急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指机体在受到各种病理刺激（如创伤、感染、缺氧、休克等）后发生的肺部急性炎症反应，主要病理变化为急性弥散性肺泡上皮细胞损伤及肺泡毛细血管内皮细胞损伤，临床上表现为进行性的呼吸窘迫和难治性的低氧血症，是新生儿临床常见的危急重症^[1]。据统计，新生儿ARDS占所有需要机械通气新生儿的1%~2%，病死率为50%~60%，是导致新生儿死亡的重要原因之一^[2-4]。然而，目前对于新生儿ARDS的诊断仍然依靠临床指标的综合诊断，尚未找到特异性的标志物。因此，寻求一种有效、准确的生物学标志物以提高对新生儿ARDS的诊断效能尤为重要。

作为一类新型的基因调控分子，微小核糖核酸 （miRNA）可通过影响靶基因的表达而调控炎症通路和免疫反应，在ARDS发病过程中起重要作用^[5]。现有的研究对新生儿ARDS发生发展机制仅仅在基因水平进行了初步揭示^[6]。通过检索miRNA与新生儿ARDS关系发现，该类研究仍较少^[7]，miRNA是否参与了新生儿ARDS发展过程中的炎性调控也少见报道，以该类miRNA作为干预靶标从而防治新生儿ARDS的效果并不理想。本研究通过筛选与新生儿ARDS有关的差异表达miRNA，获得可能的靶基因miR⁃6833⁃3p，并进一步进行验证，初步探究miR⁃ 6833⁃3p在新生儿ARDS发病中的作用机制，通过检测新生儿ARDS血清miR⁃6833⁃3p的表达水平，分析其对新生儿ARDS的诊断效能。

1 对象和方法

1.1 对象

选取南京医科大学附属儿童医院2019年1月— 2020年1月新生儿重症监护病房收治的25例ARDS患儿为ARDS组，同期选取32例在本院的普通新生儿（无严重疾病、无需氧疗的新生儿）为对照组。入选标准：①符合《新生儿急性呼吸窘迫综合征蒙特勒标准（2017年版）》诊断标准^[8]；②经影像学检查 （X线胸片显示双肺弥漫性阴影伴肺水肿改变，超声心动图检查无左心房高压表现），并结合临床症状及体征确诊；③急性起病，机械通气时间≥72h，胎龄＞34周。排除标准：①肺外严重感染；②原发性肺泡表面活性物质缺乏、先天性心脏病及先天性代谢紊乱；③肺和胸壁的畸形及其他严重的先天畸形。本研究经医院伦理委员会审核通过，并与患儿家属签署知情同意书。

急性生理与慢性健康（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）评分中的急性生理评分（acute physiology score，APS），包含生命体征、血常规、血气分析等共12项常用指标，指标正常为0分，如各项指标偏离正常值，根据其偏离程度记录1~4分，总分相加以反映ARDS患儿的疾病严重程度。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取

所有患儿均于确诊次日采集空腹静脉血3mL，置于未加抗凝剂的离心管中，2h内3 500g离心5min，进行血清分离，DEPC处理后于-80℃低温冰箱保存备用。选取上述血清解冻并加入RNA提取液TRIzol（Ambion公司，美国），室温下孵化10min后加入200 μL氯仿，在振荡器上（14 000 g 离心15min） 进行充分混匀。随后将上清转至新的试管中并加入500 μL异丙醇进行RNA提取，通过再次离心及加入75%的乙醇洗涤，分光光度仪对总RNA进行识别，处理后于-80℃低温冰箱保存备用。

1.2.2 miRNA的分离及提取

每100 μg的总RNA加入5倍体积的细胞溶解缓冲液，随后加入1/10体积的匀浆液添加剂及1/3体积的100%乙醇，在冰上充分混匀过滤并以5 000r/min离心1min。随后移除上清液体加入700 μL miRNA洗涤液以15 000r/min离心1min，再次加入500 μL洗涤液以5 000r/min离心1min并重复2次，去除残液后提取50 μL置于滤器中，室温孵育2min，完毕后以10 000r/min离心1min，最后提取miRNA并于-80℃低温冰箱保存备用。

1.2.3 miRNA标记、芯片杂交及生物信息学分析

将提取好的总RNA用miRCURYHy3^TM/Hy5^TM Power Labeling Kit（Exiqon，Vedbaek公司，丹麦）进行miRNA标记。将RNA溶解于事先配制好的杂交液 （15%甲酰胺2.4 μL，0.2%SDS 3.2 μL，3×SSC 2.4 μL， 50×Denhardt 1.6 μL，DEPC 6.4 μL）中，通过升温并混匀后放置于-20℃环境下10min，随后于95℃下变性3min。将RNA加至3.0版本microRNA芯片，漂洗后于室温下离心甩干。

