大鼠Thy⁃1肾炎（Thy⁃1nephritis，Thy⁃1N）是一种公认的研究人类系膜增生性肾小球肾炎（mesan⁃ gial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）的动物模型^[1-2]，给大鼠注射抗Thy⁃1抗原的抗体后，该抗体能与大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMC）表面的Thy⁃1抗原结合，继而激活补体，引起炎症反应和GMC增生病变。已知补体作用靶细胞可分为全溶解型（lytic）和亚溶解型（sublytic）， sublytic C5b⁃9虽不能导致细胞溶破，但能促发多种生物学反应^[3]。本课题组以往研究证实，Thy⁃1N病变具有补体C5b⁃9依赖性，尤其是sublytic C5b⁃9依赖性。Thy⁃1N大鼠肾组织内和体外受sublytic C5b⁃9刺激的大鼠GMC中，多种炎症因子如白介素（inter⁃ leukein，IL）⁃6、IL⁃23和IL⁃36a表达显著上调，且参与肾组织炎性病变^[4-9]。但是，其他炎症因子或介质在Thy⁃1N发病过程中发挥何种作用目前尚不知晓。

本课题组前期实验发现，Thy⁃1N大鼠肾组织中和体外受sublytic C5b⁃9刺激的大鼠GMC中，炎症介质S100A8的mRNA和蛋白表达均显著上调。S100蛋白家族是仅存在于脊椎动物中的低分子量蛋白^[10]，于1965年由Moore等^[11] 在牛脑中首次发现，因其可100%溶于饱和硫酸铵而得名。S100蛋白家族共计20余个成员，包括S100A1⁃A18、S100B、S100P等^[12-13]，且具有组织和细胞特异性以及结合Ca²⁺ 的能力^[12]。在损伤或应激等因素的作用下，S100蛋白被释放到细胞外，促发组织炎症反应^[13]。已发现， S100在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）等免疫性疾病中发挥了重要的促炎作用^[14]。另有研究报道，在心肌梗死后发生的炎症中，梗死灶中的中性粒细胞释放的S100A8可与TLR⁃4结合，促进NLRP3炎症小体释放IL⁃1β，后者可增强骨髓中粒细胞的分化，进而加重炎症反应^[15]。

为了研究Thy⁃1N大鼠GMC中S100A8基因表达的转录调控机制，本课题组前期又筛查了Thy⁃1N大鼠肾组织内和体外受sublytic C5b⁃9刺激的大鼠GMC中上调的转录因子，发现性别决定区Y框蛋白7（SRY⁃related HMG⁃box gene7，SOX7）的mRNA和蛋白表达均显著上升（资料未发表）。SOX7是一种含有高迁移率族框结构域的转录因子，可与启动子区DNA序列结合启动靶基因转录，发挥相应的生物学功能。目前发现的SOX家族根据HMG结构的氨基酸序列分为A、B1、B2、C、D、E、F、G和H亚群，共20余个成员，其中SOX7属于F亚群^[16-17]。有文献报道，SOX7作为抑癌基因可通过Wnt/β⁃catenin信号通路抑制胶质瘤细胞的增殖^[16]。此外，SOX7还可通过Notch信号通路促进血管生成^[18]。本课题组前期实验发现，在大鼠GMC中过表达SOX7可上调S100A8基因的表达（资料未发表），另生物信息学软件预测提示大鼠S100A8基因启动子区含有SOX7的结合元件，但是上调的SOX7能否直接促进S100A8基因的转录，目前尚不清楚，故本实验拟对此问题展开研究。首先构建大鼠S100A8基因启动子全长和截短质粒，与大鼠S100A8过表达质粒共同转染HEK⁃293T工具细胞，观察SOX7对S100A8基因启动子活性的影响，同时筛选SOX7与S100A8基因可能的结合元件，并对上述SOX7结合元件进行突变分析，拟为进一步研究Thy ⁃1N大鼠GMC中SOX7促进S100A8基因启动和转录的机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T（HEK⁃293T）细胞购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。 pGL3⁃basic和pRL⁃SV40荧光素酶报告质粒以及双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega公司，美国）；基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化技术有限）；SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；高保真酶PrimeSTAR@Max DNA Polymerase、限制性内切酶 KpnⅠ、SmaⅠ 和T4DNA连接酶（TaKaRa公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

