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人源抗c⁃Met抗体与rAGAP偶联物对卵巢癌细胞生物学特性的影响

  • 冯恬1

    机 构：

    1. 南京医科大学附属妇产医院妇科,江苏 南京 210004

    ×
  • ，龚丹丹1

    机 构：

    1. 南京医科大学附属妇产医院妇科,江苏 南京 210004

    ×
  • ，王露瑶1

    机 构：

    1. 南京医科大学附属妇产医院妇科,江苏 南京 210004

    ×
  • ，王怡雯2

    机 构：

    2. 东部战区疾病预防控制中心,江苏 南京 210002

    ×
  • ，周婷婷2

    机 构：

    2. 东部战区疾病预防控制中心,江苏 南京 210002

    ×
  • ，朱进2

    机 构：

    2. 东部战区疾病预防控制中心,江苏 南京 210002

    ×
  • ，张慧林1

    机 构：

    1. 南京医科大学附属妇产医院妇科,江苏 南京 210004

    ×
  • ，童华1

    机 构：

    1. 南京医科大学附属妇产医院妇科,江苏 南京 210004

    ×

1. 南京医科大学附属妇产医院妇科,江苏 南京 210004；
2. 东部战区疾病预防控制中心,江苏 南京 210002；

Effects of human anti⁃c⁃Met antibody conjugated with rAGAP on the biological properties of ovarian cancer cells

  • FENG Tian1

    Affiliation：

    1. Department of Gynaecology,the Affiliated Obstetrics and Gynaecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210004

    ×
  • ，GONG Dandan1

    Affiliation：

    1. Department of Gynaecology,the Affiliated Obstetrics and Gynaecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210004

    ×
  • ，WANG Luyao1

    Affiliation：

    1. Department of Gynaecology,the Affiliated Obstetrics and Gynaecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210004

    ×
  • ，WANG Yiwen2

    Affiliation：

    2. Center of Eastern Theater for Disease Control and Prevention,Nanjing 210002 ,China

    ×
  • ，ZHOU Tingting2

    Affiliation：

    2. Center of Eastern Theater for Disease Control and Prevention,Nanjing 210002 ,China

    ×
  • ，ZHU Jin2

    Affiliation：

    2. Center of Eastern Theater for Disease Control and Prevention,Nanjing 210002 ,China

    ×
  • ，ZHANG Huilin1

    Affiliation：

    1. Department of Gynaecology,the Affiliated Obstetrics and Gynaecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210004

    ×
  • ，TONG Hua1

    Affiliation：

    1. Department of Gynaecology,the Affiliated Obstetrics and Gynaecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210004

    ×

1. Department of Gynaecology,the Affiliated Obstetrics and Gynaecology Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210004；
2. Center of Eastern Theater for Disease Control and Prevention,Nanjing 210002 ,China；

通讯作者:

张慧林,E⁃mail:zhl068@163.com;

童华,thua8@163.com

中图分类号:R737.31

文献标识码:A

文章编号:1007-4368(2021)06-817-09

DOI:10.7655/NYDXBNS20210605

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目录contents

    摘要

    目的：制备人源抗c⁃Met的全分子抗体（c⁃Met⁃IgG1）及其与重组东亚钳蝎镇痛抗肿瘤多肽（recombinant analgesic⁃an⁃ titumor peptide，rAGAP）偶联的新型抗体（c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP），分析它们的生物学特性，检测其对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法：以本实验室保存的人源抗c⁃Met抗体基因为模板，构建c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP真核表达载体并转染真核细胞，表达并纯化抗体偶联物。通过亲和力检测、免疫荧光、流式细胞术等方法，评估c⁃Met⁃ IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的生物学特性。通过 CCK⁃8、划痕实验、Transwell侵袭实验检测抗体对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：成功制备出能够与c⁃Met蛋白特异性结合的c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP两种抗体；一系列实验证明了c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP均可抑制c⁃Met阳性的卵巢癌细胞HO8910的增殖、迁移、侵袭，且c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细胞的抑制作用要强于c⁃Met⁃IgG1，而在c⁃Met阴性的IOSE386细胞中并未观察到这些作用。结论：研究结果表明c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP可靶向作用于c⁃Met阳性的卵巢癌细胞并具有抗肿瘤活性，可为探索卵巢癌的分子靶向治疗奠定研究基础。