Axon GenePix 4000B microarray scanner（Axon Instrument公司，美国）进行扫描，扫描图像导入GenePix Pro 6.0software（Axon）对miRNA芯片扫描数据进行提取分析。miRNA数据用Median normaliza⁃ tion进行标化，miRNA信号值在所有组中≥50才被选择，重复的miRNA取平均值。数据分析采用Mann⁃Witney检验，差异表达的miRNA的选择标准：差异倍数>2或<0.5，P< 0.01。表达芯片热图用MEV software（v4.6，TIGR）进行制作。实验和后续的基因芯片数据分析由北京博奥生物有限公司辅助完成，随机取10个样本制作芯片。选取靶基因数据集（TargetScan与microrna.org两个数据库预测的靶基因交集）与候选数据集（与目标基因表达相关的差异基因）进行交集，进行基因功能和信号通路分析（GO和Pathway分析），找出可能的作用靶标。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测

提取不同组患儿血液中的RNA，合成针对miRNA和相应内参的反转录引物，使用实时荧光定量检测试剂盒（Qiagen公司，美国）进行逆转录合成cDNA从而进行实时定量PCR反应实验。其中包括2 μL dNTPs、10 × PCR缓冲液2.5 μL、Taq聚合酶2U、 Sybergreen Ⅰ终浓度0.25×、10 μmol/L上游引物1 μL、 10 μmol/L下游引物1 μL、4 μL cDNA模板以低速短暂离心。相应参数设置：95℃ 10min；95℃ 10s、 60℃ 60s，45个循环；在60℃处进行单点荧光检测收集。反应产物相对表达量使用公式2^{− ΔΔCT} 法进行分析。

1.3 统计学方法

将所有数据输入SPSS 23.0统计软件，计量资料用均数±标准差（$\stackrel{-}{x}$ ± s）表示，两样本均数的比较采用独立样本t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较则用χ² 检验。通过绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析miR⁃6833⁃3p在ARDS患儿中的诊断效能，并计算诊断灵敏度、特异度及准确性，曲线下面积（area under cure，AUC） 比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基本临床资料的比较

两组性别、胎龄、出生体重、母亲年龄、剖宫产等一般资料的比较，差异均无统计学意义（P 均> 0.05，表1）。

2.2 miRNA芯片测试结果

两组血清miRNA进行定量分析，共筛选出24个与新生儿ARDS相关的高表达（差异倍数为2倍以上且组内差异小）的差异基因。在24个miRNA中有14个在ARDS组血清中明显上调，10个miRNA明显下调。进一步进行差异筛选发现，这24个基因中有4个表达上调和4个表达下调均超过5倍且组内差异微小的基因，4个上调的分别是miR⁃31⁃5p、miR ⁃4754、miR⁃6833⁃3p和miR⁃192⁃3p，4个表达下调的基因分别是miR⁃362⁃3p、miR⁃11a、miR⁃7a⁃2⁃3p和miR⁃1382。

2.3 筛选基因的实时荧光定量PCR验证

为进一步避免miRNA基因之间互相杂交的缺点，使用实时荧光定量PCR对筛选的如上基因进行了验证，结果发现miR⁃6833⁃3p在ARDS组中的表达为对照组的9.23倍，差异有统计学意义（P<0.01），且8个miRNA在两组间均存在明显差异表达，其结果与miRNA芯片的初筛结果基本一致（图1）。

2.4 miR⁃6833⁃3p生物信息学分析

靶基因数据集共预测到3 485个miR⁃6833⁃3p的靶基因，与候选数据集（与miR⁃6833⁃3p表达相关的差异基因）进行交集，综合分析得出结果。miR⁃ 6833⁃3可能与PI3⁃K/Akt、MAPK、ETIF及DUSP信号通路相关（表2），其中与PI3⁃K/Akt、MAPK信号通路相关的可能性最大（P< 0.001）。

2.5 血浆中miR⁃6833⁃3p与APACHEⅡ评分的相关性及诊断效能

Pearson相关分析结果提示，ARDS患儿血浆中miR⁃6833⁃3p的浓度和APACHEⅡ评分中的APS评分呈正相关（r=0.731，P< 0.001，图2）。ROC曲线分析显示，血浆miR⁃6833⁃3p对预测ARDS患儿的AUC为0.848，其诊断最佳阈值为1.03，约登指数最大值为0.59，此时miR ⁃ 6833 ⁃ 3p的诊断灵敏度为84.55%，特异度为75.36%（图3）。

