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口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，约60%的患者发生局部复发，5年生存率较差[1]。临床亟需可用于OSCC诊断和治疗的特异性预后标志物。白细胞分化抗原109（cluster of differentiation 109， CD109）是一种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，属于α2⁃ 巨球蛋白/补体家族的成员。CD109是转化生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）的协同受体，可调节TGF⁃β受体的内吞和降解，从而抑制TGF⁃β信号通路[2]。CD109对TGF⁃β信号通路的调节很可能影响肿瘤的发生发展[3]。本研究通过检测口腔组织中CD109的表达，探究CD109表达对OS⁃ CC患者临床病理特征和预后的关系，为OSCC预后提供新的生物标志物。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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口腔组织取自2014年1月—2017年12月在江南大学附属医院口腔科接受手术或活检的118例患者。口腔组织标本包括OSCC组织118例，癌旁组织32例。样本采集前患者均未接受放化疗。男76例，女42例，中位年龄34.5岁（范围39~74岁）。临床资料来源于患者病历，根据第8期美国癌症联合委员会（Alternate Joint Communications Center，AJCC）癌症分期手册确定OSCC的疾病临床分期。本研究通过江南大学附属医院伦理委员会的批准，并获得所有患者的书面同意。
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TRIzol试剂、SuperScript Ⅳ First⁃Strand试剂盒、 SYBR荧光定量PCR试剂盒（Thermo公司，美国），兔抗人CD109多克隆抗体（Abcam公司，英国），His⁃ tostain链霉菌抗生物素蛋白⁃过氧化物酶（streptavi⁃ din⁃perosidase，SP）免疫组化染色试剂盒和苏木素染料（北京中杉金桥生物科技有限公司），二氨基联苯胺（武汉纯度生物科技有限公司）。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。
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1.2 方法
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1.2.1 实时定量聚合酶链反应（quantitative real ⁃ time polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）
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使用TRIzol试剂提取冷冻组织中的总RNA，使用SuperScript Ⅳ First⁃Strand试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR荧光定量PCR试剂盒和ABI Prism 7500HT序列检测系统进行定量扩增。引物序列如下：CD109上游5′⁃AAGCCAGTGAAAGGAGAC⁃ GTA ⁃ 3′，下游5′ ⁃ CCAGGGGAAGATAGATCCAGG ⁃ 3′，GAPDH上游5′⁃CTGGGCTACACTGAGCACC⁃3′，下游5′ ⁃ AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG ⁃ 3′。以GAPDH为参照基因，计算CD109mRNA相对表达量2-ΔΔCt。以上实验重复3次。
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1.2.2 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC） 染色
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组织芯片（tissue microarrays，TMA）由江南大学附属口腔医院病理科制作。所有组织标本均采用10%中性缓冲福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋。从供体蜡块中收取组织芯柱（直径2mm），并将其置于石蜡中，制成新的组织包埋块，4 μm切片。采用SP法对口腔TMA样本进行IHC染色，一抗使用兔抗人CD109多克隆抗体（1∶200），详细步骤参见His⁃ tostain SP免疫组化染色试剂盒说明书。IHC染色结果由两名病理医生在双盲情况下评估。根据CD109染色强度对样本组织中的细胞染色进行评分，分别为0分（阴性）、1分（弱阳性）、2分（中阳性）、3（强阳性）。最终染色评分=[3×强染色百分比+ 2×中度染色百分比+1×弱染色百分比]×100。最终染色评分范围从0（无染色）到300（100%细胞染色强阳性）。根据OSCC患者的生存预后情况，使用Xtile软件（http：//www.tissuearray.org）将CD109表达情况分为高表达和低或无表达，计算出cutoff值为115。
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1.3 统计学方法
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所有数据均采用SPSS 18.0统计软件包进行分析。计量资料以均值±标准差（ ± s）表示，两独立研究组间均数的比较采用成组t检验。对例数和率的比较采用Pearson卡方检验计算CD109与临床病理特征的相关性。采用Kaplan Meier法分析累计生存率。建立Cox比例风险回归模型，进行单因素和多因素分析，先进行单因素分析，对P< 0.01的因素再进行多因素分析，确定预后因素。P ＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
