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甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）是一种具有强烈神经毒性的苯丙胺类兴奋剂[1]。研究表明， METH的神经毒性与小胶质细胞的激活有关[2]。小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system， CNS）中最重要的免疫细胞，正常情况下，小胶质细胞处于静息状态，而受到有害刺激后，小胶质细胞被激活，释放出肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis fac⁃ tor⁃ α，TNF⁃α）、白介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）、白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）等炎症因子[3]。小胶质细胞发生持续的激活，可导致其周边神经组织的炎症损伤。Toll样受体（Toll like receptor，TLR）在小胶质细胞中广泛表达，该受体家族激活后作用于下游炎性信号分子，促使编码炎症的相关分子及细胞因子的基因转录[4-5]。然而，TLR是否参与METH引起的神经炎性反应尚不清楚。
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本研究通过建立原代小胶质细胞METH染毒模型，旨在探讨TLR及其下游炎性信号及因子介导的炎性反应，从而为METH的干预提供潜在靶点。
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1 材料和方法
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1.1 材料
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METH（中国食品药品检定研究院，纯度： 99.9%），PrimeScriptTM RT Reagent Kit反转录试剂盒 （TaKaRa公司，日本），小鼠IBA⁃1单克隆抗体（Pro⁃ teintech公司，美国），小鼠Phospho ⁃ NF ⁃ κB p65 （Ser536）单克隆抗体、兔NF⁃κB p65（D14E12）单克隆抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），HRP标记的羊抗兔IgG（H+L）及HRP标记的羊抗小鼠IgG（H+L）（Jackson Immuno公司，美国），磷酸酶抑制剂（Roche公司，瑞士），细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、小鼠β⁃actin单克隆抗体（Sigma公司，美国）， PVDF膜、ECL发光液（Millipore公司，美国）。
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1.2 方法
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1.2.1 原代小胶质细胞培养
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孕18d SD大鼠（购买于南京医科大学实验动物中心），麻醉后断头，无菌条件下取出腹中胎鼠，分离出两侧的大脑半球皮质，去除脑膜后置于HBSS液，胰酶消化后依次经100 μm和40 μm网筛过滤，将3×107 个细胞接种于含18mL DMEM培养液（内含10%胎牛血清、1%双抗、0.04mg/mL巨噬细胞集落刺激因子）的75cm2 培养瓶中，接种4d后半量更换培养液，以后每隔3d换1次培养液。本研究南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会批准（批准号：IACUC⁃1801008）。
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1.2.2 免疫荧光染色
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4%多聚甲醛固定原代小胶质细胞30min，1%的Triton X⁃100冰上透化5min，10%山羊血清37℃ 封闭30min，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃避光孵育2h，加入含防荧光淬灭液的DAPI复染，激光共聚焦显微镜下扫描。所有结果至少重复3次。
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1.2.3 蛋白免疫印迹实验
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用蛋白裂解液（内含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂）裂解原代小胶质细胞，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度。电泳（浓缩胶电泳40V，分离胶电泳90V），转膜（200V，1h），封闭（5%脱脂奶粉溶液，2h），一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2h，将PVDF膜与ECL发光液A液和B液（1∶1）混合，置于化学发光成像系统进行曝光。所有结果至少重复3次。
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1.2.4 Real⁃time PCR
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提取原代小胶质细胞的mRNA后，按照Prime⁃ ScriptTM RT Reagent Kit反转录试剂盒说明书，将mRNA逆转录成cDNA，设计引物（引物序列见表1），冰上配制反应体系，设置ABI7300荧光定量PCR仪反应程序（两步法）：96℃ 30s预变性，95℃ 5s， 60℃ 34s，40次循环。每个样品4个复孔，利用熔解曲线确定PCR产物是否单一，根据标准曲线得出扩增效率。以β⁃actin作内参，用2-ΔΔCT法对结果进行计算和分析。ΔΔCT=（CT1-CT2）-（CT3-CT4），CT1：处理样品待测基因的临界循环数，CT2：处理样品管家基因的临界循环数，CT3：对照样品待测基因的临界循环数，CT4：对照样品管家基因的临界循环数，所有结果至少重复3次。
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1.3 统计学方法
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利用SPSS20.0软件对实验结果进行统计学分析，各组数据用均数±标准差（ ± s）表示，多组定量资料比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）检验，多组间数据两两比较用Dunnett t检验，两组定量数据比较用Student’s t检验，用Graphpad Prism5软件进行作图。P< 0.05为差异具有统计学意义。