3 讨论

新生儿ARDS病死率高，是新生儿死亡的重要原因之一^[2-4]，由于缺乏特异性标志物，仅依靠临床诊断，治疗容易滞后，影响最终新生儿的结局。由于其特定的性质决定了miRNA在多种疾病发生发展过程中具有决定性的病理生理调控优势^[9-11]。既往研究通过建立ARDS细胞动物模型及成人患者血液中筛选了部分差异表达的miRNA^[12-13]，这些结果说明miRNA在ARDS疾病的发展过程中起到一定的作用，但前期该类研究未对差异表达模式及规律进行深入分析研究，且目前仍未见新生儿相关ARDS的miRNA研究。通过文献检索进一步分析miR⁃6833⁃3p的研究现状，回顾发现miR⁃6833⁃3p国内外尚未见有关文献报道，由此可见该miRNA可能是功能尚未明确的新miRNA。本研究也利用实时荧光定量PCR及相关基因芯片分析对该miRNA做了初步研究，miR⁃6833⁃3p可能是新生儿ARDS潜在的一种新的标志物。本研究显示，miR⁃6833⁃3p在新生儿ARDS中的表达水平明显升高，且其升高程度与患者疾病严重程度有一定的相关性，相应的ROC曲线也提示miR⁃6833⁃3p对预测新生儿ARDS具有一定的诊断价值。

多项研究提示miRNA可参与细胞的免疫应答和氧化应激反应，miRNA在肺组织使肺小血管渗透性增加引起肺泡水肿，最终导致肺泡上皮细胞进入程序性死亡^[14-15]，提示miRNA的异常表达可通过免疫炎性反应对ARDS的病程及进展起重要作用。本研究通过对新生儿ARDS的研究也发现类似的结果，miR⁃6833⁃3p在ARDS新生儿血液中明显升高，由于miRNA是通过细胞的主动分泌以外泌体或结合脂蛋白形式稳定存在于血液中^[16]，而血液中的miRNA可通过受体结合的胞吞方式再重新进入细胞内，从而完成该miRNA在不同细胞间的中介作用^[17-18]。由此推测外周血液中的miR⁃6833⁃3p可能间接反映出肺部组织细胞miR⁃6833⁃3p的变化。结合本研究结果中信号通路的预测，本研究中ARDS患者血中miR⁃6833⁃3p的表达明显升高，其机制可能是miR⁃6833⁃3p通过PI3⁃K/Akt机制影响新生儿ARDS的进展。PI3⁃K/Akt通路可以介导脂多糖调节肺微血管内皮细胞功能^[19]，研究证明在ARDS患者中p⁃Akt蛋白表达明显上升，该蛋白的功能表达可以促进肺血管损伤和ARDS病情进展^[20]。当血液中miRNA⁃6833⁃3p增多，可以进一步激活PI3⁃K/Akt通路，促使大量炎性因子释放，损伤肺小血管内皮细胞的屏障功能，炎性液体渗出，从而加重肺部水肿，二氧化碳潴留加重，有效气体交换受限，新生儿呼吸困难加重，同时氧自由基也随之增加，肺组织损伤进一步加重导致ARDS病情恶化^[21-22]。但miRNA ⁃6833⁃3p通过PI3⁃K/Akt机制对肺组织的调节有待后期实验进一步深入研究。

由于新生儿ARDS评分的特殊性，APACHE Ⅱ 评分中主要反映新生儿疾病严重程度的是生命体征、血常规及血气分析结果，此为APS的组成部分。本研究中的相关性分析显示血液中miR⁃6833⁃3p的含量与APACHEⅡ评分中的急性生理评分项APS呈明显正相关，此结果也与前期研究结果一致^[23-24]。从侧面也进一步提示miR⁃6833⁃3p参与了新生儿ARDS的进展过程，随着血清中升高的miR⁃6833⁃3p与编码区结合作用，靶基因相关蛋白降解或抑制转录翻译，炎性基因在血液中的表达被进一步调控，使相关炎性因子大量释放，炎性反应进一步激活新生儿肺组织的免疫应答，促进炎性反应级联瀑布效应，最终加重ARDS病情^[25]。

本研究通过绘制血清miR⁃6833⁃3p水平判断新生儿ARDS预后的ROC曲线，曲线下面积大于0.5，灵敏度及特异度均超过75%，进一步说明血液中miRNA⁃6833⁃3p的表达水平可以评估新生儿ARDS诊断及预后判断情况，该miRNA可能作为新生儿ARDS一种潜在的新的生物标志物。但由于本研究为单中心研究，病例数有限，样本量偏少，且来源较单一，尚缺乏多中心的研究结果，仍需大规模多中心大样本量进行进一步的前瞻性研究以证实miRNA ⁃ 6833⁃3p在新生儿ARDS中的临床应用价值及其与疾病严重程度和炎性因子的关系。下一步拟扩大样本量进一步研究靶基因，明确其作用的信号通路及靶点，相关研究的进一步深入将为新生儿ARDS的临床诊疗提供新的思路。

参考文献