-
miRNA是一类较短的单链RNA，参与许多靶基因的表达与调控，影响细胞生物学功能[1-2]。miRNA⁃ 199a作为高度保守microRNA，在正常皮肤和肿瘤细胞中表达丰富，影响细胞的增殖和迁移[3-4]。目前对miRNA⁃199a⁃5p的研究主要集中在癌细胞[5-6]，本研究构建人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts HSF）热损伤模型[7]，通过逆转录实时定量PCR对miRNA⁃199a⁃5p的表达量进行检测，分析热损伤对HSF增殖和迁移功能的影响；用miRNA⁃199a⁃5p模拟物转染热损伤细胞，观察其对热损伤细胞的增殖和迁移能力[8]，旨在为由热损伤引起的皮肤功能恢复提供研究依据。
-
1 材料和方法
-
1.1 材料
-
正常HSF购自无锡博慧斯生物医药科技有限公司。低糖细胞培养液（Dulbecco’s modified Eagle’ s medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine Serum， FBS）购自美国Gibco公司；RNA提取试剂（TRIzol）、 LipofectamineTM 2000转染试剂、RT⁃PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；microRNA mimics（5′ ⁃ CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGU ⁃ CUGAACACUGGGGUU ⁃ 3′）、阴性对照mimics（5′ ⁃ CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCACAGGUAGUC ⁃ UGAACACUGGGUU ⁃3′）购自苏州吉玛生物科技有限公司；U6RT引物（5′ ⁃CGAGCACAGAATCGCTT ⁃ CACGAATTTGCGTGTCAT⁃3′）、miR⁃199a⁃5p RT引物（5′⁃GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC⁃ GCACTGGATACGACGAACAG⁃3′）、U6扩增引物（正向引物：5′⁃ CGAGCACAGAATCGCTTCA ⁃3′；反向引物：5′⁃ CTCGCTTCGGCAGCACATAT⁃3′）、miR⁃199a⁃ 5p扩增引物（正向引物：5′⁃GTGCAGGGTCCGAGG⁃ TATT⁃3′；反向引物：5′⁃CTAACCCAGTGTTCAGAC⁃ TAC⁃3′）由苏州金唯智公司合成；四甲基偶氮唑盐 （MTT）试剂盒购自上海碧云天生物公司；Transwell小室（康宁公司，美国）；Matrigel（B&D公司，美国）； 转染试剂Lipo2000（Invitrogen公司，美国）。
-
1.2 方法
-
1.2.1 细胞培养
-
复苏后的HSF常规培养，FBS浓度为10%，胰蛋白酶消化传代。
-
1.2.2 HSF热损伤处理及热损伤模型的制作
-
细胞生长至80%~90％，胰蛋白酶消化，分成3个培养皿进行培养：对照组和实验组的培养皿均用封口膜封好，两个热损伤组在同一温度（52℃）水浴中热损伤不同时间（30s和60s），对照组细胞悬液培养皿在37℃水浴中水平面下浸泡30s。细胞均保持在水平面以下。分别在0h和24h进行拍照，并结合瑞⁃姬氏染色法观察热损伤对HSF形态的影响。HSF热损伤模型的制作参照文献[7]：将封口膜密封的培养皿放入52℃水浴箱中水平面下浸泡30s。
-
1.2.3 MTT实验
-
将经过热损伤处理的HSF（52℃ 30s）计数，调节细胞数量至25 000个/mL，每孔200 μL，加入到96孔培养板中。一组培养24h，另一组培养48h。培养结束时，每孔分别加入MTT20 μL，2h后加入DMSO溶解，570nm处测吸光度值。
-
1.2.4 实时定量PCR
-
将经过热损伤处理的HSF（52℃ 30s）分为两组，一组培养24h，另一组培养48h。收集培养皿中的细胞，用TRIzol试剂提取细胞miRNA。配制逆转录及PCR扩增体系。逆转录条件为：50℃逆转录30min，94℃失活2min。PCR条件为：94℃变性15s，60℃退火30s，68℃延伸30s，共40个循环后72℃继续延伸10min。通过2-△△Ct法检测miR⁃199a⁃ 5p的相对含量。
-
1.2.5 细胞迁移实验
-
将经过热损伤处理的HSF（52℃ 30s）调节细胞密度，以过夜铺满为准，接种于6孔板。用100 μL的枪头在每孔中线轻轻划过，PBS清洗。用FBS浓度为4%的DMEM培养基补充培养液至3mL/孔。培养24h后观察细胞的迁移。
-