登录NCBI，通过Gene数据库中搜索大鼠S100A8基因（ID：116547），利用Primer 5.0软件辅助设计针对S100A8基因启动子区（-2 068~+174nt）的引物，上游：5′ ⁃ GGGGTACCATCCTAGCAGATGT⁃ GAGATGG ⁃ 3′；下游：5′ ⁃ TCCCCCGGGGCTACTC⁃ TATTCCCCCAACTC⁃3′，并在上下游引物序列前加入 KpnⅠ、SmaⅠ酶切位点序列，后交由滁州通用生物系统有限公司制备。

1.2.2 大鼠S100A8基因启动子全长序列的扩增

以大鼠基因组DNA为模板，用PrimeSTAR@Max DNA Polymerase进行PCR反应，反应体系： PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，上、下游引物各2 μL，基因组DNA 2 μL，灭菌双蒸水19 μL；反应程序：98℃变性10s；60℃退火15s，72℃ 延伸2min，循环30次；扩增产物经SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒回收。

1.2.3 大鼠S100A8基因启动子全长荧光素酶报告质粒的构建与鉴定

将pGL3⁃basic质粒与S100A8基因启动子PCR产物与限制性内切酶KpnⅠ和SmaⅠ 37℃水浴2h，利用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒分别回收线性化的pGL3⁃basic质粒和S100A8启动子PCR产物，再通过T4DNA连接酶进行连接反应（16℃，8~12h），并将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，将其均匀涂布于含Amp抗性的LB平板琼脂表面，于37℃ 中培养12h后，挑取5个单克隆菌落于3mL含有Amp抗性的液体LB培养基中，37℃震荡培养12h。取1 μL培养后的菌液作为模板DNA进行PCR鉴定，筛选出的阳性克隆送通用生物系统（安徽）有限公司测序鉴定，将构建成功的质粒命名为pGL3⁃ S100A8⁃FL。

1.2.4 大鼠S100A8基因启动子截短和突变质粒的构建与鉴定

利用JASPAR软件预测S100A8基因启动子区SOX7的结合元件，并根据预测结果通过通用生物系统（安徽）有限公司构建4个S100A8基因启动子截短质粒。后由该公司将S100A8基因启动子-86~-57nt区SOX7结合元件5′ ⁃GAAATGCTCAATGT⁃ GCTCAGTGATTGCCAC ⁃ 3′突变为5′ ⁃GGGCGCGC⁃ GCGCTATAGGGCGCGCGCGCCC⁃3′，突变质粒命名为pGL3⁃S100A8⁃M。

1.2.5 重组质粒转染HEK⁃293T细胞

将HEK⁃293T细胞接种于24孔板中（1×10⁵ 个/孔），培养24h后，用Lipofectamine2000将pIRES2 ⁃ SOX7、pRL⁃SV40分别与S100A8基因启动子全长质粒及各截短质粒转染HEK⁃293T细胞。

1.2.6 荧光素酶活性的测定

待上述质粒共转染HEK⁃293T细胞48h后，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒中PLB裂解液稀释后裂解细胞，收集细胞裂解产物，分别检测S100A8基因启动子质粒及内参照质粒（pRL ⁃ SV40）的荧光活性，其中，目的基因的萤火虫荧光素酶活性（M1）/pRL⁃SV40质粒的海肾荧光素酶活性（M2），即为被检测质粒的相对荧光素酶活性 （RLU）。

1.3 统计学方法

所得定量数据均以均数±标准误（$\stackrel{-}{x}\pm s_{\stackrel{-}{x}}$）表示。采用SPSS 19.0软件对所得数据进行方差分析和Bonfferoni法两两比较，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠S100A8启动子荧光素酶报告质粒的构建与鉴定