    Abstract

    Objective：This study aims to prepare a human anti ⁃ c ⁃ Met full ⁃ molecule antibody（c ⁃ Met ⁃ IgG1）conjugated with recombinant analgesic⁃antitumor peptide（rAGAP）to analyze their biological characteristics and detect their effects on the biological behavior of ovarian cancer cells. Methods：Using the human anti⁃c⁃Met antibody gene stored in our laboratory as a template，construct the c ⁃Met ⁃ IgG1⁃ rAGAP eukaryotic expression vector was constructed and transfected it into eukaryotic cells to obtain the antibody conjugate. The immunological properties of c⁃Met⁃IgG1 and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP were evaluated by methods such as affinity detection， immunofluorescence，and flow cytometry. CCK⁃8，scratch test，and Transwell invasion test were used to detect the effects of antibodies on the proliferation，migration and invasion of ovarian cancer cells. Results：Two antibodies，c ⁃Met ⁃ IgG1 and c ⁃Met ⁃ IgG1⁃ rAGAP， which can specifically bind to c⁃Met protein，were successfully prepared；c⁃Met⁃IgG1 and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP proved in a series of experiments can inhibit the proliferation，migration and invasion of the c⁃Met⁃positive ovarian cancer cell HO8910，and the inhibitory effect of c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP on ovarian cancer cells is higher than that of c⁃Met⁃IgG1，while these effects were not observed in the c⁃ Met⁃negative IOSE386 cells. Conclusion：The research results show that c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP can target c⁃Met⁃positive ovarian cancer cells and has anti⁃tumor activity，which can lay a research foundation for exploring molecular targeted treatment of ovarian cancer.

  • 卵巢癌作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因[1]。尽管减瘤手术、铂类为主的化学疗法、免疫疗法等多种治疗方法取得了一定进步，但早期诊断困难、化疗耐药、复发率高、预后不良等一系列问题仍然困扰着相关医疗工作者[2]。因此，人们急需研究出一种能够有效改善卵巢癌患者治疗效果特别是减少化疗耐药发生的治疗方法[3]。抗体药物偶联物（antibody drug conjugate， ADC）是将毒素或药物与单克隆抗体偶联的一种靶向疗法，它可以作为一种新型的靶向疗法应用于卵巢癌的治疗，将细胞毒性药物传递至癌细胞，降低对正常组织细胞毒性的同时，增强疏水化合物的溶解度和延长血浆半衰期，以发挥抗肿瘤的活性[4-5]。

  • 作为ADC的关键成分之一的单克隆抗体，需要高度选择性地作用于靶细胞上的抗原，研究表明c⁃Met在60％的卵巢癌患者肿瘤中呈过表达，与卵巢癌发生以及预后相关[6]。c⁃Met是由MET原癌基因编码，通过二硫键连接的由高度糖基化的50kDa α亚基和跨膜145kDa β亚基组成的异二聚体[7]。 c⁃Met与配体肝细胞生长因子（hepatocyte growth fac⁃ tor，HGF）结合后被激活，通过触发下游磷酸肌醇3⁃ 激酶（PI3K）/Akt通路诱导肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[8-9]。因此，可以通过靶向c⁃Met阻断HGF和c⁃Met间的相互作用达到有效治疗卵巢癌的目的[10]。另外，蝎毒对某些肿瘤具有显著的防治作用，其有效组分在癌症治疗方面已取得了显著效果[11]。东亚钳蝎镇痛抗肿瘤多肽（analgesic⁃antitumor peptide， AGAP）是从蝎毒多肽中分离出来的一种毒素，不仅具有镇痛作用，还能对胆管细胞癌[12]、肝癌[13]、脑胶质瘤[14]、乳腺癌[15] 等多种恶性肿瘤起到抑制作用。因此从东亚钳蝎蝎毒中提取纯化出的重组镇痛抗肿瘤多肽（recombinant analgesic ⁃antitumor peptide， rAGAP）有望成为构建ADC的小分子细胞毒素[16]。

  • 本研究制备人源抗c⁃Met的全分子抗体（c⁃Met⁃ IgG1）及其与rAGAP偶联的新型抗体（c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP），分析它们的生物学特性，检测其对卵巢癌细胞生物学行为的影响。