1.2.6 细胞侵袭实验
-
在Transwell小室膜的上室面加入稀释后基质胶（基质胶与无血清培养稀释比例为1∶7），每孔100 μL，30min后吸掉基质胶。将HSF用DMEM制成无血清悬液，在上室层各加入250 μL，细胞数为1.5×104 个/孔。下室加入10%FBS的DMEM，常规培养24h。擦净上室面细胞，用4%的多聚甲醛固定下室面剩余细胞，Giemsa染色，统计细胞个数，以每个小室的平均细胞数为最终计数。
-
1.2.7 细胞转染实验
-
HSF稳定传代2~3代，待细胞长满70%时，消化接种至6孔板中继续培养。细胞正常生长后制作热损伤模型（52℃ 30s）。模拟物组，用100pmol miR⁃ NA⁃199a⁃5p模拟物加5 μL转染试剂混合转染细胞； 对照组，用100pmol的阴性对照模拟物加5 μL转染试剂Lipo2000混合转染细胞。添加DMEM培养液至1mL/孔。 4h后更换培养液，用10%FBS的DMEM继续培养。
-
1.3 统计学方法
-
数据分析采用SPSS 13.0统计软件，定量资料以均数±标准差（ ± s）表示，采用t检验或方差分析进行组间比较，P< 0.05为差异有统计学意义。
-
2 结果
-
2.1 热损伤对正常HSF形态的影响
-
正常HSF呈梭形或三角形，个体饱满，细胞膜光滑透亮。热损伤后HSF变圆钝，体积增大，表面有较多突起，胞浆中有大量的异常疏松透亮区，核浆比例变小（图1）。
-
2.2 热损伤对HSF增殖的影响
-
热损伤24h和48h后，HSF增殖明显受到了抑制。相对于正常细胞增殖，热损伤24h后细胞平均抑制率为（17.10±3.21）%（P ＜0.002，n=3）、热损伤48h后细胞平均抑制率为（25.93 ± 1.74）%（P ＜0.00 1，n=3，图2）。
-
图1 热损伤对HSF形态的影响（Giemsa染色，×200）
-
Fig.1 Effects of thermal injury on HSF morphology（Giemsa staining，×200）
-
2.3 热损伤对HSF miR⁃199a⁃5p表达的影响
-
荧光实时定量PCR结果见表1。热损伤后HSF miRNA⁃199a⁃5p的表达明显得到了抑制（图3），24h HSF miRNA⁃199a⁃5p表达率为（2.67±0.35）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.001），48h表达率为（18.42±0.44）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P ＜0.001）。
-
2.4 热损伤对HSF迁移的影响
-
热损伤后，HSF细胞迁移速率明显降低。显微镜下进行细胞计数（n=4），对照组计数结果为（24.75±2.06）个，热损伤组计数结果为（8.75±2.06） 个，热损伤对细胞迁移的抑制率为（35.35 ± 7.07）%，与对照组比较迁移功能下降（P ＜0.001，图4）。
-
图2 热损伤对HSF增殖的影响
-
Fig.2 Effects of thermal injury on proliferation of HSF
-
图3 热损伤对HSF miRNA⁃199a⁃5p表达的影响
-
Fig.3 Effects of thermal injury on miRNA ⁃ 199a ⁃5p expression in HSF
-
2.5 热损伤对HSF侵袭的影响
-
热损伤后，HSF侵袭速率明显降低。显微镜下进行细胞计数（n=4），对照组细胞数量为（21.00± 5.56）个，热损伤组细胞数量为（12.00±2.58）个，热损伤对细胞侵袭的抑制率为（57.14±9.52）%，与对照组比较侵袭功能亦下降（P ＜0.007，图5）。
-
图4 热损伤对HSF迁移的影响
-
Fig.4 Effects of thermal injury on HSF migration
-
图5 热损伤对HSF侵袭的影响
-
Fig.5 Effect of thermal injury on HSF invasion
-
2.6 miRNA⁃199a⁃5p模拟物对热损伤后HSF增殖的影响
-
加入阴性模拟物组的细胞增殖率为（104.52± 5.46）%，加入miR⁃199a⁃5p模拟物组的细胞增殖率为（136.55±6.14）%，后者的热损伤细胞增殖明显升高（P ＜0.003，n=3，图6）。
-
2.7 miRNA⁃199a⁃5p模拟物对热损伤后HSF侵袭的影响
-
显微镜下对侵袭的细胞进行计数（n=4），加入阴性对照模拟物组细胞数量为（9.00±2.16）个，细胞侵袭率为（112.50±18.75）%；加入miR⁃199a⁃5p模拟物组细胞数量为（15.75±1.71）个，细胞侵袭率为 （196.88±15.63）%，后者的热损伤细胞侵袭率明显升高（P ＜0.003，图7）。
