脓毒血症是一种由病原菌、创伤、外科感染等因素引起的全身性炎症反应综合征（systemic in⁃ flammative reaction syndrome，SIRS），其特点是对感染性损伤的全身炎症反应。这一过程往往导致广泛的组织损伤和多器官功能障碍，而急性肝损伤 （acute liver injury，ALI）是其最常见的并发症^[1-2]。既往研究表明，内毒素脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是引起急性肝损伤的主要因素^[3]，LPS可以显著上调炎性细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor α，TNF⁃α）和白细胞介素⁃1β （interleukin⁃1β，IL⁃1β），而这些细胞因子会引起严重的肝组织损伤^[4-5]。此外，氧化应激也被认为在ALI的发生发展中起到重要作用^[6]。肝脏中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的过量产生会破坏细胞的结构和功能完整性，导致广泛的肝细胞破坏^[7]。到目前为止，仍旧缺乏治疗ALI的有效手段。因此，阐明ALI的病理机制，是亟待解决的问题。

活性维生素D3（vitamin D3，Vit D3）是一种脂溶性维生素，1，25（OH）₂ D3是其活性形式^[8-9]。研究表明，Vit D3的缺乏与脓毒症的病死率和机械性通气的持续时间显著相关^[10-11]。既往研究发现1，25（OH）2D3的生物学效应主要是由维生素D受体（vitamin D re⁃ ceptor，VDR）介导，VDR在许多细胞中表达，包括巨噬细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等； 而Vit D3通过VDR调控细胞增殖、抗炎、抗氧化等信号通路^[12]。大量研究证实Vit D3对ALI具有治疗作用，而其潜在机制尚不清楚^[13-14]。

因此，本研究旨在阐明Vit D3对LPS诱导小鼠ALI的保护机制，为临床治疗ALI提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

Vit D3（罗盖全J20150011，罗氏公司，美国）， LPS（L2630，Sigma公司，美国）。抗血红素加氧酶⁃1 （heme oxygenase ⁃1，HO ⁃1）抗体（BM4010）、核因子E2相关因子2（nuclear factor⁃erythroid 2p45⁃related factor 2，Nrf2）抗体（PB9290）、抗VDR抗体（BA2877⁃ 2）、抗TNF⁃α抗体（A00002⁃5）（武汉博士德生物公司）；抗NF ⁃ κB p65抗体（8242）、抗IL ⁃ 1β 抗体 （12703）、抗Lamin A/C抗体（4777）、抗鼠二抗 （7076）、抗兔二抗（7074）（Cell Signaling Technology公司，美国）；抗NF⁃κB p50抗体（ab131546，Abcam公司，美国）。TNF⁃α ELISA试剂盒（EK0525，武汉博士德生物），IL⁃1β ELISA试剂盒（ab100705，Ab⁃ cam公司，美国）。丙二醛测定试剂盒（malondialde⁃ hyde，MDA，A003⁃1⁃2）、超氧化物歧化酶测定试剂盒 （superoxide dismutase，SOD，A001⁃3⁃2）、谷胱甘肽S转移酶试剂盒（glutathione S transferase，GST，A004⁃1 ⁃ 1）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR， A062⁃1⁃1）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxi⁃ dase，GPX，A005⁃1⁃2）、过氧化氢酶（catalase，CAT， A007⁃1⁃1）（南京建成生物工程研究所）。光学显微镜（Olympus BX41）及透射电镜（TEM，HT7700） （Olympus公司，日本）。

6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重20~25g（合格证号：201716345，常州卡文斯实验动物有限公司）。动物饲养于东南大学医学院实验动物中心动物房，温度22~24℃，湿度为40%~70%，光照明暗各12h，换气次数为10~20次/h。饲料为鼠灭菌饲料，购自东南大学医学院实验动物中心，符合GB ⁃ 15921.2⁃2014标准。饮水为经121℃、30min灭菌自来水，由动物经饮水瓶自由摄取。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分组

预先配制LPS浓度为1.0mg/mL。将40只雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为对照组、Vit D3组、模型组（LPS组）和治疗组（LPS+ Vit D3组），每组10只。小鼠给予15mg/kg LPS腹腔注射建立脓毒血症小鼠ALI模型。造模即刻、造模后8h、16h，Vit D3组和LPS+ Vit D3组再给予2.5 μg/kg Vit D3灌胃，对照组和LPS组则给予等体积生理盐水灌胃^[15]。

1.2.2 标本收集

造模后24h处死小鼠。小鼠采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉。仰位固定，用一次性注射器（2mL） 心尖取血，室温下3 000r/min离心10min后取上清液送医院检验科检测肝肾功能，包括丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine， Scr）水平。开腹取肝，约2/3肝固定于4%甲醛溶液中做肝脏病理光镜及免疫组化检查，1/3肝组织置于-80℃冰箱保存备用，另取小块肝组织置于2.5%戊二醛溶液中固定，备电镜检查。