  • 1 材料和方法

  • 1.1 材料

  • CHO⁃S细胞、人卵巢癌细胞系HO8910、人正常卵巢上皮细胞IOSE386、pMH3质粒、抗c⁃Met抗体的载体及人源抗炭疽保护性抗原PA抗体（PA⁃IgG）均由本实验室提供和保存。CHO悬浮培养基（上海迈邦公司），DMEM及DMEM/F12培养基（Gibco公司，美国），限制性内切酶 EcoRⅠ、NoTⅠ（Invitrogen公司，美国），T4连接酶（Takara公司，日本），电转杯 （Bio⁃rad公司，美国），0.22微米滤膜（Millipore公司，美国），Protein A亲和纯化柱（GE公司，美国），重组人c⁃Met蛋白（R＆D公司，美国），HRP标记抗人Fab和FITC标记抗人Fc的特异性抗体（Sigma公司，美国），CCK8试剂盒（Dojindo公司，日本），Transwell小室（Corning公司，美国），DAPI、结晶紫染液（上海碧云天公司），G418硫酸盐、DH5α（上海生工公司）。

  • 1.2 方法

  • 1.2.1 c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP真核表达载体的构建

  • 为制备c ⁃Met ⁃ IgG1⁃ rAGAP真核表达载体，首先，以pUC57⁃c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP载体为模板，PCR扩增获得与rAGAP基因相偶联的轻链（c⁃Met⁃IgG1⁃ L⁃rAGAP）编码序列，NoTⅠ和EcoRⅠ双酶切后与同样双酶切的pMH3载体相连，转化DH5α，通过 NoT Ⅰ和EcoRⅠ双酶切和测序鉴定阳性克隆，从而成功构建pMH3⁃c⁃Met⁃IgG1⁃L⁃rAGAP真核表达载体。

  • 1.2.2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的表达和鉴定

  • 通过电转染将重链和轻链真核表达载体共转进CHO⁃S细胞，以含G418硫酸盐的DMEM/F12培养基进行筛选，通过Dot blot和亚克隆筛选高效表达抗体的细胞株，将培养定株的细胞重悬，收集细胞上清液，用0.22 μm滤膜过滤收集细胞上清液，AK⁃ TA蛋白纯化系统和Protein A亲和层析柱纯化；用SDS⁃PAGE检测c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的目的蛋白。

  • 1.2.3 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP生物学特性分析

  • 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）：培养HO8910、 IOSE386至对数生长期，利用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，测量调整RNA浓度，然后应用PCR扩增仪将RNA逆转录成cDNA，10 μL cDNA稀释4倍，将其作为qRT⁃PCR模板。qRT⁃PCR反应体系为20 μL，反应条件为94℃ 5s；60℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s， 40次循环；每个样品均设3个复孔，记录Ct值。c⁃Met的mRNA相对表达量根据2-△ △ Ct 方法分析计算， GAPDH用作内部参考。

  • Western blot：培养HO8910、IOSE386细胞至对数生长期，接种到6孔板，在细胞培养箱中培养过夜，裂解细胞提取总蛋白，加入蛋白上样缓冲液后， 100℃煮15min，上样进行蛋白电泳，转NC膜后5％ 脱脂奶粉溶液封闭1h，抗c⁃Met抗体4℃孵育过夜，PBST洗涤后加入HRP标记的二抗室温孵育1h，曝光仪曝光。

  • 亲和力检测：将重组人c⁃Met抗原用缓冲液Kinetic buffer稀释至5 μg/mL后在传感器上固化，再将抗体c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP分别用缓冲液Kinetic buffer进行梯度稀释，各浓度的两种抗体分别与已固化c⁃Met抗原的传感器进行结合反应，结合反应时间为240s。待结合反应完成后，将传感器转入Kinetic buffer缓冲液进行解离，解离时间为900s。最后将实验数据导入软件（DATA Analysis HT12.0）进行分析。

  • 免疫荧光：将HO8910和IOSE386细胞培养在6孔板中，细胞汇合度为80%时，用4％多聚甲醛4℃ 固定20min，5%脱脂奶粉溶液封闭1h后分别用两种抗体孵育2h，再用羊抗人IgG1⁃FITC抗体避光孵育1h，DAPI染液染核20min后用LSM 800激光共聚焦显微镜观察拍照。