-
图6 miRNA⁃199a⁃5p模拟物对热损伤后HSF增殖的影响
-
Fig.6 Effects of miRNA⁃199a⁃5p mimics on prolifera⁃ tion of HSF after thermal injury
-
3 讨论
-
在深度烧伤及热压伤中，真皮细胞的代谢、功能、形态等都发生了病理性改变。能够可逆修复创面、恢复功能的间生态真皮是影响手术修复及预后的重要因素[9]。临床治疗过程中，医生时常处于尽可能去除坏死组织和保留间生态组织两难的境地，通过研究影响变性真皮转归的重要因素及其机制，可以为临床治疗提供更多的理论依据。真皮中含有多种细胞，HSF是其中的重要细胞之一，它由胚胎时期的间充质干细胞分化而来。深度烧伤及热压伤后HSF增殖并迁移至创面，大量分泌胶原纤维及各种生长因子，还可以和新生毛细血管、各种炎症细胞形成肉芽组织促进创面的愈合，在创面修复过程中发挥着重要作用。
-
图7 miRNA⁃199a⁃5p模拟物对热损伤后HSF侵袭的影响
-
Fig.7 Effects of miRNA⁃199a⁃5p mimics on invasion of HSF after thermal injury
-
作为高度保守的micorRNA，miRNA⁃199a⁃5p广泛存在于皮肤、炎症反应、血管内皮细胞、癌细胞中，参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等活动与功能[4，6，10-12]。研究发现，过表达miRNA⁃199a⁃5p后， U2OS细胞的增殖能力显著降低（P< 0.05），同时cy⁃ clin D1、p Rb表达水平显著下降，而P27、LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin 1的表达水平显著增加（P< 0.05）[5]。miR⁃ 199a⁃5p通过调节EGF、SP1下调ERK5的表达并抑制其磷酸化，进而发挥对乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞侵袭的抑制作用[13]。
-
大鼠真皮热压伤实验显示，在不同时间点获取组织样本，检测样本中miRNA⁃199a⁃5p的相对表达量，结果显示miRNA⁃199a⁃5p相对表达量为先抑制后上调的趋势[14]。推测在大鼠皮肤组织受损初期，真皮层受到影响，变性真皮细胞在短时间内无法恢复正常功能，因此细胞内miRNA⁃199a⁃5p的表达量相对减少，表现为表达抑制。此结论可能也适用于人的皮肤组织。因此，本研究利用HSF，通过构建热损伤模型观察细胞的形态变化，检测细胞中miRNA⁃ 199a⁃5p表达量的变化，以及人为干扰miRNA⁃199a⁃ 5p表达量来观察热损伤对HSF的影响。
-
本研究观察到，热损伤模型中HSF形态发生了改变，miRNA⁃199a⁃5p表达量显著下调，并显著抑制HSF的增殖、迁移和侵袭能力。通过转染模拟物的方式提高热损伤人成纤维细胞中miRNA⁃199a⁃5p的量，可以显著提高热损伤细胞的增殖和侵袭能力，提示HSF热损伤后的细胞功能与miRNA⁃199a⁃5p的表达量密切相关。这与之前的动物实验结果相对应。而如何在皮肤热损伤后提高人皮肤成纤维细胞中miRNA⁃199a⁃5p的表达量，加快热损伤皮肤的恢复与治疗，成为下一步研究的方向。
-
参考文献
-
[1] D’ANGELO B，BENEDETTI E，CIMINI A，et al.Mic⁃ mRNAs：a puzzling tool in cancer diagnoslics and therapy ［J］.Anticancer Res，2016，36（11）：5571-5575
-
[2] ZHANG G M，GOYAL H，SONG L L.Bioinformatics anal⁃ ysis of differentially expressed miRNA ⁃ related mRNAs and their prognostic value in breast carcinoma［J］.Oncol Rep，2018，39（6）：2865-2872
-
[3] SUN Y，XIONG X，WANG X.HIF1α/miR ⁃ 199a/ADM feedback loop modulates the proliferation of human der⁃ mal microvascular endothelial cells（HDMECs）under hy⁃ poxic condition［J］.Cell Cycle，2019，18（21）：2998-3009