PCR扩增大鼠S100A8全长启动子（-2 068~+174nt）后，经双酶切插入pGL3⁃basic质粒中，将重组质粒转化后均匀涂布于含Amp抗性的固体LB平板琼脂表面，经菌液PCR筛选出阳性克隆菌落，再送公司测序验证，测序结果显示质粒构建成功，命名为pGL3⁃S100A8⁃FL（图1）。

2.2 过表达SOX7 对大鼠S100A8 启动子全长活性的影响

将pIRES2⁃EGFP、pIRES2⁃SOX7、pRL ⁃SV40和pGL3⁃S100A8⁃FL不同分组共转染HEK⁃293T细胞，转染后48h检查GFP表达情况，发现GFP显著表达，其转染效率约为80%（图2）。随后裂解细胞并进行荧光素酶报告基因检测，结果显示，pGL3 ⁃ S100A8⁃FL、pIRES2⁃SOX7与pRL⁃SV40共转染组其RLU值显著高于pGL3⁃S100A8⁃FL、pIRES2⁃EGFP与pRL⁃SV40共转染组，提示SOX7过表达能够明显上调S100A8基因的启动子活性。

2.3 SOX7 过表达对大鼠S100A8 基因启动子活性的影响

2.3.1 大鼠S100A8基因启动子各截短质粒位置的确定

应用生物信息学软件JASPAR对S100A8基因启动子全长序列中SOX7的结合元件进行预测（表1）。参考其各结合元件的位置，设计相应的截短质粒（表2）。

2.3.2 大鼠S100A8基因启动子各截短质粒的构建与鉴定

基于pGL3⁃S100A8⁃FL质粒，由通用生物系统 （安徽）有限公司构建上述4个截短质粒，即pGL3⁃ S100A8⁃1、pGL3⁃S100A8⁃2、pGL3⁃S100A8⁃3和pGL3⁃ S100A8⁃4，测序结果显示pGL3⁃S100A8⁃1~4截短质粒构建正确。

2.3.3 SOX7过表达对大鼠S100A8基因启动子各截短质粒活性的影响

将pGL3 ⁃ basic、pGL3 ⁃ S100A8 ⁃ FL和pGL3 ⁃ S100A8各截短质粒分别与pIRES2⁃ SOX7和pRL ⁃ SV40共转染HEK⁃293T细胞，转染后48h裂解细胞并测定其荧光素酶活性，转染pGL3⁃S100A8⁃4细胞的RLU值较pGL3⁃S100A8⁃FL和pGL3⁃S100A8⁃1~3转染组相比显著降低（图3）。提示S100A8基因启动子区的SOX7结合元件可能位于-200~+51nt区域。

2.3.4 SOX7过表达对大鼠S100A8基因启动子突变质粒活性的影响

为了进一步确定SOX7在S100A8启动子-200~+51nt区内的结合元件，根据JASPAR结合元件预测结果，又开展了启动子突变实验，构建了S100A8启动子-86~-57nt区突变的荧光素酶报告质粒，即将5′ ⁃ GAAATGCTCAATGTGCTCAGTGATTGCCAC ⁃ 3′突变为5′ ⁃ GGGCGCGCGCGCTATAGGGCGCGCGC⁃ GCCC⁃3′，并将其命名为pGL3⁃S100A8⁃FL⁃M。将pGL3⁃basic、pGL3⁃S100A8⁃FL和pGL3⁃S100A8⁃M分别与pIRES2⁃SOX7质粒共转染HEK⁃293T细胞，于转染48h裂解细胞并检测各组荧光素酶活性。结果显示，S100A8基因全长启动子-86~-57nt突变后其荧光素酶活性显著降低，初步确定转录因子SOX7可通过与-86~-57nt区结合并上调S100A8的启动子活性 （图4）。