  • 流式细胞术：将HO8910和IOSE386细胞，消化重悬计数，每管计数细胞5×105 个，将每种细胞分为4组，分别为PBS组、FITC组、c⁃Met⁃IgG1组及c⁃Met⁃ IgG1⁃rAGAP组。5%脱脂奶粉溶液37℃温箱封闭1h后，依次加入PBS、PBS、c⁃Met⁃IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP后37℃温箱孵育1h，之后向PBS组加入PBS，其余组都加入FITC标记Fc特异性的羊抗人IgG1，室温避光孵育1h后洗涤，150 μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

  • 1.2.4 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细胞生物学特性的影响

  • CCK⁃8实验：将HO8910细胞及IOSE386细胞消化重悬后按每孔8×103 个细胞数铺96孔板，c⁃Met⁃ IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP和PA⁃IgG分别设置5个浓度梯度：0、25、50、100、200 μg/mL，每个浓度设置3个复孔。37℃ 5%CO2孵箱中培养48h。实验结束时弃去原培养基，向每孔加入100 μL DEME培养基和10 μL CCK8，37℃孵育2h，酶标仪检测450nm处的吸光度值。

  • 划痕实验：将HO8910细胞和IOSE386细胞分别接种到24孔板培养至细胞汇合度为80%，用200 μL移液管径直划出1条直线，PBS洗涤后分别用200 μg/mL c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP处理，并于0h、24h、48h在显微镜下拍照、测量。

  • Transwell侵袭实验：将HO8910和IOSE386细胞培养至对数生长期，每种细胞PBS组、c ⁃Met ⁃ IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP。向小室中加入200 μL细胞悬液，并于下室中加入600 μL含15％FBS的培养基，37℃ 5%CO2孵箱中培养48h。用4％多聚甲醛固定下室30min，结晶紫染色20min后，用棉签擦去上室中未穿过的细胞，在显微镜下观察、拍片和计数分析。

  • 1.3 统计学方法

  • 应用Stata12.0和Graphpad 5.0对数据进行统计学分析，实验数据用均数±标准差（x- ± s）表示，两组样本均数间比较采用配对 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

  • 2 结果

  • 2.1 重组c⁃Met⁃IgG1 和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP真核表达载体的构建

  • 凝胶电泳鉴定结果显示：c⁃Met⁃IgG1⁃H、c⁃Met⁃ IgG1⁃L、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP⁃L基因的大小分别为1 500bp、750bp、900bp，与预期结果相符。将目的条带分别与线性化的pMH3质粒相连接完成真核表达载体的构建（图1）。将重组后的真核表达载体质粒分别转入DH5α，通过NoTⅠ和EcoRⅠ双酶切筛选出阳性克隆送公司测序，证实与设计序列完全相同。

  • 2.2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的表达与纯化

  • 将c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的重组质粒分别电转染CHO⁃ S细胞，用含G418硫酸盐的DMEM/F12培养基筛选获得阳性细胞，经Dot blot及亚克隆筛选出能够高效表达抗体的单克隆细胞株 （图2A）。将定株的细胞悬浮培养以收集细胞上清，用Protein A柱纯化，获得c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP两种抗体。将上清液、流穿液及纯化所得的抗体进行SDS⁃PAGE凝胶电泳，结果显示纯化后的抗体条带大小与预期相符且无明显杂带（图2B）。

  • 图1 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP真核表达载体的构建与鉴定

  • Fig.1 Construction and identification of recombinant c⁃Met⁃IgG1and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP eukaryot⁃ ic expression vectors

  • 2.3 c⁃Met⁃IgG1 和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP生物学特性分析

  • 2.3.1 c⁃Met⁃IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的亲和力测定

  • 重组人c⁃Met抗原用缓冲液Kinetic buffer稀释后在传感器上固化，将c ⁃Met ⁃ IgG1、c ⁃Met ⁃ IgG1⁃ rAGAP抗体梯度稀释后与其反应，结果显示，c⁃Met⁃ IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与重组人c⁃Met抗原结合的亲和力分别为5.607×10-8 mol/L（图3A）和8.389× 10-8 mol/L（图3B）。