-
[4] QU D，YANG Y，HUANG X.miR⁃199a⁃5p promotes pro⁃ liferation and metastasis and epithelial⁃mesenchymal tran⁃ sition through targeting PIAS3 in cervical carcinoma［J］.J Cell Biochem，2019，120（8）：13562-13572
-
[5] 王世先，张遵俊，杨水法，等.人肾癌细胞株miRNA表达差异临床意义研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2018，25（3）：175-179
-
[6] 林其玲，陈畅.lncRNA LUCAT1 通过靶向调控 miR⁃ 199a⁃5p/HIF⁃1α促进肾透明细胞癌786⁃O细胞的增殖和迁移［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2020，150（3）：67-75
-
[7] 李德全，黄晓元，杨兴华.离体人皮肤成纤维细胞热损伤后转归的形态学观察［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12（11）：2056-2060
-
[8] 李国梁，潘志坚，柴立新，等.微小RNA⁃451对巨噬细胞移动抑制因子的调控及对结肠癌细胞增殖与迁移的影响［J］.中华实验外科杂志，2019，36（11）：2026-2028
-
[9] 王志勇，王西樵，刘英开，等.大鼠深Ⅱ度灼伤后皮肤力学性质改变及变性真皮再利用的初步观察［J］.上海交通大学学报（医学版），2019，39（11）：1239-1242
-
[10] 周洋.miR⁃199a⁃5p在慢性缺氧心肌内质网应激中的作用及机制研究［D］.重庆：第三军医大学，2016
-
[11] WEI D，WANG W，SHEN B，et al.MicroRNA199a5p sup⁃ presses migration and invasion in oral squamous cell car⁃ cinoma through inhibiting the EMTrelated transcription factor SOX4［J］.Int J Mol Med，2019，44（1）：185-195
-
[12] QU D，YANG Y，HUANG X.miR⁃199a⁃5p promotes pro⁃ liferation and metastasis and epithelial⁃mesenchymal tran⁃ sition through targeting PIAS3 in cervical carcinoma［J］.J Cell Biochem，2019，120（8）：13562-13572
-
[13] 马寅芙，李首庆，米旭光，等.miR⁃126和miR⁃199对乳腺癌细胞周期进程的影响［J］.中国实验诊断学，2017，21（10）：1828-1830
-
[14] 熊亮，王立夫，胡寅，等.大鼠烧伤和热压伤自身修复过程中miRNA199a5p的表达变化［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2019，39（11）：1575-1577
-
摘要
目的：观察热损伤人皮肤成纤维细胞中miRNA⁃199a⁃5p表达量的变化，以及对皮肤成纤维细胞增殖、迁移、侵袭功能的影响。方法：分别用人皮肤成纤维细胞株（HSF）隔水52 ℃水浴30 s、60 s制造细胞热损伤模型，对比观察细胞热损伤状态；用四甲基偶氮唑盐（MTT）检测热损伤24 h、48 h后细胞的增殖率；用qRT⁃PCR检测热损伤24 h、48 h后细胞miRNA⁃199a⁃5p 表达量的变化情况；用划痕和Transwell测试细胞的迁移、侵袭功能；用模拟物提高热损伤细胞中miRNA⁃199a⁃5p的表达量，检测热损伤细胞的增殖和侵袭情况。结果：52 ℃ 30 s可以很好地制造人皮肤成纤维热损伤模型；与对照组比较，热损伤后miR⁃ NA ⁃199a ⁃5p 表达量下调［24 h，（2.67±0.35）%，P＜0.001；48 h，（18.42±0.44）%，P＜0.001］，细胞增殖显著受到抑制［24 h， （17.10±3.21）%，P＜0.002；48 h，（25.93±1.74）%，P＜0.001］，细胞的迁移功能显著下降［（35.35±7.07）%，P＜0.001］，侵袭功能亦被显著抑制［（57.14±9.52）%，P＜0.007］。通过模拟物提高热损伤细胞中miRNA⁃199a⁃5p的表达量后，细胞的增殖显著上调 ［（136.55±6.14）%，P＜0.003］，细胞的侵袭能力增强［（196.88±15.63）%，P＜0.003］。结论：热损伤人皮肤成纤维细胞中miRNA⁃ 199a⁃5p的表达量与细胞增殖、迁移和侵袭正相关，提高热损伤细胞中miRNA⁃199a⁃5p的表达量可以帮助热损伤细胞快速转归。