3 讨论

本课题组前期研究证实，大鼠Thy⁃1N发病过程中炎症介质S100A8和转录因子SOX7的表达均显著上调，且体外用sublytic C5b⁃9刺激大鼠GMC后亦可明显增强S100A8和SOX7的表达。此外，在大鼠GMC中过表达SOX7可显著上调S100A8的表达，另生物信息学软件预测提示，S100A8基因启动子区包含多个SOX7结合元件。因此推测，sublytic C5b⁃9刺激大鼠GMC后可通过上调SOX7促进S100A8基因的转录和表达，进而加重Thy⁃1N的炎性病变。

为了研究大鼠SOX7对S100A8基因启动的影响，本实验构建了大鼠S100A8基因启动子全长荧光素酶报告质粒（pGL3⁃S100A8⁃FL），将pGL3⁃S100A8⁃ FL质粒与我们前期构建的pIRES2⁃SOX7质粒行不同分组共转染HEK⁃293T细胞，转染48h裂解细胞并测定其荧光素酶活性。结果发现，pGL3⁃S100A8⁃FL和pIRES2⁃SOX7共转染组其荧光素酶活性显著高于其他组，提示过表达大鼠SOX7能够增强HEK⁃293T细胞中大鼠S100A8基因的启动子活性，这一发现与本课题前期GMC细胞实验的结果一致，即转录因子SOX7能够促进大鼠GMC中S100A8基因的表达。

为了进一步确定大鼠SOX7与S100A8基因启动子的结合部位，通过JASPAR软件预测发现大鼠S100A8基因启动子区可能存在5个SOX7结合元件，并据此构建了4个大鼠S100A8基因启动子截短荧光素酶报告质粒，即pGL3⁃S100A8⁃1~4。之后将pGL3 ⁃ S100A8 ⁃ FL或pGL3 ⁃ S100A8 ⁃ 1~4分别与pIRES2⁃SOX7和pRL⁃SV40共转染HEK⁃293T细胞，于48h裂解细胞检测各组RLU值，结果表明，pGL3⁃ S100A8⁃4荧光素酶活性显著低于pGL3⁃S100A8⁃FL和pGL3⁃S100A8⁃1~3，提示SOX7与S100A8基因启动子的结合元件可能位于启动子-200~+51nt之间。而根据JASPAR软件预测结果，-200~+51nt区域含有1个SOX7结合元件（-86~-57nt，5′⁃GAAATGCT⁃ CAATGTGCTCAGTGATTGCCA C⁃3′），随后，将该结合元件进行序列突变，构建S100A8启动子全长突变质粒即pGL3⁃S100A8⁃M，并将pGL3⁃S100A8⁃FL和pGL3⁃S100A8⁃M分别与pIRES2⁃SOX7和pRL⁃SV40共转染HEK⁃293T细胞，于48h裂解细胞检测各组荧光素酶活性。结果发现与pGL3⁃S100A8⁃FL相比， pGL3⁃S100A8⁃M组荧光素酶活性显著降低，提示S100A8基因启动子-86~-57nt区可能是SOX7结合元件。不过有关SOX7能否与该启动子区直接结合，仍需要通过染色质免疫沉淀（chromatin immuno⁃ precipitation，ChIP）实验进一步确证。

综上所述，本实验成功构建了大鼠S100A8基因启动子全长荧光素酶报告质粒，并在HEK⁃293T细胞中证实过表达SOX7可增强S100A8基因的启动子活性。此外，用生物信息学软件预测SOX7结合元件的分布，据此设计并构建了4个S100A8基因启动子截短荧光素酶报告质粒，在HEK⁃293T细胞中过表达SOX7探讨其对S100A8基因启动子不同截短活性的影响，初步筛选出大鼠S100A8基因启动子区可能的SOX7结合元件（-86~-57nt）。接着对上述结合元件序列进行突变，并在HEK⁃293T细胞中检查过表达SOX7对S100A8基因启动子突变质粒启动的影响，进一步确证了上述SOX7结合元件的有效性。本研究结果为今后进一步探究sublytic C5b⁃9刺激大鼠GMC后通过上调SOX7促进S100A8基因的转录及其机制提供了必要的启动子质粒和有用的实验数据。

参考文献