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2 结果
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2.1 小胶质细胞的鉴定与纯度分析
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小胶质细胞培养至第10~14天，在恒温水平摇床上37℃，260r/min摇晃2h，收集悬浮细胞，放入CO2恒温培养箱培养2~3d后，利用免疫荧光方法对原代培养细胞进行鉴定与纯度分析。如图1所示，红色荧光显示的是IBA⁃1阳性细胞，IBA⁃1是小胶质细胞的特异性激活标志蛋白，主要分布于细胞体。DAPI染核，显示蓝色荧光。Merge为两者的合并图。小胶质细胞的纯度=IBA⁃1阳性细胞/DAPI核染细胞×100%。随机计数10个视野下的IBA⁃1标记小胶质细胞数与DAPI标记总细胞数，结果显示，按照本实验室分离培养小胶质细胞的方法，小胶质细胞纯度达到95%以上，符合后续实验要求。
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2.2 METH对小胶质细胞的激活作用
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为探究METH对小胶质细胞的激活作用，用300 μmol/L的METH处理原代小胶质细胞15min、 30min、1h、3h、6h、12h和24h，观察原代小胶质特异性激活标志蛋白IBA⁃1的表达情况。如图2所示， IBA⁃1表达在METH处理30min后开始上升，并在1h达到高峰，差异有统计学意义（P< 0.05），提示METH明显激活原代小胶质细胞。
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图1 小胶质细胞的鉴定与纯度分析（×200）
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Fig.1 Microglial identification and purity analysis（×200）
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图2 METH对原代小胶质细胞的激活情况
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Fig.2 Activation of primary microglia induced by METH
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2.3 METH对小胶质细胞炎性因子表达的影响
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在300 μmol/L的METH分别处理原代小胶质细胞12h、24h后，使用real⁃time PCR检测炎性因子TNF⁃α、IL⁃1β和IL⁃6的mRNA表达。如图3所示， TNF⁃α、IL⁃1β和IL⁃6mRNA在METH孵育24h后表达均显著上升，差异具有统计学意义（P< 0.05，P< 0.001，P< 0.01）。
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2.4 METH对小胶质细胞TLR家族mRNA水平的影响
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文献报道，TLR家族参与小胶质细胞的炎性反应作用。用300 μmol/L的METH与原代小胶质细胞孵育24h，检测TLR 1~9、11的mRNA表达情况。结果显示，与对照组相比，METH处理后TLR1的mRNA在原代小胶质细胞表达下降，TLR2、4~5、7~9和11的mRNA表达均显著上升，差异具有统计学意义（图4），而TLR3和TLR6的mRNA水平无明显变化。
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2.5 METH对NF⁃κB通路激活的影响
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转录因子NF⁃κB是TLR信号的下游，参与调节炎性因子转录和表达[6]。300 μmol/L的METH处理原代小胶质细胞15min、30min、1h、3h、6h、12h和24h后，在15min时NF⁃κB的磷酸化水平开始升高，在30min时达到高峰，与对照组比较，差异具有统计学意义，随后下降，但仍高于对照组（图5）。
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3 讨论
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METH属于苯丙胺类物质，是一种新型毒品。因为制造工艺简单，价格低廉，METH的滥用日益严重，给全世界带来严重的公共卫生问题[1]。动物和人群实验都显示，METH滥用可导致严重的神经系统毒性[7-8]。METH的神经毒性作用机制十分复杂，主要包括兴奋性毒性、线粒体损伤、氧化应激、小胶质细胞炎症反应等[9]。目前，METH诱导的小胶质细胞炎性反应是METH神经毒性的研究热点。小胶质细胞是中枢神经系统的主要炎性细胞，在保护大脑的完整性和维持大脑平衡中发挥重要作用。正常情况下，小胶质细胞处于静止状态，但当受到损伤或感染时，小胶质细胞被激活。持续激活的小胶质细胞会释放各种促炎细胞因子，如TNF⁃α、IL⁃1β、 IL⁃6，导致神经元细胞死亡[10]。本实验结果显示，原代小胶质细胞暴露在METH 30min后，IBA⁃1蛋白的表达明显升高；处理24h后，炎性因子TNF⁃α、IL⁃ 1β、IL⁃6的mRNA水平明显升高，上述结果提示， METH暴露明显激活小胶质细胞，且促进小胶质细胞中炎性因子TNF ⁃α、IL ⁃1β、IL ⁃6mRNA的高表达。然而，目前METH诱导小胶质细胞炎症反应的机制并不完全明了。因而，本研究探讨METH激活小胶质细胞可能的上游信号通路。
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图3 METH对小胶质细胞炎症因子表达的改变
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Fig.3 Effects of METH on the expression of inflammatory factors in microglia
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图4 METH对原代小胶质细胞TLR1~9、11的mRNA水平的影响
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Fig.4 Effects of METH on mRNA expression of TLR 1⁃9and TLR11