Abstract
Objective：This study aims to observe the changes of miRNA⁃199a⁃5p expression in human skin fibroblasts with thermal injury and its effects on the proliferation，migration and invasion of skin fibroblasts. Methods：Cell models of thermal injury were established using human skin fibroblast cell line by bathing in water at 52℃ for 30 s and 60 s，respectively，and the thermal injury of cells was observed and compared. The proliferation rate of cells 24 h and 48 h after thermal injury was detected by MTT assay. The changes of miRNA⁃199a⁃5p expression in the cells 24 and 48 h after thermal injury were determined through qRT⁃PCR. Cell migration and invasion were detected using wound⁃healing assay and Transwell assay. The expression of miRNA⁃199a⁃5p in thermally injured cells was increased using mimics，and the proliferation and invasion of thermally injured cells were detected. Results：Bathing in water at 52 ℃ for 30 s could successfully establish a thermal injury model in human skin fibroblasts. After thermal injury，miRNA⁃ 199a⁃5p expression was down ⁃ regulated［24 h，（2.67±0.35）%，P＜0.001；48 h，（18.42±0.44）%，P＜0.001］，cell proliferation was significantly inhibited［24 h，（17.10±3.21）%，P＜0.002；48 h，（25.93±1.74）%，P＜0.001］，cell migration decreased significantly ［（35.35±7.07）%，P＜0.001］，and cell invasion was also significantly inhibited［（57.14±9.52）%，P＜0.007］. After enhancing miRNA⁃ 199a⁃5p expression in the thermally injured cells using mimics，the proliferation of the cells increased significantly［（136.55±6.14）%，P＜0.003］，and the invasion ability of the cells was enhanced［（136.55±6.14）%，P＜0.003］. Conclusion：The expression level of miRNA⁃199a⁃5p in human skin fibroblasts with thermal injury is positively correlated with cell proliferation，migration and invasion. Increasing the expression level of miRNA⁃199a⁃5p in thermally injured cells can help it rapid return.