  • 2.3.2 qRT⁃PCR检测卵巢癌细胞c⁃Met mRNA的表达

  • 根据RNA提取试剂盒说明书提取HO8910、IOSE386细胞总RNA后分别逆转录成cDNA，用qRT⁃ PCR方法检测细胞中c ⁃Met的mRNA表达水平。 qRT⁃PCR分析显示，HO8910细胞中的c⁃Met mRNA明显高于IOSE386细胞（图4）。

  • 图2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP的纯化与鉴定

  • Fig.2 Purification and identification of c ⁃ Met ⁃ IgG1and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP

  • 图3 c⁃Met⁃IgG1及c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与重组人c⁃Met抗原的亲和力检测

  • Fig.3 Affinity detection of c⁃Met⁃IgG1and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP with recombinant human c⁃Met antigen

  • 2.3.3 Western blot检测卵巢癌细胞c⁃Met蛋白的表达

  • c⁃MET阳性的HO8910细胞可检测到c⁃Met蛋白的前体（170kDa）和成熟体（140kDa），而未在IOSE386细胞中检测到c⁃Met蛋白（图5）。

  • 2.3.4 免疫荧光检测

  • 共聚焦显微镜下观察本研究制备的c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与细胞的结合特性及其在细胞中的定位。结果显示c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP可以与细胞膜上c⁃Met蛋白特异性结合 （图6）。

  • 图4 qRT⁃PCR检测卵巢癌细胞c⁃Met mRNA的表达

  • Fig.4 Detection of c⁃Met mRNA expression in ovarian cancer cells by qRT PCR

  • 2.3.5 流式细胞术检测c⁃Met⁃IgG1 和c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP与抗原的结合能力

  • 流式细胞术检测c ⁃Met ⁃ IgG1和c ⁃Met ⁃ IgG1⁃rAGAP对c⁃Met阳性细胞的特异性结合能力。结果显示，经过c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP分别处理后，HO8910细胞检测到的荧光强度大于IOSE386细胞，显示c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP可特异性结合到c⁃Met阳性的HO8910的细胞膜上，而不与几乎不表达c⁃Met蛋白的IOSE386细胞结合（图7）。

  • 图5 Western blot检测卵巢癌细胞c⁃Met的表达

  • Fig.5 Dectection of c⁃Met exprssion in ovarian cancer cells by Western Blot

  • 2.4 体外评估c⁃Met⁃IgG1 和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细胞恶性行为的影响

  • 2.4.1 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对细胞增殖能力的影响

  • CCK ⁃8结果显示，c ⁃Met ⁃ IgG1和c ⁃Met ⁃ IgG1⁃ rAGAP对卵巢癌细胞的增殖均有抑制作用，且在相同浓度下，c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP抑制HO8910细胞增殖的能力要高于c ⁃ Met ⁃ IgG1，而这两种抗体对IOSE386细胞增殖的影响差异无统计学意义。另外，阴性对照PA⁃IgG对IOSE386和HO8910这两种细胞增殖的影响差异均无统计学意义（图8）。

  • 图6 免疫荧光检测c⁃Met⁃IgG1及c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP与细胞的特异性结合（×100）

  • Fig.6 The specific binding of c⁃Met⁃ IgG1and c⁃MET⁃IgG1⁃rAGAP with cells surface by immuofluorescence microscopy （×100）

  • 2.4.2 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对细胞迁移的影响

  • 200 μg/mL的c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP分别处理细胞，结果显示（图9）：细胞划痕48h后， HO8910细胞组中，PBS组的划痕愈合率为63.69％， c⁃Met⁃IgG1组划痕愈合率为51.17％，c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP组细胞划痕愈合率为38.44％。表明两种抗体对HO8910细胞的迁移能力均有抑制作用，且c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对细胞迁移的抑制作用要高于c⁃Met⁃IgG1组（P< 0.05）。而在IOSE386细胞中，不同处理的细胞迁移率差异无统计学意义（P> 0.05）。

  • 2.4.3 c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对细胞侵袭能力的影响

  • Transwell侵袭实验结果显示，200 μg/mL的c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP分别处理48h后，HO8910细胞中经抗体处理的细胞侵袭数均低于PBS组（P< 0.05），且c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP抑制细胞穿膜的作用比c⁃Met⁃IgG1明显，差异有统计学意义 （P< 0.05）。而在IOSE386细胞中，不同处理组细胞侵袭数量差异无统计学意义（图10）。