1.2.3 肝脏病理检查

4%甲醛固定的部分肝组织，经清洗、梯度酒精脱水、浸蜡、包埋等步骤后，制成石蜡块；再用切片机切出厚度为4 μm切片，摊片、烤片，后按常规操作行HE染色。光镜下观察肝组织损伤程度和炎症反应。

1.2.4 肝脏电镜检查

小鼠肝脏分离，用生理盐水清洗，切成小块 （1mm³），立即固定在含2.5%戊二醛溶液中，后固定在1%锇酸溶液中。然后，在梯度酒精中连续脱水。用丙酮代替乙醇后，将组织嵌入环氧树脂中并切成超薄切片。切片用醋酸铀和柠檬酸铅双染色，电镜观察。

1.2.5 MDA水平及SOD、GST、GR、GPX、CAT活性检测。

将肝组织于冷生理盐水中匀浆，按照厂家提供的实验步骤采用比色法测定MDA水平和SOD、 GST、GR、GPX、CAT活性。

1.2.6 ELISA法检测小鼠血清TNF⁃α、IL⁃1β含量

按照厂家提供的步骤采用ELISA法测定血清TNF⁃α、IL⁃1β水平。

1.2.7 免疫组化检测相关蛋白表达

将肝组织石蜡切片经常规脱蜡和复水处理后，用微波法进行抗原修复。以3%过氧化氢甲醇溶液处理切片灭活内源性过氧化物酶后，以10%胎牛血清封阻30min；分别加入各种一抗，TNF⁃α抗体（1∶ 100）及IL⁃1β抗体（1∶100），孵育过夜；PBS冲洗3次，每次3min，后加入二抗，孵育15min；PBS冲洗3次，每次3min，加入DAB显色；PBS冲洗后，以苏木素复染，自然风干后封片观察。

1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达

取适量的肝组织，冰上匀浆，使用蛋白提取试剂盒提取蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。每孔上样100 μg蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗孵育，4℃过夜，次日室温孵育HRP标记的二抗1h。化学发光法显示结果，压片曝光，显影定影，采用凝胶成像分析系统拍照，Bio⁃Rad Quantity one version 4.6.7软件对相应条带进行灰度分析。

1.2.9 实时荧光定量PCR检测VDR mRNA的水平

取适量的肝组织加入TRIzol匀浆提取总mRNA，核酸分析仪检测样本中mRNA的质量；对检测合格的样本进行逆转录；按实时荧光定量试剂盒说明书依次添加试剂后进行扩增，条件为95℃ 30s； 95℃ 5s，61℃ 31s，循环40次；95℃ 15s，60℃ 60s， 95℃ 15s。使用2^-ΔΔCt 法分析所得数据。小鼠VDR引物序列，上游5′⁃CACAAGACCTACGACC⁃CCAC⁃ 3′，下游5′⁃CATCATGTCCAGTGAGGGGG⁃3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，实验结果采用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，采用单因素方差分析，多个样本之间的两两比较采用Dunnett’s t 检验， P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vit D3显著改善肝脏损伤

Vit D3处理显著改善小鼠的生存率（图1A）。与对照组相比，LPS组血清ALT和AST的水平显著增加（P< 0.01，图1B、C）。而Vit D3处理后，这一改变得到逆转。HE染色被用来评估肝损伤程度。对照组和Vit D3组肝组织结构完整清晰，而LPS组的肝组织结构混乱，炎细胞浸润显著增多，而这些变化被Vit D3所抑制（图1D）。Vit D3处理后小鼠的肾功能也得到保护（表1）。

2.2 Vit D3通过Nrf2/HO⁃1通路改善肝细胞氧化损伤

镜下可以观察到对照组、Vit D3组肝细胞中正常的线粒体形态，而LPS组线粒体肿胀明显，甚至可以观察到线粒体空泡变性，线粒体嵴消失，Vit D3治疗显著抑制了这些变化（图2A）。进一步对MDA和抗氧化酶活性的检测发现，与对照组和Vit D3组相比，LPS组MDA水平显著增加（P< 0.01），SOD、GST、 GR、GPX和CAT的活性显著下降（P< 0.01），而这一LPS诱导的氧化损伤被Vit D3所逆转（P< 0.01，图2B~G）。Nrf2/HO⁃1通路在氧化损伤中起到重要作用，进一步研究发现，与LPS组相比，LPS+Vit D3组Nrf2和HO⁃1的表达显著增加（P< 0.01，图2H~J）。

2.3 Vit D3处理减少炎症损伤

炎性细胞因子，如TNF⁃α、IL⁃1β在LPS诱导的ALI起到关键作用。与LPS组相比，血清TNF⁃α和IL⁃ 1β的水平在Vit D3处理后显著下调（P< 0.01，图3A、B），而肝组织中TNF⁃α和IL⁃1β的蛋白水平与血清中一致（图3C~F）。结果显示，在LPS处理后，肝组织中NF⁃κB p65和p50显著升高（P< 0.01），而Vit D3处理逆转了这一改变（P< 0.01，图3G~I）。

