终止缓冲液，混合后分别测定萤火虫荧光值和海肾荧光值。

1.2.10 CHIP实验检测

使用EZ⁃Magna CHIP tm A试剂盒，根据其说明书进行分析。将1×10⁷ 个Jurkat细胞在1%甲醛中室温固定10min，超声检测细胞裂解产物，产生200~1 000bp的DNA片段。然后用anti⁃IgG抗体、anti⁃ NF⁃κB抗体（Abcam ab194729）和anti⁃acetyl组蛋白H3抗体进行免疫沉淀反应。经反向交联和DNA纯化后，使用SYBR Green进行qRT⁃PCR分析。引物如下：上游引物5′ ⁃GGGTTGGAGTTGGTTGAGGT ⁃ 3′，下游引物5′ ⁃GGGTTGGAGTTGGTTGAGGT ⁃3′。 qRT⁃PCR扩增条件：94℃预变性5min；90℃变性15s， 60℃退火15s，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸5min。反应仪器为Step One Plus Quantitative Real⁃ time PCR System。记录各反应孔对应C_t值以计算mRNA相对表达量。用rTaq DNA聚合酶进行PCR反应。反应条件：94℃变性3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，热循环35次；最后72℃延伸5min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3 统计学方法

对实验数据应用Graphpad Prism7.0和SPSS软件进行统计学分析，实验结果以均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s） 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHD4基因促进Jurkat细胞增殖、抑制其凋亡

通过qRT ⁃ PCR和Western blot检测siRNA ⁃ CHD4的敲低效率。CCK⁃8实验发现CHD4对Jurkat细胞的增殖有促进作用。流式细胞术检测，与对照组相比，转染siRNA ⁃ CHD4的Jurkat细胞凋亡率 （55%~60%）明显上升。说明CHD4对Jurkat细胞的凋亡具有抑制作用。与对照组比较，转染siRNA⁃ CHD4的Jurkat细胞G0/G1期比例显著升高，而S期比例下降7%~10%（图1）。

2.2 生物信息学分析人CHD4基因候选启动子区域

首先在NCBI网站及UCSC网站比对确认CHD基因的启动子区域。运用Promoter 2.0Prediction Serve（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）预测转录起始位点上游约2 000bp、下游100bp区域，结果表明该区域具有启动子活性，再通过Neural Net⁃ work Promoter Prediction （http：//fruitfly.org/cgibin/seq_tools/promoter.pl）对该区域进行预测（图2）。

2.3 人CHD4基因候选启动子区扩增

CHD4基因预测启动子经PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示有特异性条带出现，长度为2 091bp，与预测片段大小相符（图3）。

2.4 人CHD4 基因候选启动子区5′侧翼区截短序列质粒构建

各截短序列质粒经 KpnⅠ、BglⅡ酶切，可见pGL3⁃Basic载体片段（4 818bp）和长度分别为2 091、 1 035、546、350、130bp的序列片段（图4）。

2.5 人CHD4基因候选启动子区活性检测

在HEK293T细胞和Jurkat细胞中进行荧光素酶检测,发现与阴性对照质粒pGL⁃3Basic相比，重组质粒P1（pGL⁃1947/+117）的荧光素酶相对活性明显增高，P1~P4的活性无明显差异（P ＞0.05），P5（pGL⁃ 13/+117）与其他截短节段质粒相比，启动子活性明显降低（P ＜0.05），与阴性对照pGL⁃3Basic相近。因此认为,CHD4基因启动子最小活性区域位于其5′侧翼区的-233bp至-13bp（图5）。

2.6 人CHD4 基因启动子核心区域转录因子结合位点预测

使用JASPAR（jaspar.genereg.net/）数据库5.0版，发现在-233~-13bp之间存在NF⁃κB、MZF1等转录因子结合位点（图6）。

2.7 转录因子NF⁃κB结合到CHD4基因启动子区

为进一步确定转录因子NF⁃κB与CHD4启动子区是否可以结合，进行了染色质免疫沉淀实验 （CHIP），根据启动子区的NF⁃κB结合位点，设计了相应的引物。PCR证实NF⁃κB结合的基因组DNA包含CHD4启动子区的NF⁃κB结合位点区域。因此，在Jurkat细胞中，转录因子NF⁃κB能与人CHD4基因启动子结合（图7）。

2.8 NF⁃κB对人CHD4基因的启动子活性具有正向调控作用

首先用siRNA⁃NF⁃κB和pcDNA3⁃NF⁃κB分别转染Jurkat细胞，分析其转染效率。用结合位点突变质粒、siRNA⁃NF⁃κB和pcDNA3⁃NF⁃κB分别瞬时转染Jurkat细胞。检测其荧光素酶活性，发现抑制NF⁃ κB后，CHD4基因的启动子活性下降；反之，当过表达NF⁃κB时，CHD4基因的启动子活性明显增加。同时，与野生型相比，转染含有转录因子结合位点突变序列的质粒后，CHD4基因启动子活性明显下降，这些结果说明人类CHD4基因启动子活性受NF⁃ κB的正向调控（图8）。

3 讨论

T⁃ALL的发生和发展是一个多基因突变的多阶段过程，其中最显著的变化之一是对细胞凋亡的抑制。虽然已经在诱导白血病细胞分化和促进其凋亡方面做了很多努力，但是治愈率并没有显著提高^[8]。 CHD4是NuRD的核心亚基，参与许多疾病的发展和进展，包括肿瘤发生、病毒感染、神经退行性变等，但其在这些疾病中的作用尚未完全了解^[5，9]。在某些情况下，它通过对抗染色质重构来对抗转录活性因子^[6，10]。在某些条件下CHD4可以促进转录，与促癌功能相关^[11]。鉴于这些调节转录活性的特点，我们猜测CHD4可能与T⁃ALL细胞凋亡有关。

CCK⁃8检测、流式细胞计数检测发现CHD4可以促进Jurkat细胞的增殖，抑制其凋亡，与之前的一些研究结果一致，异常表达的CHD4在T⁃ALL中起着原癌基因的作用^[12]。基因的转录调控是由启动子决定的。启动子通过与一些蛋白质结合来决定基因的活性，这些蛋白质被称为影响基因表达的转录因子。基因启动子部分的改变导致基因表达调控紊乱，常导致恶性肿瘤的发生^[13-14]。因此，本研究分析了CHD4基因启动子区域，以更好地理解CHD4在T⁃ALL中的内在机制。本研究克隆了其启动子，分析了Jurkat和HEK293T细胞的启动子区域结构和启动子活性。通过产生一系列5′缺失质粒，确定了核心启动子相对于TSS位于-233/-13bp区域。为进一步分析CHD4基因启动子最小活性区域内重要的调控元件，本研究通过转录因子结合位点预测，发现NF⁃κB、MZF1等转录因子结合位点。NF⁃κB在多种信号通路中与肿瘤发生和发展有关，其中细胞增殖和凋亡的信号通路被认为是最重要的通路之一^[15]。已有研究表明，NF⁃κB与成人T⁃ALL细胞的激活有关^[16]。因此，本研究进一步通过点突变技术分析CHD4启动子区的转录因子结合位点，证实NF⁃κB对CHD4基因的启动子活性具有正向调控作用；通过荧光素酶测试发现NF⁃κB表达降低时，人CHD4启动子活性降低，而NF⁃κB表达增高时， CHD4启动子活性明显增高。染色质共沉淀试验发现转录因子NF⁃κB与CHD4基因启动子相结合，进一步分析了CHD4基因转录调控的分子机制，为进一步研究T⁃ALL提供了新方向。

参考文献