  • 图7 流式细胞术检测c⁃Met⁃IgG1及c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP能特异性结合于卵巢癌细胞膜

  • Fig.7 Specific binding of c⁃Met⁃IgG1and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP to ovarian cancer cells detected by flow cytometry

  • 图8 CCK⁃8实验检测c⁃Met⁃IgG1、c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP和PA⁃IgG对卵巢癌细胞增殖的抑制作用

  • Fig.8 Effect of anti⁃tumor cytotoxicity of c⁃Met⁃IgG1，c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP and PA⁃IgG on proliferation of ovarian cancer cells detected by CCK⁃8test

  • 3 讨论

  • c⁃Met是异二聚体受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK）亚家族的成员，并且是HGF的受体[17]。HGF与其配体c⁃Met的结合可诱导多种复杂的信号通路，促进肿瘤细胞的恶性行为[18]。另外，在癌细胞耐药机制研究中还发现c⁃Met可与各种膜受体间发生交叉作用，而且与吉非替尼和厄洛替尼等多种酪氨酸激酶抑制剂的耐药发生有关[19]。此外，c⁃Met作为新的肿瘤治疗靶点已经应用于肝癌[20]、脑肿瘤[21]、鼻咽癌等多种恶性肿瘤的实验研究。本研究是在前期实验室制备的全分子人源化抗c⁃Met抗体的基础上，将抗体与抗肿瘤药物蝎毒素相偶联，研究其对卵巢癌细胞的恶性行为的抑制效果。本研究通过构建c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP真核表达载体，电转染CHO⁃S细胞后筛选出稳定表达两种抗体的细胞株，经AKTA蛋白纯化系统纯化得到抗体。细胞免疫荧光和流式细胞术证实两种抗体均可与c⁃Met阳性细胞系细胞膜上的c⁃ Met蛋白选择性结合。CCK⁃8实验显示c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细胞的增殖均有抑制效果，且融合了rAGAP的新型抗体对细胞增殖的抑制效果更明显。划痕实验和Transwell侵袭实验比较了两种抗体对卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的影响，研究结果表明在相同浓度下，c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP组的细胞愈合率更低，且小室中肿瘤细胞迁移数量更少，这些都表明了与c⁃Met⁃IgG1相比，偶联了细胞毒素rAGAP的新型抗体对卵巢癌细胞的恶性行为具有更明显的抑制作用。ADC作为一种新型的抗肿瘤靶向药物，将细胞毒性分子与肿瘤细胞靶向抗体结合在一起，从而将化疗药物选择性递送至肿瘤细胞，增加了细胞毒性药物的治疗范围且减少药物不良反应，目前已经是临床上肿瘤治疗研究的一个重要方向[20]，本研究中抗体融合蛋白c⁃Met⁃IgG1⁃ rAGAP既保留了c⁃Met⁃IgG1的靶向特性，又将蝎毒肽集中在肿瘤部位发挥细胞毒性作用，会减轻药物对其他正常组织的损伤。综上所述，未来该抗体可能会在c⁃Met阳性肿瘤的疾病诊断、靶向治疗中发挥重要价值。

  • 图9 划痕实验检测c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细胞迁移的抑制作用

  • Fig.9 c⁃Met⁃IgG1and c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP inhibited the migration of ovarian cancer cells detected by wound healing assay

  • 图10 Transwell侵袭实验检测c⁃Met⁃IgG1和c⁃Met⁃IgG1⁃rAGAP对卵巢癌细胞侵袭的抑制作用

  • Fig.10 The inhibition of the invasion of IgG1⁃AGAP and Met⁃IgG1to ovarian cancer cells by Transwell migration assay

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  • 基本信息

    中图分类号: R737.31
    文献标识码: A
    DOI: 10.7655/NYDXBNS20210605
    文章编号: 1007-4368(2021)06-817-09

    基金信息

    江苏省重点研发计划专项(BE2018613)；
    江苏省科教强卫工程青苗人才(QNRC2016104)；

    引用信息

    稿件历史

    收稿日期: 2021-01-07

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