2.4 Vit D3治疗对肝脏核VDR水平的影响

如前文所述，Vit D3主要通过VDR发挥作用，因此进一步探究了VDR的表达水平。与对照组相比，LPS组VDR表达显著减少（P< 0.01），Vit D3处理后，VDR表达水平上调（P< 0.01，图4）。

3 讨论

ALI是一种病死率高、危及生命的临床综合征^[1]。Vit D3具有多种药理作用，例如抗氧化、抗炎等^[16]。本研究揭示了Vit D3对LPS诱导的ALI具有保护作用，Vit D3处理可以显著改善LPS诱导的肝损伤，减少氧化应激，降低炎症水平。这些发现表明Vit D3是一种有吸引力的治疗ALI的药物。

LPS是革兰阴性细菌所分泌内毒素的主要成分，可通过刺激包括巨噬细胞在内的免疫细胞释放炎症因子，从而使肝细胞发生凋亡与坏死，LPS诱导的ALI动物模型被广泛使用，用于探讨和评价肝保护剂的疗效^[17-18]。本研究中LPS注射导致小鼠血清ALT和AST水平升高，肝脏发生病理改变，提示LPS引起了肝脏损伤。与此同时，Vit D3处理显著降低了血清AST和ALT水平，缓解了系统炎症水平，抑制了肝脏氧化损伤和炎症。同时本研究发现，Vit D3处理后，Scr和BUN水平显著下降，这与之前的研究一致，说明了Vit D3对LPS诱导的急性肾损伤具有显著的保护作用^[15]。这些结果表明，Vit D3的保护机制可能并非是器官特异性的，而是涉及不同器官间广泛存在的抗损伤通路。

肝损伤的发生与炎症细胞因子的产生密切相关，既往研究表明，LPS诱导的肝损伤涉及炎症反应^[19]。 LPS激活炎症细胞，如Kupffer细胞等，释放过量的促炎细胞因子，如TNF⁃α 和IL⁃1β，而这些促炎细胞因子的释放是触发炎症反应的关键步骤^[20-21]。因此，本研究测定了血清和肝脏组织中TNF⁃α 和IL⁃ 1β 的水平，结果显示Vit D3明显抑制LPS诱导的TNF⁃α 和IL⁃1β上调。

NF⁃κB广泛参与了炎症反应，一旦被LPS激活， IκB磷酸化和降解，释放NF ⁃κB进入细胞核调节TNF⁃α等炎性细胞因子的表达。最近的一项研究证实，NF⁃κB通路在LPS诱导ALI中起到重要作用^[15]。因此，我们研究了Vit D3对NF⁃κB激活的影响。结果表明，服用Vit D3显著抑制了NF⁃κB p65和p50蛋白的表达，从而提示Vit D3对ALI的炎症抑制可能是通过抑制NF⁃κB通路实现的。

氧化应激引起的ROS产生和线粒体功能障碍是LPS诱导ALI的另一可能机制^[22]。氧化应激被认为在ALI的发展过程中发挥了重要的病理生理作用^[23]。既往研究证实，Nrf2在诱导抗氧化酶如SOD、GST、GR、GPX、CAT对抗氧化应激中发挥重要作用，同样的，HO⁃1的表达受转录因子Nrf2控制，近期研究表明Nrf2信号通路在LPS诱导的ALI中发挥保护作用^[24-25]。本研究结果显示，Vit D3增加了Nrf2和HO⁃1的表达，降低了肝组织MDA水平，提高了SOD、GST、GR、CAT和GPX等酶的活性，减轻了LPS诱导的肝脏线粒体损伤。

本研究结果揭示了，在LPS诱导的ALI模型中， Vit D3具有抗氧化和抗炎作用，然而其潜在机制尚不清楚。众所周知，Vit D3的效用主要由VDR介导^[10]，而研究表明，VDR在炎症和氧化应激调控中发挥重要作用。据此我们推测，在LPS诱导的ALI中，Vit D3的保护作用主要是由VDR介导的。本研究结果提示，与对照组相比，LPS组肝组织中VDR的蛋白表达显著下降，Vit D3处理后，VDR表达明显上调。因此，本研究初步证实了使用Vit D3是治疗ALI行之有效的办法，并且从炎症和氧化应激两个方面初步解析了其作用机制。

综上所述，Vit D3能显著抑制血清中ALT和AST的水平，并能显著抑制组织病理学改变，此外， Vit D3可以抑制氧化应激和炎症，而这一效果可能由VDR通路介导。这些结果都表明，Vit D3可能成为治疗急性脓毒血症肝损伤的候选药物。

参考文献