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图5 METH对NF⁃κB通路激活的影响
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Fig.5 Effects of METH on NF⁃κB activation
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TLR是模式识别受体，在生物体中广泛存在。哺乳动物中至少存在13个TLR基因，TLR1~9在小鼠和人类中均表达，而TLR10~13仅在小鼠中表达[11]。研究表明，TLR在神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经干细胞中都有表达[12]。小胶质细胞表达多种TLR，该家族受体在小胶质细胞的免疫反应中发挥重要作用，是识别细菌或病毒感染的第一道防线，并促进各种炎症介质的产生。在静止的小胶质细胞中几乎无法检测到TLR的表达，但一旦小胶质细胞被激活，就会迅速表达多种TLR[11]。本实验中，通过real⁃time PCR检测METH激活的小胶质细胞内TLR家族成员mRNA的水平变化，我们发现TLR2~5、7~9、11的mRNA表达显著增加。提示小胶质细胞可能通过上调多种TLR来响应METH的刺激，TLR表达的增加随后通过信号转导来上调炎性因子mRNA的表达。NF⁃κB作为炎性反应中的关键转录因子，在小胶质细胞激活导致的神经炎性的发生过程中发挥重要作用。因而，本研究探讨了参与TLR诱导炎性因子表达的下游信号通路NF⁃κB的激活情况。在中枢神经系统中，NF⁃κB信号通路可参与多种神经退行性疾病进程。一些研究表明， NF⁃κB的激活是促炎性细胞因子表达调控的关键步骤，活化后的NF⁃κB转移到核内与其相关DNA基序结合以诱导炎性因子基因的转录[13-14]。这些结果支持了本研究中METH暴露激活原代小胶质细胞内NF⁃κB的结果，提示NF⁃κB参与了TLR诱导炎性因子的表达。
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本研究揭示了TLR/NF⁃κB信号通路参与METH诱导的原代小胶质细胞的激活及其炎性因子表达的过程，后续将进一步对TLR/NF⁃κB信号通路之间的信号传递蛋白进行深入研究，以期为METH神经毒性的干预提供潜在靶点。
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参考文献
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摘要
目的：探讨Toll样受体（Toll like receptor，TLR）/核因子（nuclear factor，NF）⁃κB信号通路在甲基苯丙胺（methamphet⁃ amine，METH）引起原代小胶质细胞激活及炎性因子释放的作用。方法：分离培养原代小胶质细胞，免疫荧光法鉴定原代小胶质细胞纯度。细胞予METH（300 μmol/L）染毒0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h，蛋白免疫印迹检测原代小胶质细胞的激活情况及其NF⁃κB通路激活情况，real⁃time PCR检测炎性因子［肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃ α，TNF⁃α）、白介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）、白介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）］和TLR1~9、11 mRNA的表达。结果：分离出的原代小胶质细胞纯度达到95%以上。METH暴露后原代小胶质细胞激活，其激活标志物IBA⁃1水平增高，NF⁃κB通路被激活，炎性因子（TNF⁃α、IL ⁃1β、IL⁃6）和TLR2、4~5、7~9、11的mRNA水平明显升高，TLR1的mRNA水平明显降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。结论：METH可通过调节TLR/NF⁃κB信号通路激活原代小胶质细胞并促进其释放炎性因子，因而TLR可作为METH神经炎性反应干预的潜在靶点，具有一定的治疗意义。
Abstract
Objective：To investigate the role of Toll⁃like receptor（TLR）/NF⁃κB signaling pathway in methamphetamine（METH）⁃ induced primary microglial activation and inflammatory reaction. Methods：Primary microglial cells were isolated and cultured，then the purity of primary microglia was detected by immunofluorescence. Cells were treated with METH（300 μmol/L）for 0 min，15 min， 30 min，1 h，3 h，6 h，12 h，and 24 h，and the activations of primary microglia and NF⁃κB pathway were detected by Western blot. The inflammatory factors（TNF⁃α，IL⁃1β，and IL⁃6）and TLR1⁃9，11 mRNA levels were detected by real⁃time PCR. Results：The purity of primary microglial cells was above 95%. After exposure to METH，the primary microglia activation marker IBA⁃1 was increased and the NF⁃κB pathway was activated. In addition，the mRNA levels of inflammatory factors（TNF⁃α，IL⁃1β，IL⁃6）and TLR2，4⁃5，7⁃9，11 were significantly increased（P < 0.05），while the level of TLR1 mRNA was significantly reduced. Conclusion：METH can activate primary microglial cells and promote the release of inflammatory factors by regulating the TLR/NF⁃κB signaling pathway. Therefore， TLR can be potential targets for METH neuritis response intervention with certain therapeutic significance.
Keywords
methamphetamine ； primary microglia ； TLR/NF⁃κB signaling pathway