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2.1 CD109 mRNA在OSCC组织中高表达
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采用qRT⁃PCR检测25例OSCC组织及对应癌旁组织中CD109mRNA的表达水平。结果显示， OSCC组织中CD109mRNA的表达量显著高于癌旁组织（P ＜0.05，图1）。
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2.2 CD109蛋白在OSCC组织中高表达
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IHC检测CD109蛋白在OSCC组织和口腔癌旁组织中的表达。结果显示，定位于细胞膜的CD109在OSCC组织中高表达（图2），OSCC组织中CD109的高表达率为59.32%（70/118），高于癌旁组织 （18.75%，6/32）（表1）。
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2.3 OSCC中CD109表达与临床特征的相关性
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分析OSCC组织中CD109表达与病理参数的相关性。CD109表达水平与淋巴结转移（χ2=7.968，P=0.019）、远处转移（χ2=6.681，P=0.007）和AJCC分期 （χ2=4.189，P=0.031）显著相关，而与性别、年龄、吸烟、分化程度或肿瘤大小无相关性（表2）。
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图1 CD109mRNA在OSCC组织及癌旁组织中的表达
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Fig.1 Expression of CD109mRNA in OSCC tissues and paracancerous tissues
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图2 OSCC组织及癌旁组织中CD109蛋白的表达（IHC）
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Fig.2 CD109protein expression in OSCC tissues and paracancerous tissues（IHC）
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2.4 OSCC中CD109表达与患者预后的关系
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进行单因素和多因素分析以确定OSCC患者的预后因素。单因素分析显示，CD109表达（P ＜ 0.001）、肿瘤大小（P=0.041）、淋巴结转移（P ＜ 0.001）、远处转移（P=0.018）和AJCC分期（P ＜ 0.001）与OSCC患者的总生存期显著相关。多因素分析显示CD109高表达（HR：1.182，95%CI：1.325~2.57 4，P ＜0.001）、淋巴结转移（HR：1.308，95%CI： 1.147~1.718，P=0.015）和AJCC分期（HR：1.136， 95%CI：1.028~1.360，P=0.032）是OSCC患者的独立预后因素（表3）。 Kaplan ⁃ Meier生存曲线证实CD109高表达与较短的总生存期相关（图3）。
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3 讨论
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CD109是一种锚定糖基磷脂酰肌醇的细胞表面糖蛋白，最初是通过针对原始淋巴/髓系KG1a的单克隆抗体检测到的细胞表面抗原[4]。研究表明， CD109表达于CD34+ 骨髓单核细胞、间充质干细胞、 T淋巴母细胞、凝血酶激活的血小板、白血病原巨核细胞和内皮细胞，但在新鲜外周血白细胞和正常骨髓白细胞中不表达[5-6]。研究还显示，CD109携带双等位基因血小板特异性同种异体抗原Gov，与血小板输注困难、输注后紫癜和新生儿同种免疫性血小板减少有关[5]。
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图3 CD109表达与OSCC患者总体生存率的关系
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Fig.3 The relationship between CD109expression and overall survival rate of OSCC patients
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癌变是一个多阶段过程，基因、蛋白质及其他分子在该过程中发生了一系列变化，可作为有临床价值的肿瘤分子标志。癌细胞特异性膜蛋白被认为是最合适的生物标志物，有助于了解肿瘤进展、开发诊断工具和确定新治疗靶点。除乳腺、泪腺、唾液腺的肌上皮细胞、前列腺基底细胞和支气管上皮外，CD109在大多数正常的人体组织低表达或不表达[7]，而在许多类型的肿瘤中高表达，如肺癌[8]、移行细胞癌[9]、胰腺癌[10]、恶性黑色素瘤[11]、食管鳞状细胞癌[12] 等。因此，CD109是具有潜在研究价值的肿瘤分子标志物。
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本研究结果表明，OSCC组织中CD109mRNA和蛋白表达水平均显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义（P ＜0.05）。Hagiwara等[13] 在OSCC和癌前病变中观察到CD109的高表达，提示CD109在预测癌前病变向口腔癌转变中的作用，但并未分析CD109表达与其他病理特征和患者预后的关系。同样，Dong等[14] 发现CD109在膀胱鳞状细胞癌和腺鳞癌中表达，但在腺癌或正常胆囊组织中不表达。与腺癌、大细胞癌和小细胞癌相比，CD109在肺鳞状细胞癌中表达更为频繁[15]。CD109在体外正向调控乳腺癌细胞的增殖，三阴性乳腺癌中CD109蛋白表达明显高于非三阴性乳腺癌[16]。以上证据表明CD109在肿瘤癌变过程中发挥了重要作用，但在肿瘤进展过程中发挥的作用及机制仍需进一步探究。本研究分析了118例OSCC组织及其相关临床资料，以探讨CD109表达与临床病理特征之间的关系。研究结果显示CD109的表达与淋巴结转移、远处转移和AJCC分期显著相关，CD109高表达在发生淋巴结转移、远处转移或AJCC（Ⅲ+Ⅳ）期患者中更为常见。这些结果表明CD109可能参与了OSCC的转移。
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目前关于CD109表达对癌症患者预后影响的研究结果存在矛盾。在黏液纤维肉瘤、软组织肉瘤和肝细胞癌中，CD109高表达与较差的预后相关[3，17]。此外，在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中，CD109高表达与1年生存率低显著相关[18]，而CD109在移行细胞癌患者中的表达与较好的预后相关[10]。本研究中单因素Cox回归分析显示CD109表达、肿瘤大小、淋巴结状态、远处转移、AJCC分期与OSCC患者生存期相关。多因素分析进一步证实CD109表达、淋巴结转移、AJCC分期是影响OSCC患者预后的独立因素。Kaplan⁃Meier生存曲线证明了CD109水平高预示着较短的总生存期。以上结果表明，CD109表达水平与OSCC患者预后密切相关。
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综上所述，本研究证明了CD109在OSCC组织中高表达，且CD109高表达的OSCC患者预后较差，证实了CD109与OSCC的发生发展及预后有一定相关性。CD109有望成为新的OSCC预后标志物，但其在OSCC中的作用机制仍需进一步研究。
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摘要
目的：研究白细胞分化抗原109（cluster of differentiation 109，CD109）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcino⁃ ma，OSCC）中的表达并探讨其与患者临床特征及预后的关系。方法：采用实时定量PCR和免疫组织化学法检测OSCC组织中 CD109 mRNA 和蛋白的表达；结合临床病理资料分析 CD109 表达与临床特征及患者预后的关系。结果：在 OSCC 组织中， CD109的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织（P＜0.05）；CD109表达与淋巴结转移（P =0.019）、远处转移（P =0.007）和美国癌症联合委员会癌症分期（P =0.031）相关；多因素分析证实CD109表达水平是OSCC 患者的独立预后因素（P＜0.001）；与 CD109低或无表达的OSCC患者相比，CD109高表达的OSCC患者总生存期更短（P =0.004）。结论：CD109是影响患者预后的独立危险因素，可能成为判断OSCC预后的肿瘤标志物。
Abstract
Objective：This study aims to investigate the expression of CD109 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）and its influence on clinical characteristics and prognosis. Methods：The expression of CD109 mRNA and protein in OSCC tissues were detected by real ⁃ time quantitative PCR and immunohistochemistry respectively. The relationships between CD109 expression and clinical characteristics and prognosis were analyzed according to clinicopathological data. Results：The mRNA and protein expression levels of CD109 in OSCC tissues were significantly higher than those in paracancerous oral tissues. CD109 expression was associated with lymph node metastasis（P =0.019），distant metastasis（P =0.007）and cancer stage according to American Joint Committee（P = 0.031）. Multivariate analysis confirmed that CD109 expression was an independent prognostic factor for OSCC patients（P < 0.001）. OSCC patients with high CD109 expression had a poor overall survival compared with patients with low or none CD109 expression（P = 0.004）. Conclusion：CD109 is an independent risk factor affecting the prognosis of OSCC patients，and may be an important marker to predict the prognosis of OSCC.
Keywords
CD109 ； oral squamous cell carcinoma ； prognosis ； tissue microarray